本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)控芍藥花色苷積累的mir156e-3p及其植物表達載體和構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
色澤對于觀賞植物而言至關(guān)重要，它不僅影響植株的外觀品質(zhì)，而且直接關(guān)系到其商品價值。植物色澤是由多種因素共同作用形成的，其中色素的種類及其含量最為重要，主要包括葉綠素、類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿等四大類物質(zhì)。在這些物質(zhì)中，類黃酮是最重要的色素類群，產(chǎn)生的顏色范圍最廣，可以從淺黃色到藍紫色，是眾多觀賞植物呈色的主要色素。而作為類黃酮色素群的主要種類，花色苷在紅色的形成中起著不可替代的作用。
芍藥作為我國的傳統(tǒng)名花，因其花大色艷、花型多變而廣受人民的喜愛，已成為近年來市場上流行的高檔切花，廣泛用于婚禮、宴會等喜慶場合。芍藥花色豐富，分別有白、粉、紅、紫、墨、藍、黃、綠、復色等色澤，但芍藥品種大多分布于粉、紅色系及其衍生色，而這些色澤主要是由花色苷所決定。迄今為止，關(guān)于芍藥中花色苷積累的研究主要集中在轉(zhuǎn)錄水平上，已經(jīng)明確了芍藥花色苷的生物合成途徑及其關(guān)鍵基因，pal、chs、dfr和ans等基因均對芍藥中花色苷積累起著重要調(diào)控作用，通過轉(zhuǎn)這些基因能夠在一定程度上改變色澤。而在轉(zhuǎn)錄后水平上，目前還未見到關(guān)于調(diào)控花色苷積累的相關(guān)報道。
mirna是生物體內(nèi)長度為21～22個核苷酸的非蛋白編碼小rna，其主要和轉(zhuǎn)錄因子通過相互協(xié)作來調(diào)節(jié)下游目標基因的表達，在調(diào)節(jié)基因表達轉(zhuǎn)錄后水平中起著重要的作用。目前，關(guān)于mirna在植物上的功能主要集中于植物生長發(fā)育、生殖分化和抵抗逆境脅迫，而在花色苷調(diào)控方面，mirna主要是通過負調(diào)控與花青素合成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子等的轉(zhuǎn)錄或翻譯，抑制靶基因的表達，進而調(diào)控植物色澤。例如：yang等將mir828進行轉(zhuǎn)基因研究后發(fā)現(xiàn)mir828能夠抑制植株體內(nèi)花色苷的合成，野生擬南芥植株中花色苷含量比mir828轉(zhuǎn)基因植物高2.5倍；tang等通過sttm技術(shù)沉默了擬南芥葉片內(nèi)源的mir165/166，發(fā)現(xiàn)與花色苷生物合成有關(guān)的一些基因大量表達，從而引起植株體內(nèi)的花色苷含量顯著增加，色澤發(fā)生改變；wang等發(fā)現(xiàn)在缺磷條件下，mir778能促進花色苷的積累，轉(zhuǎn)mir778擬南芥植株中積累的花色苷含量比野生型植株高1.9倍，相反地，構(gòu)建使mir778沉默表達的mim778轉(zhuǎn)基因擬南芥植株積累的花色苷含量與野生型植株并無差別，這也證明了在磷不足的條件下，過量表達的mir778能夠促進花青素的積累。此外，mir156調(diào)控花色苷積累的能夠在擬南芥上也進行了較為深入的研究。而與芍藥花色苷合成相關(guān)的mirna序列尚不清楚。
在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導法是應用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達載體至關(guān)重要。將調(diào)控芍藥花色苷積累的mirna構(gòu)建植物表達載體，用于農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化，能夠創(chuàng)制色澤改變的新種質(zhì)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于填補芍藥上調(diào)控花色苷積累的mirna序列的空白，提供一個新的芍藥mir156e-3p序列。
本發(fā)明還提供該mir156e-3p的植物表達載體及其構(gòu)建方法和應用。所構(gòu)建的植物表達載體可直接用于農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高花色苷積累、創(chuàng)制色澤改變的新種質(zhì)。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案：
調(diào)控芍藥花色苷積累的mir156e-3p，其成熟體序列為：5′-gctctctcttcgtctgtcatc-3′(seqidno.1)，前體序列為：
5′-acgaagaagagaaagaaatgttgacagaagagagggagcacaacccgggatcagctaaagggt-3′(seqidno.2)。
調(diào)控芍藥花色苷積累的mir156e-3p植物表達載體，由本發(fā)明所述的芍藥mir156e-3p前體序列與中間植物表達載體pcambia1301構(gòu)成。
調(diào)控芍藥花色苷積累的mir156e-3p植物表達載體，其構(gòu)建方法：是將序列如seqidno.2所示芍藥mir156e-3p前體序列與中間植物表達載體連接形成。
具體步驟如下：
(1)調(diào)控芍藥花色苷積累的mir156e-3p前體序列克隆：以芍藥‘金輝’紅色外瓣為材料，提取總rna，反轉(zhuǎn)錄為cdna，設計引物擴增mir156e-3p前體序列，上游引物mir156e-3p-f:5′-acgaagaagagaaagaaatgttgac-3′(seqidno.3)，下游引物mir156e-3p-r:5′-accctttagctgatcccgggttgtg-3′(seqidno.4)，以反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板，進行pcr擴增，產(chǎn)物連接到peasytm-t5zerocloningvector載體，轉(zhuǎn)化trans-t1感受態(tài)細胞，而后在附加0.1％氨芐青霉素的lb平板上篩選陽性克隆進行序列測定；
(2)植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p的構(gòu)建：設計引物以芍藥‘金輝’紅色外瓣cdna為模板，進行pcr擴增，在mir156e-3p前體序列的上游和下游分別引入bamhi和kpni酶切位點，上游引物mir156e-3p-tf:5′-cgcggatccacgaagaagagaaagaaatgttgac-3′(seqidno.5)，下游引物mir156e-3p-tr:5′-cggggtaccaccctttagctgatcccgggttgtg-3′(seqidno.6)。pcr產(chǎn)物連接到peasytm-t5zerocloningvector載體，轉(zhuǎn)化trans-t1感受態(tài)細胞，而后在附加0.1％氨芐青霉素的lb平板上篩選陽性克隆、提取陽性質(zhì)粒，bamhi和kpni雙酶切的mir156e-3p前體序列片段與bamhi和kpni雙酶切的pcambia1301連接、轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗證，植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p構(gòu)建成功。
(3)芍藥mir156e-3p的植物表達載體用于農(nóng)桿菌介導的植物遺傳轉(zhuǎn)化，提高花色苷積累、創(chuàng)制色澤改變的新種質(zhì)，方法如下：農(nóng)桿菌菌株eha105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化；擬南芥花序浸染及種子篩選；轉(zhuǎn)基因植株鑒定及色澤與花色苷含量評價。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
1、本發(fā)明提供的芍藥mir156e-3p是一個新的調(diào)控花色苷積累的mirna，其可提高植物的花色苷含量、改變色澤。
2、本發(fā)明構(gòu)建的芍藥mir156e-3p植物表達載體為首次報道，可直接用于農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化，提高花色苷積累、創(chuàng)制色澤改變的新種質(zhì)。
附圖說明
圖1前體序列的瓊脂糖凝膠電泳檢測。m：50bpdnaladdermarker；1：mir156e-3p前體序列擴增產(chǎn)物；
圖2質(zhì)粒酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測。m：20bpdnaladdermarker；1：pcambia1301-mir156e-3p質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物。
圖3植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p圖譜。
圖4擬南芥?zhèn)戎us區(qū)擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
圖5擬南芥抽薹初期植株及側(cè)枝表型。a：擬南芥植株；b：莖稈及側(cè)枝；c：側(cè)枝；箭頭所指之處為側(cè)枝。
具體實施方式
所涉及的pcambia1301為商品化植物載體。
實施例1.mir156e-3p前體序列的克隆
選用芍藥‘金輝’紅色外瓣作為材料，參照minibestplantrnaextractionkit試劑盒(takara)說明書方法提取總rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser試劑盒(takara)取1μg總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。
以提取的花瓣cdna為模板，設計引物mir156e-3p-f和mir156e-3p-r進行pcr反應：上游引物mir156e-3p-f:5′-acgaagaagagaaagaaatgttgac-3′(seqidno.3)，下游引物mir156e-3p-r:5′-accctttagctgatcccgggttgtg-3′(seqidno.4)；25μl反應體系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，mir156e-3p-f、mir156e-3p-r引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，taqdnapolymerase0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反應程序：94℃預變性3min，然后94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸30sec，反應35個循環(huán)，72℃延伸10min；pcr結(jié)束后使用3％的瓊脂糖電泳檢測(圖1)，產(chǎn)物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝膠回收試劑盒(takara)回收純化，產(chǎn)物連接到peasytm-t5zerocloningvector載體(trans)，轉(zhuǎn)化trans-t1感受態(tài)細胞，而后在附加0.1％氨芐青霉素的lb平板上篩選陽性克隆進行測序，序列測定為seqidno.2。
實施例2.植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p的構(gòu)建
設計引物mir156e-3p-tf、mir156e-3p-tr進行pcr反應，在mir156e-3p前體序列的上游和下游分別引入酶切位點bamhi和kpni，pcr產(chǎn)物連接到peasytm-t5zerocloningvector載體，轉(zhuǎn)化trans-t1感受態(tài)細胞，而后在附加0.1％氨芐青霉素的lb平板上篩選陽性克隆、提取陽性質(zhì)粒，bamhi和kpni雙酶切的mir156e-3p前體序列片段與bamhi和kpni雙酶切的pcambia1301連接、轉(zhuǎn)化，提取陽性質(zhì)粒，電泳檢測并測序驗證為seqidno.2，具體步驟如下：上游引物mir156e-3p-tf:5′-cgcggatccacgaagaagagaaagaaatgttgac-3′(seqidno.5)，下游引物mir156e-3p-tr:5′-cggggtaccaccctttagctgatcccgggttgtg-3′(seqidno.6)。
①以芍藥花瓣cdna作為模板，進行pcr反應，25μl反應體系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，mir156e-3p-tf、mir156e-3p-tr引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，taqdnapolymerase0.25μl，cdna模板2.0μl，ddh2o15.75μl；反應程序：94℃預變性3min，然后94℃變性30sec，52.2℃退火30sec，72℃延伸30sec，反應35個循環(huán)，72℃延伸10min；pcr產(chǎn)物使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝膠回收試劑盒(takara)回收純化。
②取表達載體pcambia1301質(zhì)粒和含酶切位點的mir156e-3p膠回收產(chǎn)物分別用bamhi和kpni雙酶切，20μl雙酶切反應體系：0.5×kbuffer2.0μl，質(zhì)粒pcambia1301或mir156e-3p膠回收產(chǎn)物10μl，bamhi1.0μl，kpni1.0μl，ddh2o6.0μl；37℃反應1.5h；雙酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，使用takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.0凝膠回收試劑盒(takara)回收純化質(zhì)粒pcambia1301大片段和mir156e-3p大片段。用t4dna連接酶(takara)連接兩個回收的產(chǎn)物，20μl連接反應體系：10×t4ligasebuffer2.0μl，t4dnaligase1.0μl，pcambia1301大片段2.0μl，mir156e-3p10μl，ddh2o5μl；22℃室溫連接15min后65℃水浴10min，取5μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans-t1感受態(tài)細胞，而后在附加0.05％卡那霉素的lb平板上37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性單克隆擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒pcambia1301-mir156e-3p，對質(zhì)粒進行雙酶切(圖2)，并測序驗證為seqidno.2。植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p構(gòu)建成功(圖3)。
實施例3.植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥及花色苷含量與色澤評價
①農(nóng)桿菌菌株eha105感受態(tài)制備及凍融法轉(zhuǎn)化
從yeb(50μg/ml利福平)平板上挑取eha105單菌落，接種于50ml含有50mg/l利福平的yeb液體培養(yǎng)基中，28℃、200rpm培養(yǎng)至od600值0.5，而后冰浴菌液30min，轉(zhuǎn)至預冷的50ml離心管中，4℃、5000rpm、離心10min收集菌體，懸浮于2ml預冷的50mmcacl2(15％甘油)溶液中，混勻后以100μl/管分裝在1.5ml滅菌離心管中，液氮冷凍后-80℃保存待用。
取10μlpcambia-mir156e-3p載體質(zhì)粒，加入200μleha105感受態(tài)細胞，冰浴30min，液氮冷凍5min，37℃5min，加入800μlyeb液體培養(yǎng)基，28℃、200rpm預培養(yǎng)4h，菌液涂板于yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆pcr檢測，選取陽性克隆搖菌，用于擬南芥花序轉(zhuǎn)化。
②擬南芥花序浸染及種子篩選
將陽性單克隆接到50ml的yeb(50μg/ml利福平+50μg/ml卡那霉素)液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，5000rpm離心20min，然后用轉(zhuǎn)化液(1/2ms，添加50g/l的蔗糖，調(diào)ph為5.8，然后加200μl/l的silwetl-77混合)劇烈懸浮沉淀至完全懸起。
將處于盛花期的擬南芥地上部分直接浸泡于上述懸浮液中1min，用保鮮膜密封包裹植株，暗培養(yǎng)12h后打開保鮮膜，置于適宜的環(huán)境中繼續(xù)生長，待種子成熟時采收。
種子消毒與播種：將種子放入1.5ml的滅菌離心管中，加入1ml消毒液(75％酒精+0.1％的tritonx-100)不間斷振蕩15min，再用100％酒精清洗1min，重復兩次，吸取擬南芥種子到雙層濾紙盤上，靜候風干，而后將種子均勻播種于篩選培養(yǎng)基(1/2ms+30g/l蔗糖+6.5g/l瓊脂+25mg/l氨芐青霉素+25mg/l潮霉素，ph5.8)篩選培養(yǎng)10天，然后將抗性苗移栽到土中，用保鮮膜覆蓋幼苗1周以保濕。
③轉(zhuǎn)基因植株鑒定及色澤與花色苷含量評價
植株gus區(qū)pcr檢測：以擬南芥的側(cè)枝為材料，參照rnaisoplus(totalrna提取)試劑盒(takara)說明書方法提取總rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser試劑盒(takara)取1.0μg總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。將反轉(zhuǎn)錄所得的cdna進行pcr擴增、電泳檢測，以擬南芥actin為內(nèi)參基因，設計引物為：上游引物atactin-f：5′-tctcccgctatgtatgtcgc-3′(seqidno.7)；下游引物atactin-r：5′-taaggtcacgtccagcaagg-3′(seqidno.8)；設計gus區(qū)引物為：上游引物gus-f：5′-ctgcgtttcgatgcggtcac-3′(seqidno.9)；下游引物gus-r：5′-ctccctgctgcggtttttca-3′(seqidno.10)；25μl反應體系：10×rcrbuffer(mg2+plus)2.5μl，上游引物、下游引物各1.25μl(10mm)，dntpmixture(2.5mmeach)2.0μl，la
植株qrt-pcr檢測：以擬南芥的側(cè)枝為材料，參照rnaisoplus(totalrna提取)試劑盒(takara)說明書方法提取總rna，按照primerscripttmrtreagentkitwithgdnaeraser試劑盒(takara)取1.0μg總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna。將反轉(zhuǎn)錄所得的cdna按照
表1mir156e-3p在擬南芥植株側(cè)枝中的相對表達量
從表1中可以看出，mir156e-3p在野生型col-0擬南芥植株中的表達量與轉(zhuǎn)mir156e-3p植株相差較大，轉(zhuǎn)mir156e-3p植株的表達量為col-0的2.6倍。
色澤評價：在抽薹初期，通過肉眼觀察明顯可以看出轉(zhuǎn)mir156e-3p擬南芥植株的側(cè)枝為紫紅色，而野生型col-0植株的側(cè)枝仍為綠色(圖5)。
花色苷含量評價：以擬南芥的側(cè)枝為材料，取0.1g置于液氮中充分研磨，溶于1ml提取液(甲醇：hcl：雙蒸水＝70:0.1:29.9；體積比)，置于4℃下24h。將提取液通過0.22μm有機相微孔濾膜過濾。利用液質(zhì)聯(lián)用色譜儀進行色素的定量分析。色譜條件為：色譜柱：asibutc18tskgelods-80tsqa(4.6mm×150mm，tosohco.ltd.，日本)。流動相：a，乙腈；b，0.5％甲酸。洗脫梯度為：0min，5％b；30min，10％b；50min，15％b；60min，20％b；65min，25％b；75min，5％b；90min，5％b。流速為0.8ml/min，柱溫保持35℃，進樣量為5μl?；ㄉ盏臋z測波長分別為525nm，花瓣中花色苷含量采用標準品矢車菊素-3,5-o-二葡萄糖苷的半定量法，以mg/g新鮮花瓣計。表2為擬南芥植株側(cè)枝的花色苷含量測定結(jié)果，在野生型col-0擬南芥植株中并未檢測到花色苷，而轉(zhuǎn)mir156e-3p植株中的花色苷含量達到79.02mg/kgfw。
表2擬南芥植株側(cè)枝花色苷含量
綜上所述，本發(fā)明構(gòu)建了含有芍藥mir156e-3p前體序列的植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p，其中芍藥的mir156e-3p成熟體及前體序列首次報道。所構(gòu)建的載體可導入植物中，提高植物的花色苷積累量、改變色澤。
利用mirna在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控植物色澤的方式更加新穎獨特，本發(fā)明構(gòu)建了含有芍藥mir156e-3p前體序列的植物表達載體pcambia1301-mir156e-3p，其中芍藥的mir156e-3p成熟體及前體序列首次報道。所構(gòu)建的載體可導入植物中，提高植物的花色苷積累量、改變色澤。
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