本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)-多糖復合物制備技術領域，特指一種以大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉為原料、采用多模式頻率超聲波或者逆流超聲波技術制備蛋白質(zhì)-多糖復合物并對葉黃素進行包埋制備功能食品的方法。

背景技術：

功能食品因含有維生素、不飽和脂肪酸、多酚類化合物或益生菌等生物活性成分，具有調(diào)節(jié)人體生理機能的功能，可以延緩和預防慢性疾病的發(fā)生。然而，許多活性成分對食品加工和儲藏過程中溫度、氧、光、ph和金屬離子等因素敏感，易于發(fā)生氧化、異構(gòu)化、聚集或降解等結(jié)構(gòu)改變，導致生物活性降低或丟失。而且，疏水性和兩親性活性成分在水中溶解度非常低。這些在很大程度上限制了活性成分在食品和醫(yī)藥工業(yè)中的應用。天然的生物大分子(如蛋白質(zhì)、多糖等)不但具有高的營養(yǎng)價值，而且具有多種功能特性，已被廣泛用作包埋技術中的原料。因此，開發(fā)天然大分子的蛋白質(zhì)-多糖復合物對生物活性成分進行包埋和保護，是發(fā)展功能性食品和藥品的關鍵。

大豆蛋白(soyprotein)是大豆中最主要成分之一，由于大豆的品種來源以及地域的不同，其蛋白含量有所不同。大豆蛋白是植物蛋白質(zhì)中最具有代表性的優(yōu)質(zhì)蛋白，其蛋白中氨基酸組成含量豐富被譽為植物牛奶。大豆蛋白是指將大豆浸出脫脂后，再除去一些其他成分得到的一種全價蛋白類物質(zhì)。一般來說，根據(jù)蛋白質(zhì)等電點控制ph4.6-5.0范圍內(nèi)獲得的沉淀即為大豆蛋白，其占大豆質(zhì)量的38％以上。在等電點處沉淀蛋白為球蛋白，未沉淀部分為清蛋白。大豆蛋白主要為球蛋白，由多種蛋白質(zhì)成分構(gòu)成的并存在于大豆種子中，按照離心分離系數(shù)不同，應用超速離心分離法可將其分為2s、7s、11s、15s蛋白四個主要的不同分子質(zhì)量組分(s是蛋白質(zhì)組分分離時的單位，1s＝1/10¹³s)。7s蛋白與11s蛋白含量較高，兩者總量占總蛋白總量的70％左右，且兩者的比例隨大豆品種不同有所差異。

大豆蛋白營養(yǎng)豐富，吸收率高，來源廣泛，但是大豆蛋白在某些食品體系中應用會受到限制，很難有效的充分利用，因此，國內(nèi)外研究者通過改性的方法來擴大大豆蛋白的使用范圍，改善大豆蛋白功能特性，使其能廣泛的應用于食品中。制備具有功能性質(zhì)的蛋白質(zhì)-多糖復合物，減少理化改性可能帶來的不利影響。適當控制蛋白質(zhì)與多糖的聚合改性向有利的方向發(fā)展，成為大豆蛋白改性很有前景的方法之一。

透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,ha)是一種天然高分子糖類化合物，是唯一不發(fā)生硫酸化的糖胺聚糖，其糖鏈特別長。糖胺聚糖一般由低于300個單糖基組成，而ha可含10萬個糖基。由于ha分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其相對分子質(zhì)量(mr)分布范圍很寬，從幾十萬到幾百萬不等。在溶液中ha分子呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)。由于ha分子表面有大量帶負電荷的親水性基團?？山Y(jié)合大量水分子。因而即使?jié)舛群艿鸵材苄纬烧吵淼哪z體，占據(jù)很大的空間，產(chǎn)生膨壓。ha雖不與蛋白質(zhì)共價結(jié)合，但可與許多種蛋白聚糖的核心蛋白質(zhì)及連接蛋白質(zhì)借非共價鍵結(jié)合而參與蛋白聚糖多聚體的構(gòu)成。透明質(zhì)酸鈉固體和溶液在常溫下均具有良好的穩(wěn)定性，且其溶液在ph值為中性時較穩(wěn)定，堿性條件下較酸性條件下穩(wěn)定。由于透明質(zhì)酸具有獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，因而其在生命體內(nèi)顯示出多種重要的生理功能：如潤滑關節(jié)，調(diào)節(jié)血管壁的通透性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)的擴散及運轉(zhuǎn)以及促進創(chuàng)傷愈合等。

研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)與多糖之間相互作用形成復合物可以克服單一組分ph敏感、穩(wěn)定性差、包埋效率低的不足，對生物活性成分起到很好的包埋和保護作用。因此國內(nèi)外學者進行了大量的有關蛋白質(zhì)-多糖復合物的制備方法及其對生物活性成分包埋的研究。乳化法是制備復合物的常用方法，此法的不足表現(xiàn)在復合物的制備過程中需要添加有機溶劑、表面活性劑、戊二醛交聯(lián)劑等，這些試劑的殘留使復合物具有一定毒性；去溶劑法和化學交聯(lián)法也涉及有毒交聯(lián)劑的引入；以上三種方法不是制備復合物的理想方法。離子交聯(lián)法和自組裝法制備復合物，條件溫和，不需要有毒的交聯(lián)劑，不生成化合鍵，僅依靠非共價鍵連接，因而被廣泛使用。特別是自組裝法，對于營養(yǎng)遞送系統(tǒng)設計而言，安全性等相對更佳。然而蛋白質(zhì)與多糖畢竟是不同性質(zhì)的兩種大分子，僅僅通過簡單自組裝法進行凝聚，凝聚效果差，凝聚物對生物活性成分的包埋效率低。

為了解決這一問題，本發(fā)明引進先進的掃頻式超聲波和逆流超聲波處理技術，希望超聲波能激發(fā)蛋白質(zhì)與多糖兩種生物大分子溶液產(chǎn)生與其自身固有頻率相匹配的共振頻率，產(chǎn)生交聯(lián)，獲得了一種包埋效率高、ph穩(wěn)定、粒徑均一的蛋白質(zhì)-多糖復合物，利用所得的蛋白質(zhì)-多糖復合物對生物活性成分進行包埋和保護。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明通過對大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉進行復合凝聚，添加葉黃素，利用掃頻式超聲波處理和逆流超聲波處理等技術手段制備大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，并研究其對葉黃素的包埋效果。

本發(fā)明大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，是由以下重量份的原料制備而成：

大豆蛋白：0.5～2份；

透明質(zhì)酸鈉：1～10份。

優(yōu)選以下重量份的原料制備而成：

大豆蛋白：1份；

透明質(zhì)酸鈉：1份。

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為(0.5-2)mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為(1-10)mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為：(0.5～2)：(1～10)，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝3-7。

(4)室溫下將步驟(3)得到的混合溶液進行逆流超聲波處理，具體參數(shù)為脈沖寬度1～5s、脈沖間隔1～5s、超聲功率密度50～80w/l；超聲頻率20khz，料液以逆流循環(huán)的方式通過超聲探頭。

(5)超聲結(jié)束后，室溫下靜置1h，即得大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，噴霧干燥或者冷凍干燥后得大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

其中步驟(3)中優(yōu)選調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

其中步驟(3)中所述的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例優(yōu)選為1：1。

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物負載葉黃素的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為(0.5-2)mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為(1-10)mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為：(0.5～2)：(1～10)，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝3-7。

(4)將濃度為(1-5)mg/ml的葉黃素的無水乙醇溶液逐滴加入步驟(3)制備的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉復合物溶液中，使得大豆蛋白和葉黃素的質(zhì)量比例為1：1；

(5)室溫下將步驟(4)得到的混合溶液進行逆流超聲波處理，具體參數(shù)為脈沖寬度1～5s、脈沖間隔1～5s、超聲功率密度50～80w/l；超聲頻率20khz，料液以逆流循環(huán)的方式通過超聲探頭。

(6)超聲結(jié)束后，即得負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，4℃環(huán)境中靜置過夜，抽濾后噴霧干燥或者冷凍干燥后得到負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

其中步驟(3)中優(yōu)選調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

其中步驟(4)中所述的使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例優(yōu)選為1：1。

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物的制備方法，或者按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為(0.5-2)mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為(1-10)mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為：(0.5～2)：(1～10)，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝3-7。

(4)對步驟(3)的混合溶液進行多頻模式超聲處理，其中所述的多頻超聲處理模式為：三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理，超聲功率密度100～150w/l；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間5s，超聲處理時間為40min。

(5)超聲結(jié)束后，室溫下靜置1h，即得大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，噴霧干燥或者冷凍干燥后得大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

其中步驟(3)中優(yōu)選調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

其中步驟(3)中所述的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例優(yōu)選為1：1。

其中步驟(4)中三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理的超聲波頻率組合為：28khz、35khz、35/40khz或者28/35/40khz，優(yōu)選28/35/40khz。

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物負載葉黃素的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為(0.5-2)mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為(1-10)mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為：(0.5～2)：(1～10)，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝3-7。

(4)將濃度為(1-5)mg/ml的葉黃素的無水乙醇溶液逐滴加入步驟(3)制備的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉復合物溶液中，使得大豆蛋白和葉黃素的質(zhì)量比例為1：1；

(5)對步驟(4)的混合溶液進行多頻模式超聲處理，其中所述的多頻超聲處理模式為：三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理，超聲功率密度100～150w/l；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間5s，超聲處理時間為40min。

(6)超聲結(jié)束后，即得負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，4℃環(huán)境中靜置過夜，抽濾后噴霧干燥或者冷凍干燥后得到負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

其中步驟(3)中優(yōu)選調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

其中步驟(3)中所述的使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例優(yōu)選為1：1。

其中步驟(5)中三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理的超聲波頻率組合為：28khz、35khz、35/40khz或者28/35/40khz，優(yōu)選28/35/40khz。

負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、緩釋時間長、包載率高等優(yōu)點，可應用于制作保健食品、食品或者藥品。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明向大豆蛋白中添加透明質(zhì)酸鈉，改變大豆蛋白的高級結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)打開，暴露活性基團，同時蛋白質(zhì)和多糖形成小的聚集體，從而促進各聚集體通過疏水相互作用形成復合物為包埋生物活性成分提供基礎。

(2)本發(fā)明在利用大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物包埋葉黃素的過程中，使用逆流超聲波處理技術或者多模式超聲波技術，通過超聲波的物理力促進了蛋白質(zhì)和多糖交聯(lián)成聚集體，從而促進各聚集體通過疏水相互作用形成復合物，為包埋生物活性成分提供基礎。

(3)本發(fā)明中包埋葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物的制備方法，工藝操作簡單，制備過程中未涉及有機試劑，適宜工業(yè)化生產(chǎn)，且大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉原料價格便宜，制備工藝簡單。

(4)本發(fā)明的包埋葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、緩釋時間長、包載率高等優(yōu)點，可應用于食品、保健品、藥品及化妝品等多個領域。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的多模式超聲波生物處理設備結(jié)構(gòu)圖，其中1、2、3為超聲振板，4為盛液器，5為水浴鍋，6為溫度探頭，7為循環(huán)泵，8為電腦程序控制器，9、10、11為超聲控制器。

圖2是逆流超聲處理設備結(jié)構(gòu)示意圖，1為聚能式超聲波探頭，2為超聲波控制器，3為超聲杯型腔，4為進料口，5為循環(huán)泵，6為盛液器，7為出料口。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術語，除非另外說明，一般都能被本領域普通技術人員理解。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。特此說明：這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

圖1為本發(fā)明的多模式超聲波生物處理設備，該設備配有一臺電腦程序控制器8，可設定超聲工作參數(shù)(超聲功率密度、頻率、脈沖工作時間、間歇時間和處理總時間)分別控制三個超聲控制器9、10、11，分別連接三支不同頻率的超聲振板1、2、3，可實現(xiàn)單一頻率/兩個頻率/三個頻率超聲波處理；將需要處理的溶液投入盛液器4中進行單頻/雙頻/多頻超聲處理，啟動循環(huán)泵7對溶液進行循環(huán)。通過水浴鍋5和溫度探頭6實現(xiàn)溶液溫度的自動控制。

圖2為本發(fā)明的逆流超聲處理設備，該設備配有超聲波控制器2，控制超聲參數(shù)，聚能式超聲波探頭1對進料口4進入超聲杯型腔3的物料進行處理，超聲的同時啟動循環(huán)泵5對料液進行循環(huán)，6為盛液器，7為出料口。

本發(fā)明中的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉均為市售產(chǎn)品，食品級產(chǎn)品，其中大豆蛋白中蛋白質(zhì)含量大于90％。

實施例1-6(不加超聲)

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物負載葉黃素的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為(0.5-2)mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為(1-10)mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例見表1，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

(4)將濃度為(1-5)mg/ml的葉黃素的無水乙醇溶液逐滴加入步驟(3)制備的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉復合物溶液中，使得大豆蛋白和葉黃素的質(zhì)量比例為1：1；

(5)超聲結(jié)束后，即得負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，4℃環(huán)境中靜置過夜，抽濾后噴霧干燥或者冷凍干燥后得到負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物。

(6)葉黃素包封率和負載率的測定

精確稱取一定量的冷凍干燥后的負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，置于棕色容量瓶中，加入無水乙醇，在超聲波水浴中加熱超聲提取15min，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度，混勻，過濾。并以無水乙醇為空白在446nm處測定吸光值，計算葉黃素的含量。根據(jù)下式計算葉黃素的包封率和負載率：

葉黃素的包封率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/葉黃素總質(zhì)量；

葉黃素的負載率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/樣品總質(zhì)量。

實施例1-6制備過程相同，只是大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量比不同，具體見表1不同質(zhì)量比的大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉對葉黃素包封率和負載率的影響。

通過表1中對比實施例1-6不同質(zhì)量比的大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉對葉黃素包封率和負載率的影響可以看出，與對照相比(不加透明質(zhì)酸鈉，即實施例6)，添加透明質(zhì)酸鈉可以顯著提高大豆蛋白包埋葉黃素的包封率；大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量比為0.5:1時即可使葉黃素的包封率提高32.5％，大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量比為1:1時則使葉黃素的包封率提高了87.5％。

表1不同大豆蛋白/透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量比對葉黃素包封率和負載率的影響

實施例7-10(加多模式頻率超聲波處理)

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物負載葉黃素的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為0.5mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為1mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為0.5：1，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

(4)將濃度為1mg/ml的葉黃素的無水乙醇溶液逐滴加入步驟(3)制備的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉復合物溶液中，使得大豆蛋白和葉黃素的質(zhì)量比例為1：1；

(5)對步驟(4)的混合溶液進行多頻模式超聲處理，其中所述的多頻超聲處理模式為：三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理，超聲功率密度150w/l；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間5s，超聲處理時間為40min；三頻同步超聲處理或者雙頻同步超聲處理或者單頻超聲處理的超聲波頻率組合見表2。

(6)超聲結(jié)束后，即得負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，4℃環(huán)境中靜置過夜，抽濾后噴霧干燥或者冷凍干燥后得到負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

(7)葉黃素包封率和負載率的測定

精確稱取一定量的冷凍干燥后的負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，置于棕色容量瓶中，加入無水乙醇，在超聲波水浴中加熱超聲提取15min，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度，混勻，過濾。并以無水乙醇為空白在446nm處測定吸光值，計算葉黃素的含量。根據(jù)下式計算葉黃素的包封率和負載率：

葉黃素的包封率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/葉黃素總質(zhì)量；

葉黃素的負載率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/樣品總質(zhì)量。

實施例11-12(加逆流超聲處理)

大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物負載葉黃素的制備方法，按照下述步驟進行：

(1)將大豆蛋白溶解到蒸餾水中，室溫下磁力攪拌2h，然后將其靜置于4℃環(huán)境中過夜；然后將大豆蛋白的分散液于10000rpm在4℃離心30min，得到大豆蛋白濃度為0.5mg/ml分散液；

(2)將透明質(zhì)酸鈉溶解到水溶液中，磁力攪拌至完全溶解；得到濃度為1mg/ml透明質(zhì)酸鈉溶液；

(3)將步驟(2)透明質(zhì)酸鈉溶液按體積比為1:1比例逐滴加入到步驟(1)大豆蛋白溶液中，使得大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉的質(zhì)量比例為0.5：1，然后調(diào)節(jié)混合溶液的ph＝5。

(4)將濃度為1mg/ml的葉黃素的無水乙醇溶液逐滴加入步驟(3)制備的大豆蛋白和透明質(zhì)酸鈉復合物溶液中，使得大豆蛋白和葉黃素的質(zhì)量比例為1：1；

(5)室溫下將步驟(4)得到的混合溶液進行逆流超聲波處理，具體參數(shù)為脈沖寬度1～5s、脈沖間隔1～5s、超聲功率密度50～80w/l；超聲頻率20khz，料液以逆流循環(huán)的方式通過超聲探頭；具體見表2。

(6)超聲結(jié)束后，即得負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物溶液，4℃環(huán)境中靜置過夜，抽濾后噴霧干燥或者冷凍干燥后得到負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合凝聚物。

(7)葉黃素包封率和負載率的測定

精確稱取一定量的冷凍干燥后的負載葉黃素的大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物，置于棕色容量瓶中，加入無水乙醇，在超聲波水浴中加熱超聲提取15min，冷卻至室溫，用無水乙醇定容至刻度，混勻，過濾。并以無水乙醇為空白在446nm處測定吸光值，計算葉黃素的含量。根據(jù)下式計算葉黃素的包封率和負載率：

葉黃素的包封率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/葉黃素總質(zhì)量；

葉黃素的負載率(％)＝(大豆蛋白-透明質(zhì)酸鈉復合物中葉黃素含量)×100/樣品總質(zhì)量。

實施例7-12制備過程相同，只是超聲參數(shù)略有改變，表2不同超聲波模式對姜黃素包封率和負載率的影響。

表2不同超聲波模式對姜黃素包封率和負載率的影響

通過表2中對比實施例7-12不同超聲波模式對油菜籽活性蛋白微膠囊包埋姜黃素的包封率和負載率的影響，可以發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以顯著提高油菜籽活性蛋白微膠囊包埋姜黃素的包封率，與對照相比(不超聲)，逆流超聲波處理使姜黃素的包封率提高32.9％～62.7％，而28khz/35khz/40khz的雙頻掃頻超聲波處理則使姜黃素的包封率提高了62.7％。