本發(fā)明屬于園藝作物產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種芒果加工副產(chǎn)物多糖脫蛋白和脫色方法。

背景技術(shù)：

芒果，又名蜜望、檬果，是一種熱帶漆樹科常綠喬木，在我國熱帶亞熱帶地區(qū)廣泛種植，因其果肉細膩、營養(yǎng)豐富、風味獨特而深受大眾喜愛，具有益胃、解渴、潤膚、止嘔的功效。每年在芒果生產(chǎn)加工過程中約產(chǎn)生數(shù)百萬噸皮渣，常被當作垃圾堆積處理，嚴重污染環(huán)境。

多糖是芒果皮渣中的主要活性成分之一，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂等功效。近年來，芒果皮渣中多糖的提取已受到許多研究者的廣泛關(guān)注。李金花等（2012）采用水提醇沉法從芒果葉中提取粗多糖，測得其含量為1.51%；王維民等（2005）以紅芒果皮渣為原料，在料液比1:5g/ml，溫度90℃，時間2h的條件下提取多糖，提取率可達3.538%。目前，本實驗室已從芒果皮渣中分離出粗多糖，但制得的多糖蛋白質(zhì)含量較高，顏色較深（呈褐色），這不但影響多糖作為食品添加劑或功能性食品基料的外觀，而且對后續(xù)多糖的純化產(chǎn)生很大影響，所以脫去與活性多糖相結(jié)合的蛋白質(zhì)分子和色素成分迫在眉睫。為了在芒果粗多糖的處理過程中獲得更多具有高活性的多糖，研究一種能在高效脫除蛋白質(zhì)和色素時保留較高多糖有效成分的脫蛋白和脫色方法是十分必要的。

多糖的脫蛋白方法常用的有sevage法、三氯乙酸（tca）法、tca-正丁醇法、酶法、鹽酸法、樹脂法等，往往因多糖來源不同而有差異；脫色方法主要有活性炭法、殼聚糖法、h2o2法、聚酰胺法、大孔吸附樹脂法等，活性炭由于具有較高的吸附能力，脫色成本低且不易影響待脫色物質(zhì)的生物活性而在工業(yè)化生產(chǎn)中得到了廣泛應用。但在此之前，幾乎沒有關(guān)于芒果多糖的脫蛋白和脫色工藝優(yōu)化研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的在于提供一種芒果加工副產(chǎn)物多糖的脫蛋白和脫色方法，本發(fā)明是通過將芒果皮渣經(jīng)預處理后制得芒果皮渣勻漿，采用超聲波輔助纖維素酶法提取粗多糖，并進行粗多糖的脫蛋白及脫色，獲得芒果多糖半純品，本發(fā)明方法簡單、快速，具有較高的脫蛋白率、脫色率和多糖保留率。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種芒果加工副產(chǎn)物多糖的脫蛋白和脫色方法，包括以下步驟：

（1）芒果加工副產(chǎn)物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，按1:4~1:5g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，于搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；

（2）芒果粗多糖的提取：取步驟（1）制得的芒果皮渣勻漿，以蒸餾水為提取劑，采用超聲波輔助纖維素酶法提取多糖；取提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液3~5倍體積分數(shù)95%乙醇，4℃沉析過夜，以轉(zhuǎn)速4000~5000r/min離心5~10min，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2~4次，得到透明膠狀多糖；

（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將步驟（2）所得的透明膠狀多糖復溶于蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，加入tca-正丁醇混合溶液，于恒溫搖床中振蕩反應脫蛋白，靜置分層后取下層溶液，為脫蛋白后的芒果粗多糖溶液，測定其中蛋白質(zhì)含量和多糖含量；

（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml脫蛋白后的芒果粗多糖溶液，加入粉末活性炭于恒溫搖床中振蕩吸附脫色，6000~8000r/min離心10~20min，取上清液過膜，得脫色后的多糖溶液，測定多糖含量，并在多糖溶液最大吸收波長下測定吸光度，計算脫色率；將脫色后的多糖溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，流動蒸餾水透析72h，真空冷凍干燥即得芒果粗多糖。

進一步的，所述步驟（2）中，芒果粗多糖的提取條件為：取芒果皮渣勻漿，以1:2~1:5g/ml料液比加入蒸餾水，復水30min，調(diào)節(jié)ph為3.0~6.0，加入0.5%~1.5%（以芒果皮渣質(zhì)量計）纖維素酶，于超聲波清洗儀中以120w~300w的功率于40~60℃提取40~80min，升溫至90℃滅酶30min，所得提取液經(jīng)6000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重復提取1~2次。

進一步的，所述步驟（3）中，芒果粗多糖的脫蛋白條件為：tca-正丁醇混合溶液與多糖溶液體積比為2:1~1:2、tca-正丁醇混合溶液中tca與正丁醇體積比為1:5~1:20、靜置時間1~3h、振蕩時間1~3h。

優(yōu)選的，所述步驟（3）中，芒果粗多糖的脫蛋白條件為：tca-正丁醇混合溶液與多糖溶液體積比為2:1、tca-正丁醇混合溶液中tca與正丁醇體積比為1:20、靜置時間2h、振蕩時間2h，振蕩速度160r/min。

進一步的，所述步驟（4）中，粉末活性炭的脫色條件為：調(diào)節(jié)多糖溶液ph為3.0~5.0，添加0.5~2.0%（m/v，以多糖溶液體積計）活性炭，40~60℃振蕩脫色40~80min；過膜方法為：0.22μm微孔水系濾膜，真空泵抽濾。

優(yōu)選的，所述步驟（4）中，粉末活性炭的脫色條件為：調(diào)節(jié)多糖溶液ph為3.0，添加1.5%（m/v，以多糖溶液體積計）活性炭，50℃振蕩脫色75min；過膜方法為：0.22μm微孔水系濾膜，真空泵抽濾。

所述步驟（3）芒果粗多糖的脫蛋白以蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率為評價指標，試驗數(shù)據(jù)采用綜合加權(quán)評分法，評分標準為：設定蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的權(quán)重系數(shù)為0.5，將各項中的指標分別除以該列中的最大值再乘以100即為該項的得分，綜合評分z=0.5x+0.5y，其中x為蛋白質(zhì)脫除率，y為多糖保留率。所述步驟（4）芒果粗多糖的脫色的評價指標為脫色率和多糖保留率，試驗數(shù)據(jù)采用綜合加權(quán)評分法，評分標準參照芒果粗多糖脫蛋白實驗中的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案中，對芒果粗多糖脫蛋白方法、脫色方法、脫蛋白條件和脫色條件進行了篩選或優(yōu)化，獲得最優(yōu)的技術(shù)方案為：采用tca-正丁醇法對芒果多糖進行脫蛋白，脫蛋白最佳工藝條件為：tca-正丁醇與多糖溶液體積比2:1，三氯乙酸與正丁醇體積比1:20，靜置時間2h，振蕩時間2h；采用活性炭法脫色，活性炭脫色最佳條件為：脫色溫度50℃，脫色時間75min，活性炭添加量1.5%，ph為3.0；具體說明如下。

1、芒果粗多糖脫蛋白方法的篩選：配置5mg/ml的芒果粗多糖溶液，取30ml分別按以下方法進行脫蛋白試驗。

（1）tca法：向多糖溶液中加入等體積20%tca，160r/min振蕩2h，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（2）tca-正丁醇法：向多糖溶液中加入60mltca-正丁醇溶液（tca濃度20%，tca:正丁醇=1:10），160r/min振蕩2h，靜置分層后取下層溶液，測定其中蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（3）sevage法：向多糖溶液中加入1/4體積的sevage試劑（氯仿:正丁醇=1:4），180r/min振蕩60min，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（4）tca-sevage聯(lián)用法：取多糖溶液，采用上述tca法（tca濃度為10%）處理后，再采用sevage法脫蛋白，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（5）木瓜蛋白酶法：取多糖溶液，調(diào)節(jié)ph為6.5，加入5%木瓜蛋白酶（酶濃度1mg/ml），65℃水解5h，沸水浴中滅酶5min，冷卻至室溫，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（6）木瓜蛋白酶-sevage聯(lián)用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和sevage法脫蛋白，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（7）木瓜蛋白酶-tca聯(lián)用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和tca法脫蛋白，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（8）木瓜蛋白酶+tca-正丁醇聯(lián)用法：取多糖溶液，依次用木瓜蛋白酶法和tca-正丁醇法脫蛋白，分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

（9）hcl法：向多糖溶液中加入等體積1mol/lhcl，160r/min振蕩2h，4000r/min離心10min，取上清液分別測定蛋白質(zhì)含量和多糖含量。

結(jié)果表明，tca-正丁醇法和木瓜蛋白酶與tca-正丁醇聯(lián)用法對粗多糖中的蛋白質(zhì)脫除效果較好，脫除率均高于80%，但后者的多糖保留率較低，這可能是由于多次操作造成部分多糖損失。tca法、tca-sevage法、hcl法、木瓜蛋白酶-tca聯(lián)用法對粗多糖的蛋白質(zhì)脫除率均高于50%，但多糖損失較嚴重，這可能是由于tca法、hcl法在脫除蛋白的同時，過酸的環(huán)境造成多糖的降解；sevag法、木瓜蛋白酶法、木瓜蛋白酶-sevage聯(lián)用法的脫蛋白效果較差，脫除率僅為10%。因此，本發(fā)明技術(shù)方案中選擇tca-正丁醇法對芒果多糖進行脫蛋白（圖1）。

2、tca-正丁醇法脫蛋白條件優(yōu)化：選取tca-正丁醇與樣液（多糖溶液）體積比（a）、tca與正丁醇體積比（b）、靜置時間（c/h）、振蕩時間（d/h）4個因素，按l9(3⁴)正交表設計實驗，以確定最佳脫蛋白條件，因素水平見表1

。

結(jié)果表明，影響tca-正丁醇法脫蛋白效果的因素大小順序為：a>b>d>c，即tca-正丁醇與樣液的體積比對脫蛋白效果影響最大，其次為tca與正丁醇的體積比，再次是振蕩時間，靜置時間對脫蛋白效果影響最小。tca-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件為a1b3c2d2，即tca-正丁醇與樣液體積比2:1，三氯乙酸與正丁醇體積比1:20，靜置時間2h，振蕩時間2h。對正交試驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果如表3。由于靜置時間引起的偏差平方和最小，故選靜置時間列為誤差所在列，由表3可知，因素a、b、d對蛋白質(zhì)脫除率影響顯著，c影響不顯著。對最佳工藝進行驗證試驗，得出蛋白質(zhì)脫除率為90.08%，多糖保留率為94.40%，表明試驗所得工藝條件為最優(yōu)工藝條件。

3、活性炭法不同脫色條件對脫蛋白后多糖溶液脫色效果的影響

（1）單因素實驗設計：單因素設定因素為活性炭用量、脫色溫度、脫色時間、樣液ph值，分別考察4個因素對脫蛋白后多糖溶液脫色效果的影響。固定多糖溶液ph為3.0，脫色溫度50℃、振蕩時間1h，活性炭用量0.5、1.0、1.5、2.0、2.5%；固定多糖溶液ph為3.0，活性炭用量1.0%，振蕩時間1h，脫色溫度30、40、50、60、70℃；固定多糖溶液ph為3.0，活性炭用量1.0%，脫色溫度50℃、脫色時間20、40、60、80、100、120min；固定活性炭用量1.0%，脫色溫度50℃、脫色時間80min，多糖溶液ph為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0。

結(jié)果表明，隨著活性炭用量的增加，脫色率逐漸增大，而多糖保留率卻逐漸降低，綜合考慮，活性炭用量在0.5%～1.5%為宜（圖2）。脫色溫度在40～70℃的范圍內(nèi)，脫色率較大，50℃時達到最大；多糖保留率在40℃時達到最大，此后繼續(xù)升高溫度，多糖保留率緩慢降低。故選取50℃進行脫色效果較好（圖3）。隨著時間的延長，脫色率呈先增加后減小趨勢，60min時達到最大值；多糖保留率隨著脫色時間的延長緩慢降低，在60～100min的范圍內(nèi)降低趨勢較平緩，綜合考慮選擇最佳脫色時間為60min（圖4）。隨著ph的增加，脫色率逐漸增加，當ph大于3.0后，脫色率反而開始下降；多糖保留率隨著ph的增加先減小后增加，當ph達到5.0后，增加十分緩慢。綜合考慮選擇樣液ph為4.0（圖5）。

（2）正交優(yōu)化實驗設計：根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取脫色溫度（a/℃）、脫色時間（b/min）、活性炭添加量（c/%）、ph值（d）4個因素按l9(3⁴)正交表設計試驗，因素水平見表4：

。

結(jié)果表明，影響活性炭脫色效果的因素大小順序為：a>c>b>d，即脫色溫度對脫色效果影響最大，其次為活性炭添加量，再次是脫色時間，ph值對脫色效果影響最小?；钚蕴糠撋淖罴褩l件為a1b3c3d1，即脫色溫度50℃，脫色時間75min，活性炭添加量1.5%，ph為3.0。按優(yōu)化的工藝條件進行驗證試驗，得脫色率為70.98%，多糖保留率為92.77%，表明試驗確定的工藝條件為最佳工藝條件。

4、不同脫色方法對芒果多糖脫色率的影響。

方法一：h2o2法：取20ml脫蛋白后的多糖溶液，用2mol/lnaoh調(diào)ph至8.0～9.0，滴加30%h2o2至淺黃色（多糖液/h2o2=4:1，v/v），于40℃恒溫搖床中振蕩脫色2h，離心取上清液分別測定脫色率和多糖保留率。

方法二：大孔吸附樹脂脫色法：取20ml脫蛋白的多糖溶液，加入4gs-8樹脂，于30℃恒溫搖床中以160r/min振蕩吸附12h，過濾后取上清液分別測定脫色率和多糖保留率。

方法三：活性炭脫色法：按上述優(yōu)化的最佳作用條件行脫色試驗，分別測定脫色率和多糖保留率。

結(jié)果表明，活性炭法對芒果多糖的脫色效果較好，脫除率達到67.3%，分別高出h2o2法和大孔吸附樹脂法45.4%和53.1%，且多糖保留率也較高，故本發(fā)明選擇活性炭法對多糖液進行脫色（圖6）。

本發(fā)明涉及的樣品（包括芒果粗多糖溶液、脫蛋白/脫色后的多糖溶液）各項含量的測定方法說明如下：

（1）樣品蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍g-250比色法，將樣品稀釋5~10x，取1ml加入5ml考馬斯亮藍g-250，靜置2~10min，在595nm波長下測定od值，利用公式y=0.0007x+0.0057，（r²=0.9996）計算蛋白質(zhì)含量；

（2）樣品粗多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，將樣品稀釋10~25x，取1ml加蒸餾水稀釋至2ml，后加入1ml6%苯酚，5ml濃硫酸，振蕩均勻后靜置30min在490nm波長下測定od值，利用公式y=0.0110x-0.0002（r²=0.9994）計算多糖含量；

（3）樣品色素含量的測定方法為：將經(jīng)粉末活性炭脫色后的多糖樣品離心、過膜后，于310nm波長下測定吸光度，進而計算脫色率，脫色率的計算公式如下：

脫色率=（脫色前吸光度-脫色后吸光度）/脫色前吸光度×100%

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下有益效果：

（1）利用芒果加工副產(chǎn)物皮渣為原料提取粗多糖，一方面有利于提高芒果深加工產(chǎn)業(yè)的附加值，減輕環(huán)境污染；另一方面，本發(fā)明直接利用廢棄物鮮樣提取多糖，與傳統(tǒng)的干燥粉碎樣前處理方式相比，簡化了提取工藝，降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本；

（2）本發(fā)明設計采用超聲波輔助纖維素酶法提取芒果加工副產(chǎn)物多糖，纖維素酶能酶解細胞壁中的纖維素，超聲波的空化效應和振動作用，能促進細胞壁的破裂，有利于多糖的溶出，同時超聲波還有助于纖維素酶與細胞壁中纖維素充分接觸，是一種新的、有效的芒果多糖提取方法；

（3）本發(fā)明優(yōu)化后的tca-正丁醇法對芒果皮渣中的芒果粗多糖具有良好的脫蛋白效果，在蛋白質(zhì)脫除率高達90.08%，此時多糖保留率為94.4%；

（4）本發(fā)明采用活性炭對脫蛋白后的多糖溶液進行脫色，簡單、快速，可獲得較高的脫色率（70.98%）和多糖保留率（92.77%）；

（5）本方法為后續(xù)芒果多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定提供了理論參考，制得的芒果多糖半純品可用于食品和化妝品的配制。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1不同方法對蛋白質(zhì)脫除率和多糖損失率的影響。

圖2活性炭用量對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

圖3脫色溫度對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

圖4脫色時間對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

圖5樣液ph對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

圖6不同方法對芒果多糖脫色率和多糖保留率的影響。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明，這些實施例僅用來說明本發(fā)明，并不限制本發(fā)明的范圍。

實施例1采用以下步驟實現(xiàn)本發(fā)明：

（1）芒果加工副產(chǎn)物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，以1:5g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，于搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；

（2）芒果粗多糖的提取：取經(jīng)步驟（1）處理的芒果皮渣勻漿30g，加入90ml蒸餾水，復水30min、調(diào)節(jié)ph為5.0、加入芒果皮渣質(zhì)量1.0%的纖維素酶、于超聲波清洗儀中以240w的功率，于50℃提取60min，升溫至90℃滅酶30min；所得提取液經(jīng)6000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重復提取1次；提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液4倍體積95%乙醇，4℃沉析過夜，5000r/min離心10min，所得的沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，得到透明膠狀多糖；

（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將透明膠狀多糖復溶于蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，取30ml，加入60mltca-正丁醇混合溶液（tca與正丁醇體積比為1:10），于28℃恒溫搖床中160r/min振蕩反應2h，將多糖溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置1h，分層后取下層溶液測定其中蛋白質(zhì)和多糖含量；測得蛋白質(zhì)脫除率83.45%，多糖保留率92.56%；

（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml上述脫蛋白后的芒果粗多糖溶液，調(diào)節(jié)ph為3.0，加入1.0%（m/v，以多糖溶液體積計）的粉末活性炭，于50℃、160r/min振蕩吸附脫色100min，8000r/min離心20min，取上清液過0.22μm濾膜去除活性炭，測定多糖含量，并在310nm波長下測定上清液的吸光度，計算脫色率；測得脫色率為60.38%，多糖保留率為88.11%。

實施例2采用以下步驟實現(xiàn)本發(fā)明：

（1）芒果加工副產(chǎn)物的預處理：選取無損傷、無病害的芒果，取皮渣，清洗，切片，沸水浴滅活2min，以1:4g/ml料液比將芒果皮渣與蒸餾水混合，于搗碎機中勻漿，得芒果皮渣勻漿，4℃冷藏備用；

（2）芒果粗多糖的提?。喝〗?jīng)步驟（1）處理的芒果皮渣勻漿30g，加入120ml蒸餾水，復水30min、調(diào)節(jié)ph為5.0、加入芒果皮渣質(zhì)量0.8%的纖維素酶、于超聲波清洗儀中以300w的功率于50℃提取80min，升溫至90℃滅酶30min。所得提取液經(jīng)5000r/min離心10min，收集上清液，殘渣重復提取1次；提取液分離出上清液，真空減壓濃縮至10ml，加入濃縮液5倍體積95%乙醇，4℃沉析過夜，4000r/min離心10min，所得的沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2次，得到透明膠狀多糖；

（3）芒果粗多糖的脫蛋白：將透明膠狀多糖復溶于蒸餾水中，配置成5mg/ml的多糖溶液，取30ml，加入30mltca-正丁醇混合溶液（tca與正丁醇體積比為1:10），于28℃恒溫搖床中160r/min振蕩反應2h，將多糖溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置3h，分層后取下層溶液測定其中蛋白質(zhì)和多糖含量；測得蛋白質(zhì)脫除率73.56%，多糖保留率80.79%；

（4）芒果粗多糖的脫色：取20ml上述脫蛋白后的芒果粗多糖溶液，調(diào)節(jié)ph為5.0，加入1.0%（m/v，以多糖溶液體積計）的粉末活性炭，于50℃、160r/min振蕩吸附脫色60min，8000r/min離心10min，取上清液過0.22μm濾膜去除活性炭，測定多糖含量，并在310nm波長下測定上清液的吸光度，計算脫色率；測得脫色率為61.48%，多糖保留率為89.72%。