一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法，即采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下對(duì)草莓中的3種葉黃素循環(huán)組分—玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，本發(fā)明丙酮作為提取劑，不經(jīng)過皂化直接提取草莓中葉黃素循環(huán)組分，以乙腈：甲醇＝9：1為流動(dòng)相，檢測(cè)吸收波長為445nm，檢測(cè)可以在1～2min內(nèi)完成。本發(fā)明方法精密度高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高，對(duì)草莓葉黃素循環(huán)3種組分同時(shí)進(jìn)行分離和含量測(cè)定，具有提取速度快、測(cè)定精密度高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好的特點(diǎn)，且測(cè)定的結(jié)果準(zhǔn)確可靠、試劑用量少，從而大大提高了測(cè)定速度和減少了溶劑消耗。
【專利說明】一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 草莓(Fragaria ananassa Duch)屬薔薇科多年生草本植物，果實(shí)鮮美紅嫩，濃郁 多汁，果味芳香并且營養(yǎng)豐富，素有"水果皇后"之稱。草莓喜溫暖而不耐高溫強(qiáng)光，在越夏 露地栽培時(shí)比一般果菜類更易發(fā)生光抑制，光損傷，嚴(yán)重影響其品質(zhì)及產(chǎn)量。葉黃素循環(huán) (Xanthophyll cycle)是高等植物長期進(jìn)化過程中保存下來的一種代謝機(jī)制，主要由3個(gè)組 分即玉米黃質(zhì)（Zeaxanthin，Z)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)（Antheraxanthin，A)和紫黃質(zhì) (Violaxanthin，V)參與。葉黃素循環(huán)是指在不同光強(qiáng)及pH下由紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶 (Violaxanthin de-epoxidase，VDE)和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZE)催 化A、V和Z 3種組分相互轉(zhuǎn)化的過程。依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散是植物耗散過剩光能的主 要方式，在逆境脅迫中起著非常重要的光保護(hù)作用。植物遭受水分、高低溫、鹽漬等脅迫時(shí)， 依賴葉黃素循環(huán)的熱耗散增強(qiáng)，光合器官均可通過葉黃素循環(huán)來提高應(yīng)付過剩光能的能 力。目前草莓葉黃素循環(huán)組分提取和測(cè)定尚未見報(bào)道，缺少準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法，因此建立 一種快速、準(zhǔn)確的測(cè)定方法對(duì)研究葉黃素循環(huán)調(diào)控機(jī)制、合理開發(fā)和利用我國草莓資源具 有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。
[0003]高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC)是近年來分 離及測(cè)定植物天然色素的主要方法，但在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在分析時(shí)間長，分離效果不佳 等缺陷。超高效液相色譜法（Ultra performance liquid chromatography，UPLC)是基于 HPLC推出的一種新型的液相色譜技術(shù)，它使用粒徑低于2μπι的小顆粒填充色譜柱提升樣品 的分析效率，彌補(bǔ)了HPLC的缺陷，分離速度、靈敏度以及分離度高達(dá)HPLC的9、3、1.7倍，并且 在HPLC的基礎(chǔ)上兼具環(huán)境友好、成本低等特點(diǎn)，已逐漸成為食品分析檢測(cè)的有效工具。但利 用UPLC測(cè)定草莓葉黃素循環(huán)組分國內(nèi)外還未見報(bào)道。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，在于提供一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法，該方 法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，且還具有精密度高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法，采用超高效液相色譜法在同一色譜條件下 對(duì)草莓中的3種分別為玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)的葉黃素循環(huán)組分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè) 定;該方法包括如下步驟：
[0007] (1)制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)對(duì)照品，加丙 酮得到三種單個(gè)對(duì)照品溶液;再分別精密量取三種單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶中，得到 混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液；
[0008] (2)制備待測(cè)品溶液：用液氮將草莓葉片研磨至粉末，精確稱取0 . lg，加入5mL丙 酮，于4 °C避光浸提5min，低溫超聲提取2min，12000rpm，4°C離心10min，取上清液，重復(fù)操作 1次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40°C將其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得；
[0009] (3)超高效液相色譜檢測(cè)：
[0010] 檢測(cè)儀器:超高效液相色譜；
[0011] 色譜柱:規(guī)格為2.1mmX 100mm, 1.7u m的色譜柱；
[0012]流動(dòng)相：乙腈與甲醇；
[0013] 流速:0.5ml/min;
[0014] 檢測(cè)波長:445nm;
[0015] 進(jìn)樣體積:l〇ul;
[0016] 柱溫：30°C;
[0017] (4)測(cè)定:分別取制備獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)液，并采用上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢 測(cè)，記錄色譜圖，經(jīng)過色譜儀器自帶軟件積分得到峰面積，計(jì)算得到待測(cè)液中3種葉黃素循 環(huán)組分一玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)的含量。
[0018] 進(jìn)一步地，所述流動(dòng)相中各組分的體積比為乙腈：甲醇= 9:1。
[0019] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] 本發(fā)明確定了適用于草莓葉黃素循環(huán)組分測(cè)定的超高效液相法，本方法精密度 高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高，本發(fā)明的流動(dòng)相組合可以將3種葉黃素循環(huán)組分徹底分 離，且在同一色譜條件下對(duì)草莓中3種葉黃素循環(huán)組分同時(shí)進(jìn)行分離和含量測(cè)定，流動(dòng)相試 劑用量少，方法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在1~2分鐘內(nèi)就可完成檢測(cè)，大大提高了分析速 度和減少了溶劑消耗;本發(fā)明方法采用未經(jīng)皂化處理工藝步驟，可以提高葉黃素循環(huán)組分 提取效果，因此本發(fā)明是適合草莓葉黃素循環(huán)組分定性和定量分析的最佳方法，為草莓葉 黃素循環(huán)調(diào)控機(jī)制研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。 【【附圖說明】】
[0021 ]下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0022]圖1為玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液超高效液相色譜 (UPLC)圖。
[0023]圖2為實(shí)施例1的待測(cè)品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。
[0024]圖3為實(shí)施例2的待測(cè)品溶液的超高效液相色譜(UPLC)圖。 【【具體實(shí)施方式】】
[0025] 請(qǐng)參閱圖1~3所示，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0026] -、實(shí)驗(yàn)條件
[0027] 1、儀器與試藥
[0028] 超高效液相色譜儀為美國WATERS ACQUITY UPLC H-Class，包括四元溶劑管理器、 自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器以及Empower色譜工作站;玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì) 對(duì)照品為美國ChromaDex公司產(chǎn)品；乙睛和甲醇為色譜純，來自Fisher公司；其他試劑均為 分析純。
[0029] 2、流動(dòng)相各組分的體積比為乙腈：甲醇= 9:1。
[0030] 3、本試驗(yàn)選擇445nm作為草莓葉黃素循環(huán)組分吸收波長。
[0031] 4、提取劑為丙酮提取劑。
[0032]二、重復(fù)性、精密度試驗(yàn)
[0033]分別稱取玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)對(duì)照品1 .Omg，加丙酮定容于5ml容量瓶 中，得到濃度為200ug/ml單個(gè)對(duì)照品溶液;分別精密量取單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶， 得到混合對(duì)照品溶液。取上述三種葉黃素組分混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，在超高液相色譜儀中 分別重復(fù)進(jìn)樣5次，以各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation， RSD)，來測(cè)定儀器的性能以及方法的精密型，在超高液相色譜儀中分別重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算 各組分峰面積的RSD來考察方法的重復(fù)性。結(jié)果如表1所示，玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃 質(zhì)3種組分在精密度試驗(yàn)中對(duì)應(yīng)的RSD依次為0.31 %、0.73 %和1.15 %，重復(fù)性測(cè)定中玉米 黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)3種組分對(duì)應(yīng)的RSD依次為0.54%、0.88 %、1.32 %，均小于 2%，表明該方法具有良好的精密度和重復(fù)性。
[0034] 表1三種對(duì)照品的精密度和重復(fù)性(η = 5)
[0035]
[0036] 三、線性關(guān)系及檢出限、定量限測(cè)定
[0037]取上述三種葉黃素組分混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液，在超高液相色譜儀中分別重復(fù)進(jìn)樣 5次，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線 回歸方程以及相關(guān)系數(shù)，以信噪比（S/N)為3所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為檢出限，以信噪比（S/N) 為10所對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度為定量限。結(jié)果如表2所示，從表2中可得，玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán) 氧玉米黃質(zhì)的線性相關(guān)系數(shù)依次為0.9950、0.9995、0.9999，表明3種標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣濃度與 峰面積具有良好的線性關(guān)系，3種標(biāo)準(zhǔn)品的檢出限為0.003-0.0 lyg · ml/1，定量限為0.005_ 0.02yg · ml/1，說明該方法具有較高的靈敏性。
[0038]表2三種對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、
[0039]檢出限及定量限
[0041] 四、回收率試驗(yàn)
[0042] 稱取4份等量的草莓葉片粉末，加到錐形瓶中，其中3份如表3所示分別進(jìn)行3個(gè)水 平的加標(biāo)，余下1份作空白對(duì)照。按前述的草莓葉黃素組分提取方法進(jìn)行提取，測(cè)定4份樣品 的葉黃素循環(huán)組分含量，計(jì)算回收率，同樣試驗(yàn)條件下平行測(cè)定三次。結(jié)果見表3,玉米黃 質(zhì)、紫黃質(zhì)和環(huán)氧玉米黃質(zhì)的平均回收率依次分別為104.94%、97.57 %、96.34%，相對(duì)標(biāo) 準(zhǔn)偏差為0.93 % -1.67 %，結(jié)果可靠且符合分析要求。
[0043] 表3草莓葉葉黃素循環(huán)組分的回收率(n = 3)
[0044]
[0046] 五、具體實(shí)施例實(shí)驗(yàn)
[0047] 實(shí)施例1
[0048] (1)制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)對(duì)照品，加丙酮 得到三種單個(gè)對(duì)照品溶液;再分別精密量取三種單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶中，得到混 合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0049] (2)制備待測(cè)品溶液:用液氮快速正常光照條件下的草莓葉片研磨至粉末，精確稱 取0.1 g，加入5mL丙酮，于4 °C避光浸提5min，低溫超聲提取2min，12000rpm，4 °C離心10min， 取上清液，重復(fù)操作1次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40°C將其蒸干，用丙酮定容至5mL，即 得。
[0050] (3)制定色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱，規(guī)格為2.1mmX50mm，1.7u m的色譜柱;流動(dòng)相為乙腈：甲醇=9:1;流速為0.5ml/min;檢測(cè)波長為445nm;柱溫為30°C， 進(jìn)樣體積：l〇ul。
[0051] (4)進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)(對(duì)儀器進(jìn)行清洗、預(yù)熱等），先對(duì)玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、 環(huán)氧玉米黃質(zhì)混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液注入超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖1所示； 然后待測(cè)品溶液經(jīng)0.22um微孔過濾膜過濾后注入超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如 圖2所示，結(jié)果在正常光照條件下的草莓葉片檢測(cè)到紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)，含 量依次為80.15yg · g-· g-· g-、
[0052] 實(shí)施例2:
[0053] (1)對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備和超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定同實(shí)施例1。
[0054] (2)制備待測(cè)品溶液：用液氮快速強(qiáng)光脅迫后的草莓葉片研磨至粉末，精確稱取 0. lg，加入5mL丙酮，于4°C避光浸提5min，低溫超聲提取2min，12000rpm，4°C離心10min，取 上清液，重復(fù)操作1次，合并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40°C將其蒸干，用丙酮定容至5mL，即 得。
[0055] (3)制定色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱，規(guī)格為2.1mmX50mm，1.7u m的色譜柱;流動(dòng)相為乙腈：甲醇=9:1;流速為0.5ml/min;檢測(cè)波長為445nm;柱溫為30°C， 進(jìn)樣體積：l〇ul。
[0056] (4)進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)（對(duì)儀器進(jìn)行清洗、預(yù)熱等），然后供試品溶液經(jīng) 0.22um微孔過濾膜過濾后注入超高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如圖3所示，結(jié)果在強(qiáng) 光脅迫后的草莓葉片檢測(cè)到紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)，含量依次為53.90yg · g一\ 23.77yg · g_\551.33yg · g_1〇
[0057] 本發(fā)明確定了適用于草莓葉黃素循環(huán)組分測(cè)定的超高效液相法，本方法精密度 高、靈敏度強(qiáng)、重復(fù)性好、回收率高，本發(fā)明的流動(dòng)相組合可以將3種葉黃素循環(huán)組分徹底分 離，且在同一色譜條件下對(duì)草莓中3種葉黃素循環(huán)組分同時(shí)進(jìn)行分離和含量測(cè)定，流動(dòng)相試 劑用量少，方法簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在1~2分鐘內(nèi)就可完成檢測(cè)，大大提高了分析速 度和減少了溶劑消耗;本發(fā)明方法采用未經(jīng)皂化處理工藝步驟，可以提高葉黃素循環(huán)組分 提取效果，因此本發(fā)明是適合草莓葉黃素循環(huán)組分定性和定量分析的最佳方法，為草莓葉 黃素循環(huán)調(diào)控機(jī)制研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。
[0058]雖然以上描述了本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理 解，我們所描述的具體的實(shí)施例只是說明性的，而不是用于對(duì)本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本 領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應(yīng)當(dāng)涵蓋在本發(fā)明的 權(quán)利要求所保護(hù)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法，其特征在于:采用超高效液相色譜法在同一 色譜條件下對(duì)草莓中的3種分別為玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)的葉黃素循環(huán)組分同時(shí) 進(jìn)行含量測(cè)定;該方法包括如下步驟： (1) 制備對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別稱取玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)對(duì)照品，加丙酮得 到三種單個(gè)對(duì)照品溶液;再分別精密量取三種單個(gè)對(duì)照品溶液，置同一容量瓶中，得到混合 對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液； (2) 制備待測(cè)品溶液:用液氮將草莓葉片研磨至粉末，精確稱取0. lg，加入5mL丙酮，于4 °〇避光浸提5min，低溫超聲提取2min，12000rpm，4°C離心10min，取上清液，重復(fù)操作1次，合 并上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40°C將其蒸干，用丙酮定容至5mL，即得； (3) 超高效液相色譜檢測(cè)： 檢測(cè)儀器:超高效液相色譜； 色譜柱:規(guī)格為2.1mm X 100mm，1.7u m的色譜柱； 流動(dòng)相：乙腈與甲醇； 流速:〇.5ml/min; 檢測(cè)波長:445nm; 進(jìn)樣體積：l〇ul; 柱溫：30°C; (4) 測(cè)定：分別取制備獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)液，并采用上述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)， 記錄色譜圖，經(jīng)過色譜儀器自帶軟件積分得到峰面積，計(jì)算得到待測(cè)液中3種葉黃素循環(huán)組 分一玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、環(huán)氧玉米黃質(zhì)的含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種草莓葉黃素循環(huán)組分的測(cè)定方法，其特征在于:所述流動(dòng)相 中各組分的體積比為乙腈：甲醇= 9:1。
【文檔編號(hào)】G01N30/88GK106093264SQ201610571049
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年7月20日
【發(fā)明人】朱海生, 陳敏氡, 溫慶放
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所