本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超聲提取的川白芷多糖及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藥材白芷為傘形科植物白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm)benth.ethook.f.或杭白芷angelicadahurica(fisch.exhoffm)benth.ethook.f.var.formosana(boiss)shanetyuan的干燥根。白芷味辛，性溫，歸胃、大腸、肺經(jīng)。具有解表散寒，祛風(fēng)止痛，宣通鼻竅，燥濕止帶，消腫排膿的作用，用于感冒頭痛，眉棱骨痛，鼻塞流涕，鼻鼽，鼻淵，牙痛，帶下，瘡瘍腫痛。

白芷是衛(wèi)生部公布藥食兩用的87種中藥材之一，也是我國(guó)常用的大宗藥材。按產(chǎn)地分為川、杭、祁、禹白芷四大商品。其中產(chǎn)于四川的白芷則稱(chēng)川白芷，是著名的川產(chǎn)道地藥材，產(chǎn)量約占全國(guó)商品白芷的70％。川白芷以四川遂寧出產(chǎn)的形優(yōu)、質(zhì)堅(jiān)、粉多香濃、色白細(xì)膩、橫切片成“菊花芯形”的川白芷品質(zhì)最佳。白芷富含多種化學(xué)成分，現(xiàn)代研究表明，白芷的脂溶性化學(xué)成分主要為香豆素類(lèi)，含量為0.211％～1.221％，其水溶性成分有棕櫚酸、豆甾醇、β-谷甾醇、β-胡蘿卜苷(β-daucosterin)等。白芷還富含多種多糖。

多糖廣泛存在于動(dòng)、植物和微生物(真菌和細(xì)菌)中，常與蛋白質(zhì)和多聚核苷酸相連，是生命活動(dòng)中必不可少的生物大分子，在細(xì)胞吸附、細(xì)胞與細(xì)胞信息交流、免疫系統(tǒng)分子識(shí)別方面扮演著重要的作用。目前多糖已成為天然藥物及保健品研發(fā)中的重要組成部分。植物多糖具有多種生物活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血糖血脂、抗衰老、抗炎、抗轄射、免疫調(diào)節(jié)等。

與傳統(tǒng)提取方法相比，采用超聲法提取多糖處理簡(jiǎn)單安全，省時(shí)，提取效率高。但超聲波強(qiáng)烈的機(jī)械剪切作用，可能會(huì)致多糖分子結(jié)構(gòu)的改變，使其生物活性喪失。

目前對(duì)于白芷多糖的研究尚不夠深入。僅個(gè)別學(xué)者對(duì)杭白芷多糖的提取以及抗氧化和增強(qiáng)動(dòng)物皮膚組織免疫功能進(jìn)行過(guò)分析，且尚未開(kāi)展過(guò)超聲法提取的白芷多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種超聲提取的川白芷多糖。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種超聲提取的川白芷多糖的制備方法。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種超聲提取的川白芷多糖的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明所述的一種超聲提取的川白芷多糖，該川白芷多糖同時(shí)存在α構(gòu)型和β構(gòu)型多糖鏈接方式，其表觀分子量為170.07kda；所述川白芷多糖由川白芷藥材經(jīng)超聲提取、醇沉除雜、去蛋白去鹽后，再經(jīng)deae-瓊脂糖凝膠ff柱和瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱層析分離而得。

本發(fā)明所述的川白芷多糖的制備方法，具體包括以下步驟：

a：脫脂脫色素：將川白芷藥材洗凈烘干粉碎，得粉末；將所述粉末先加入石油醚脫脂后，再加入高濃度乙醇溶液脫除部分色素及低聚糖；

b：提?。簩⒚撝撋睾蟮姆勰┘铀曁崛『螅x心，收集上清液，濃縮，得濃縮液；

c：醇沉除雜：將所述濃縮液醇沉除去水溶性雜質(zhì)后得到川白芷粗多糖；

d：去蛋白：將所述川白芷粗多糖采用酶+sevag結(jié)合法去除蛋白；

e：透析去鹽：將所述去除蛋白后的川白芷粗多糖采用透析法去除使無(wú)機(jī)鹽和小分子物質(zhì)，得去鹽川白芷多糖；

f：將所述去鹽川白芷多糖進(jìn)行deae-瓊脂糖凝膠ff柱層析，收集并合并第三個(gè)洗脫峰的收集液，濃縮，透析，凍干；

g：將步驟f凍干后的川白芷多糖進(jìn)行瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱層析，收集并合并主峰的洗脫液，濃縮，透析，凍干，即得。

進(jìn)一步地，所述步驟a中，將川白芷藥材洗凈，于40-50℃烘干，粉碎，過(guò)40目篩，得川白芷粉末；取所述川白芷粉末加入石油醚加熱回流脫脂4h，過(guò)濾，濾渣于40-50℃烘干后，再加入80％乙醇加熱回流提取4h，過(guò)濾，濾渣揮干乙醇后粉碎，于40-50℃烘干，備用；所述石油醚的用量按每克川白芷粉末計(jì)為2-4ml，所述80％乙醇的用量按每克川白芷粉末計(jì)為2ml。

進(jìn)一步地，所述步驟b中加水量以每克脫脂脫色素后的粉末計(jì)為2-6ml，提取次數(shù)為1-4次，提取時(shí)間為0.5-2h。

進(jìn)一步地，所述步驟d中，向濃縮液中加入無(wú)水乙醇至混合溶液乙醇終濃度為50-70％，于0-6℃靜置12-24h，離心，取離心沉淀加水溶解后，再次離心，取再次離心后的上清液，向所述上清液加入無(wú)水乙醇至混合溶液乙醇終濃度為50-70％，于0-6℃靜置12-24h，第三次離心，取第三次離心后的沉淀，得川白芷粗多糖，備用。

進(jìn)一步地，所述步驟d中所用酶為木瓜蛋白酶，所用sevag試劑為氯仿:正丁醇＝4:1，所述去蛋白的次數(shù)為10次。

進(jìn)一步地，所述步驟e中，采用截留分子量為8000-14000da的透析袋，室溫蒸餾水透析24h后，換干凈蒸餾水再透析8h，重復(fù)2次。

進(jìn)一步地，所述步驟f中，將川白芷多糖加水溶解后，上樣于deae-瓊脂糖凝膠ff柱，先以1.5倍柱體積的蒸餾水洗脫后，再以水和2mol/l的nacl溶液混合洗脫，實(shí)現(xiàn)0～1.5mol/lnacl溶液的梯度洗脫，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，繪制苯酚-硫酸反應(yīng)曲線圖，并繪制反應(yīng)曲線，根據(jù)所述反應(yīng)曲線合并同一洗脫峰的收集液，濃縮，透析，凍干。

進(jìn)一步地，將步驟f凍干后的川白芷多糖加水溶解后，上樣于瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱，洗脫液為0.05mol/lnacl溶液，分管收集，收集液用苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖含量，繪制苯酚-硫酸反應(yīng)曲線圖，采用考馬斯亮藍(lán)g250法測(cè)定蛋白含量，并繪制反應(yīng)曲線，根據(jù)所述反應(yīng)曲線收集主峰的洗脫液，濃縮，透析，凍干。

本發(fā)明所述的川白芷多糖在制備具有美白作用的日化用品、食品、保健品或藥品中的用途。

本發(fā)明所用川白芷，其原植物為杭白芷[angelicadahurica(fisch.exhoffm.)benth.ethook.f.var.formosana(boiss.)shanetyuan]，產(chǎn)地為四川省遂寧市。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備的有益效果為：

本發(fā)明提供了一種超聲提取的川白芷多糖，該川白芷多糖具有良好的美白活性，對(duì)酪氨酸酶活性具有抑制作用，且隨著濃度的增加，酪氨酸酶抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

本發(fā)明采用超聲法提取川白芷多糖，所得川白芷多糖的分子量較大，且具有良好的美白活性，采用本發(fā)明提取方法不影響川白芷多糖的活性。經(jīng)超聲法提取的川白芷粗多糖經(jīng)醇沉、去蛋白去鹽后，再經(jīng)兩次柱層析，得到良好的純化效果，含糖量顯著提高，淀粉幾乎除盡。

本發(fā)明建立了一條完整可行的川白芷多糖提取、分離純化、理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和生物活性研究技術(shù)路線。

附圖說(shuō)明

附圖1為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的deae-瓊脂糖凝膠ff色譜柱蒸餾水洗脫曲線圖。

附圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的deae-瓊脂糖凝膠ff色譜柱nacl梯度洗脫曲線圖。

附圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的瓊脂糖凝膠6ff色譜柱洗脫曲線圖。

附圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的剛果紅反應(yīng)曲線圖。

附圖5為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的傅里葉變換紅外光譜圖。

附圖6為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的¹hnmr圖譜，

附圖7為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的為¹³cnmr圖譜。

附圖8為本發(fā)明實(shí)施例1所得的川白芷多糖的酪氨酸酶抑制活性圖。

附圖9為本發(fā)明二次過(guò)柱的川白芷多糖的酪氨酸酶抑制活性圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖說(shuō)明和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，本發(fā)明的方式包括但不僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1

川白芷多糖的制備

本實(shí)施例中超聲提取所用設(shè)備為sb25-12dtd超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

川白芷多糖的制備方法，包括以下步驟：

a：脫脂脫色

取川白芷根洗凈，45℃烘干，粉碎過(guò)40目篩。稱(chēng)取白芷粉樣，加入石油醚回流脫脂4h，45℃烘干后，再加入80％乙醇80℃回流提取4h，以除去部分色素及低聚糖，揮干乙醇后粉碎，45℃烘干備用。石油醚的用量按每克川白芷粉末計(jì)為3ml，80％乙醇的用量按每克川白芷粉末計(jì)為2ml。

b：提取

稱(chēng)取脫脂脫色素后的粉末100g，加入3倍量蒸餾水超聲提取2次，每次1h，4000r/min離心5min收集上清液，合并提取液并濃縮，得濃縮液。

c：醇沉除雜

向所述濃縮液中緩慢加入無(wú)水乙醇至混合溶液乙醇終濃度為60％，置于4℃靜置12h，離心得川白芷多糖沉淀，棄上清液。川白芷多糖沉淀用水復(fù)溶，4000r/min離心10min除雜質(zhì)，得上清液加乙醇濃度至60％，4℃靜置12h后，第三次離心，取第三次離心后的沉淀，備用；

d：去蛋白

按照l(shuí)g川白芷多糖沉淀加入200ml水的比例溶解樣品，在50℃水浴加熱并間歇性攪拌至其完全溶解，4000r/min離心5min除去雜質(zhì)，川白芷多糖溶液ph調(diào)節(jié)到6.5。木瓜蛋白酶用ph6.5的pbs配成50mg/ml的酶溶液，按照l(shuí)g川白芷多糖沉淀加20mg木瓜蛋白酶的比例加到上述的糖溶液中，然后在50℃水浴加熱3h，再在100℃下滅酶15min，冷卻至室溫，4000r/min離心10min除去變性蛋白和酶。

在經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶解后的混合溶液中加入等體積的sevag試劑(氯仿:正丁醇＝4:1)，劇烈振搖15min，5000r/min離心10min，離心后液體三分層，小心吸取上層清液并重復(fù)去蛋白10次后40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空濃縮得到去蛋白川粗多糖。

e：透析去鹽

8000-14000da透析袋處理液為0.01mol/lnahco3和lmmol/ledta的水溶液。將長(zhǎng)度為25cm左右透析袋放入處理液加熱煮沸半個(gè)h。蒸餾水清洗透析袋，置于50％乙醇中，4℃保存?zhèn)溆?。將去蛋白川粗多糖溶液適量裝于透析袋中，透析袋兩頭扎好后留出1/3的空間防止其中親水性物質(zhì)過(guò)度吸水使袋破裂。室溫下用蒸餾水透析24h后，換干凈蒸餾水再透析8h，重復(fù)2次。透析后濃縮、凍干得到川白芷粗多糖。

f：deae-瓊脂糖凝膠ff柱層析

首先，將500ml的deae-瓊脂糖凝膠ff裝入2.5×100cm的中壓層析柱中。柱子裝好后用3倍柱體積的去蒸餾水，1ml/min流速進(jìn)行平衡。

其次，將川白芷粗多糖配制成50mg/ml的水溶液樣品，所有備用洗脫液要超聲脫氣，上樣量5ml，流速lml/min，先以1.5倍柱體積的去蒸餾水洗脫，再以水和2mol/l的nacl混合洗脫，實(shí)現(xiàn)0～1.5mol/lnacl溶液的梯度洗脫，每10ml收集一管。每隔一管取樣100μl用苯酚-硫酸法(100μl樣品溶液+200μl5％苯酚溶液+1ml濃硫酸)檢測(cè)多糖含量，繪制苯酚-硫酸反應(yīng)曲線圖，并繪制反應(yīng)曲線。收集并合并第3個(gè)洗脫峰的收集液，濃縮，透析，凍干。川白芷多糖deae-瓊脂糖凝膠ff色譜柱洗脫曲線如附圖1和附圖2所示。

g：瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱層析

將步驟f凍干后的川白芷多糖過(guò)瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱進(jìn)行過(guò)濾層析，配制成30mg/ml的多糖水溶液，上樣量10ml，洗脫液為0.05mol/lnacl溶液，流速為0.5ml/min，每管收集5ml。每管取樣100μl用苯酚硫酸法檢測(cè)多糖，繪制苯酚-硫酸反應(yīng)曲線圖，采用考馬斯亮藍(lán)g250法測(cè)定蛋白含量，并繪制反應(yīng)曲線。收集主峰的洗脫液，濃縮，透析，凍干，即得。川白芷多糖初步分離組分的瓊脂糖凝膠7ff色譜柱洗脫曲線如附圖3所示。

實(shí)施例2

川白芷多糖的制備

本實(shí)施例中超聲提取所用設(shè)備為sb25-12dtd超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

川白芷多糖的制備方法，包括以下步驟：

步驟a：與實(shí)施例1的步驟a相比，烘干溫度均為50℃，石油醚的用量按每克川白芷粉末計(jì)為2ml，其余條件均相同。

步驟b：稱(chēng)取脫脂脫色素后的粉末100g，加入2倍量蒸餾水超聲提取2h，4000r/min離心5min收集上清液，合并提取液并濃縮，得濃縮液。步驟c至步驟g同實(shí)施例1，即得。

實(shí)施例3

川白芷多糖的制備

本實(shí)施例中超聲提取所用設(shè)備為sb25-12dtd超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

川白芷多糖的制備方法，包括以下步驟：

步驟a：與實(shí)施例1的步驟a相比，烘干溫度均為40℃，石油醚的用量按每克川白芷粉末計(jì)為4ml，其余條件均相同。

步驟b：稱(chēng)取脫脂脫色素后的粉末100g，加入6倍量蒸餾水超聲提取4次，每次0.5h，4000r/min離心5min收集上清液，合并提取液并濃縮，得濃縮液。步驟c至步驟g同實(shí)施例1，即得。

實(shí)施例4

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行總糖檢測(cè)，檢測(cè)方法如下：

1mg/ml葡萄糖母液的配置：葡萄糖在烘箱中100℃烘干至恒重，稱(chēng)0.1033g葡萄糖于100ml容量瓶中，加蒸餾水溶解定容，備用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取適量1mg/ml葡萄糖母液，稀釋至葡萄糖濃度為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/ml，吸取100μl葡萄糖溶液，然后加入5％苯酚200μl及1ml濃硫酸，搖勻，室溫放置20min后于490nm下測(cè)吸光度。以加入葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，490nm下吸光度為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取實(shí)施例1得到的川白芷多糖，配制1mg/ml的不同樣品溶液，取100μl檢測(cè)，做三組平行試驗(yàn)取平均值。

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，苯酚-硫酸法檢測(cè)總糖的含量，回歸方程為y＝2.6803x+0.1572，r²＝0.994。根據(jù)樣品測(cè)定的吸光度值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算白芷多糖總糖含量，得到實(shí)施例1所得的川白芷多糖中總糖的含量為46.01％。

實(shí)施例5

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行蛋白質(zhì)分析，實(shí)驗(yàn)方法如下：

考馬斯亮藍(lán)g250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)結(jié)合使之染色在595nm處有最大吸收，常用來(lái)定性和定量測(cè)定蛋白質(zhì)，該方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速適合大量樣品的測(cè)定，在0-100mg/l蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)，吸光值與蛋白質(zhì)含量呈良好的線性關(guān)系。

1mg/ml樣品的水溶液，可見(jiàn)光-紫外光分光光度計(jì)進(jìn)行400-200nm紫外掃描，以蒸餾水為空白對(duì)照。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：稱(chēng)100mg考馬斯亮藍(lán)g250溶于50ml95％乙醇，加入100ml85％磷酸，蒸餾水定容至1l，濾紙過(guò)濾備用。配制0.1mg/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，用蒸餾水補(bǔ)充至1.0ml，分別加入考馬斯亮藍(lán)g250溶液各5ml，混勻。放置2min后在595nm下測(cè)吸光度。

配制成lmg/ml的不同樣品溶液，取lml檢測(cè)，做三組平行試驗(yàn)取平均值。

以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為：y＝0.0025x+0.006，r2＝0.9907。根據(jù)樣品測(cè)定的吸光度值對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算白芷多糖蛋白質(zhì)含量，得到實(shí)施例1所得的川白芷多糖中蛋白質(zhì)含量為0.56％。由于測(cè)量存在一定誤差，該值并不能代表樣品蛋白質(zhì)含量，只能說(shuō)明樣品中不含蛋白質(zhì)或可能含有結(jié)合蛋白。

實(shí)施例6

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行糖醛酸定性分析，實(shí)驗(yàn)方法如下：

咔唑試液的制備：精密稱(chēng)取0.125g咔唑，加無(wú)水乙醇溶解定容至100ml的量瓶中，備用。

配制0.4mg/ml葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，1mg/ml的樣品溶液。

取50μl樣品溶液，加入50μl咔唑試液，冰浴加入300μl濃硫酸，觀察顏色變化。

結(jié)果表明：實(shí)施例1得到的川白芷多糖醛糖酸檢測(cè)與400μg/mld-葡萄糖醛酸顯色一致，均呈藍(lán)綠色陽(yáng)性顯色，說(shuō)明其可能含有醛糖酸，是酸性雜多糖。

實(shí)施例7

對(duì)實(shí)施例1最終得到的川白芷多糖進(jìn)行碘-碘化鉀反應(yīng)檢測(cè)，方法如下：

碘試劑為含0.02％碘的0.2％ki溶液，川白芷多糖及水提粗多糖的樣品濃度均為lmg/ml。分別取50μl各樣品溶液，加入200μl碘試劑，觀察顏色變化后用酶標(biāo)儀(thermoscientificmultiskango)進(jìn)行200—800nm掃描。

結(jié)果顯示，川白芷多糖與碘試劑反應(yīng)呈陰性，說(shuō)明通過(guò)兩次過(guò)柱分離純化后川白芷多糖中淀粉已幾乎除盡。

將川白芷多糖樣品溶液與碘試劑(含0.02％碘的0.2％ki溶液)混勻，測(cè)定300-700nm范圍內(nèi)的吸收光譜，最大吸收峰在351nm附近，而565nm附近并沒(méi)有最大吸收，說(shuō)明川白芷多糖可能存在較長(zhǎng)的側(cè)鏈和較多的分支。

實(shí)施例8

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行剛果紅試驗(yàn)，具體實(shí)施方法如下：

配置1mg/ml川白芷多糖溶液，80μmol/l剛果紅溶液，1mol/l的naoh溶液。

吸取0.5ml川白芷多糖溶液，加入80μmol/l剛果紅溶液0.5ml，混勻。然后加入適量1mol/l的naoh溶液，使反應(yīng)溶液中naoh的終濃度分別為0.0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l和0.4mol/l混勻室溫靜置后，200-800nm區(qū)間進(jìn)行光譜掃描，測(cè)量不同濃度下溶液的最大吸收波長(zhǎng)。另取空白對(duì)照，即不加川白芷多糖樣品，以相同方法測(cè)量不同濃度下溶液的最大吸收波長(zhǎng)。

比較樣品溶液與空白對(duì)照溶液的最大吸收波長(zhǎng)變化情況。

結(jié)果如附圖4所示，隨著naoh濃度從低到高，川白芷多糖最大吸收波長(zhǎng)變化情況與空白對(duì)照溶液變化趨勢(shì)基本相同，說(shuō)明其可能不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例9

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行多糖分子量分析，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(hplc-elsd)對(duì)川白芷多糖分子量進(jìn)行測(cè)定。hplc色譜條件如下：色譜柱：tsk-gelg5000pwxl凝膠柱(7.8mm×30cm)；流動(dòng)相：水；流速：0.5ml/min；進(jìn)樣量：20μl；檢測(cè)器：alltech2000型elsd檢測(cè)器，漂移管溫度：115℃，氣體流量：3.2(slpm)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：取平均分子量分別為t10、t40、t70、、t500、t2000道爾頓的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖對(duì)照品，以水溶解，配制為2mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液。照上述hplc色譜條件檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的保留時(shí)間和分子量分別取自然對(duì)數(shù)繪制。

用高純水將多糖樣品制成2mg/ml的溶液，在相同色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄保留時(shí)間，帶入回歸方程算得平均分子量。

標(biāo)準(zhǔn)多糖參照品：blue2000(mw：2000kda)，t-700(mw：700kda)，t-500(mw：500kda)，t-70(mw：70kda)t-40(mw：40kda)，t-10(mw：10kda)經(jīng)hplc‐elsd分析后。以保留時(shí)間對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，得到回歸方程y＝-1.99x+21.104，r²＝0.9991。由回歸方程可以計(jì)算得到川白芷多糖的表觀分子質(zhì)量。

結(jié)果表明，川白芷多糖的表觀分子質(zhì)量為170.07kda。

實(shí)施例10

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行紅外光譜和核磁共振分析

將干燥的川白芷多糖樣品3.0mg與干燥的kbr在瑪瑙研缽中研磨均勻后壓片，在4000-400cm-1，范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。取20mg川白芷多糖溶于0.5ml重水中，核磁共振儀進(jìn)行600mhznmr分析。

如附圖5紅外光譜圖顯示，1022.20cm^-1、1085.85cm^-1、1095.49cm^-1三處有吸收峰，表明川白芷多糖的糖環(huán)結(jié)構(gòu)為呋喃糖型。在846.692cm^-1處有吸收峰說(shuō)明其存在α構(gòu)型的多糖鏈接方式。在891±7cm^-1的吸收峰說(shuō)明存在β構(gòu)型多糖鏈接方式。

在1647.095cm-1附近的吸收峰表明在川白芷多糖各組分中存在乙酰氨基(-nhcoch3)的c＝o鍵伸縮振動(dòng)，說(shuō)明川白芷多糖可能是一種氨基多糖。在1733.886cm-1和1261.359cm-1為?；騩-乙?；?o-ac)的特征吸收峰。

綜上，川白芷多糖為同時(shí)存在α構(gòu)型和β構(gòu)型多糖鏈接方式，具有?；騩-乙酰基(o-ac)的一種呋喃糖型氨基多糖片段。

川白芷多糖的¹hnmr如附圖6所示，¹³cnmr如圖7所示。β型異頭質(zhì)子區(qū)域化學(xué)位移為δ4.4-5.0ppm，而α型異頭質(zhì)子區(qū)域化學(xué)位移為δ5.0-5.5ppm。在¹hnmr信號(hào)指紋區(qū)δ4.4-5.5ppm，有信號(hào)δ4.43、δ4.91、δ5.04、δ5.06、δ5.10、δ5.19和δ5.34ppm，可見(jiàn)川白芷多糖有至少7種單糖殘基。h信號(hào)δ4.43、δ4.91表示多糖為存在β構(gòu)型鏈接糖殘基，而h信號(hào)δ5.04-5.34表明川白芷多糖也存在α構(gòu)型鏈接糖殘基。在¹³cnmr中，在δ90-112ppm區(qū)域，有δ107.47、103.73、103.43、102.66、99.80ppm，其中δ107.47、103.73、103.43ppm表示存在以β構(gòu)型鏈接的糖殘基，而其他共振信號(hào)表示川白芷多糖存在α構(gòu)型鏈接糖殘基，這與¹hnmr分析結(jié)果一致。在¹hnmr，δ4.68ppm的共振峰為doh吸收峰，而在δ3.5-4.4ppm之間的信號(hào)主要是由于糖殘基上c2-c6上的h信號(hào)位移峰，在δ3.3-3.5ppm之間，有h信號(hào)，表示存在meo，在δ2.1ppm附件的共振峰測(cè)表示存在n-ac。在¹³cnmr中，在δ170-180ppm之間有共振峰，表示存在糖醛酸，δ70-75ppm的共振區(qū)為未發(fā)生取代多糖部位(c2、c3、c4)的碳信號(hào)，而在δ76-85ppm的c信號(hào)表示c2、c3、c4上發(fā)生取代，而在δ67ppm附近有c信號(hào)，表示c6位也發(fā)生了取代，在δ60ppm附近的c信號(hào)表示存在meo基團(tuán)，在δ52.90ppm為n取代上c的信號(hào)。

綜上，川白芷多糖可能為多種糖殘基組成并且同時(shí)存在α構(gòu)型和β構(gòu)型鏈接糖殘基的酸性雜多糖，還有meo、n-ac(n-乙酰基)、糖醛酸等基團(tuán)，在c2、c3、c4、c6均可能存在取代。

實(shí)施例11

對(duì)實(shí)施例1得到的川白芷多糖進(jìn)行美白活性分析，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法，以酪氨酸酶抑制率為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體操作如下。

試劑配制

(1)pbs緩沖液配制

0.2mol/l的nah2po4：稱(chēng)取nah2po4·h2o3.12g加蒸餾水定容至100ml溶解。

0.2mol/l的na2hpo4：稱(chēng)取na2hpo4·2h2o3.56g加蒸餾水定容至100ml溶解。

0.1mol/l的pbs，49ml0.2mol/l的na2hpo4，51ml0.2mol/l的na2hpo4，加100ml蒸餾水稀釋。

(2)多巴配制

取0.075g左旋多巴，用pbs緩沖液定容到100ml容量瓶。

(3)酪氨酸酶配制

取0.5mg的酪氨酸酶，用pbs緩沖液溶解，定容值2ml。酶活力單位在250u/ml左右。

(4)樣品處理

將待測(cè)樣品配置成1mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml，0.125mg/ml，0.0625mg/ml，0.03125mg/ml、0.01625mg/ml，相應(yīng)濃度曲酸做陽(yáng)性對(duì)照，反應(yīng)體系如下表。

酪氨酸酶抑制反應(yīng)體系表

按照順序加入多巴、pbs、多糖/曲酸，加入酶液后迅速放入37℃的酶標(biāo)儀孵育5min測(cè)值，每個(gè)樣品做三個(gè)重復(fù)。

a：處理組樣品在475nm處的吸光度；

a0：空白組樣品在475nm處的吸光度；

b：對(duì)照組樣品在475nm處的吸光度；

b0：總空白組樣品在475nm處的吸光度。

如附圖8所示，結(jié)果表明，本發(fā)明川白芷多糖對(duì)酪氨酸酶活性具有明顯的抑制作用，美白作用確切；且隨著濃度的增加，酪氨酸酶抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

實(shí)施例12

將實(shí)施例1得到的川白芷多糖再次過(guò)瓊脂糖凝膠6ff凝膠柱，實(shí)驗(yàn)操作及條件同實(shí)施例1中的步驟g，得到二次過(guò)柱后的川白芷多糖。

將此二次過(guò)柱后的川白芷多糖進(jìn)行美白活性分析，具體實(shí)驗(yàn)方法同實(shí)施例11。

結(jié)果如附圖9所示，二次過(guò)柱后的川白芷多糖的美白作用明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出幾乎與對(duì)照曲酸相當(dāng)?shù)拿腊鬃饔?；且隨著濃度的增加，酪氨酸酶抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

上述實(shí)施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式之一，不應(yīng)當(dāng)用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，但凡在本發(fā)明的主體設(shè)計(jì)思想和精神上作出的毫無(wú)實(shí)質(zhì)意義的改動(dòng)或潤(rùn)色，其所解決的技術(shù)問(wèn)題仍然與本發(fā)明一致的，均應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。