本發(fā)明涉及一種酵母菌和以微生物發(fā)酵的方式制備3-吲哚丁酸的方法。

背景技術(shù)：

3-吲哚丁酸（iba）和3-吲哚乙酸（iaa），均是天然存在于植物體內(nèi)的生長素，能促進(jìn)細(xì)胞分裂與細(xì)胞生長，誘導(dǎo)形成不定根，增加座果，防止落果，改變雌、雄花比率等。廣泛應(yīng)用于農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)。3-吲哚丁酸的化學(xué)合成方法已有較多報(bào)道，目前主要以兩種方法，一是由吲哚與γ-丁內(nèi)酯在四氫萘的回流溫度下縮合得到，二是由吲哚與格氏試劑及α-氯代丙腈反應(yīng)，制得3-丁腈吲哚，再由naoh水解并與鹽酸反應(yīng)制得。化學(xué)合成法步驟較多，反應(yīng)需高溫及強(qiáng)酸強(qiáng)堿參與，對環(huán)境污染大。關(guān)于3-吲哚丁酸的生物合成，ludwig-muller等發(fā)現(xiàn)玉米幼苗能將3-吲哚乙酸（iaa）轉(zhuǎn)化為3-吲哚丁酸（iba），根系發(fā)達(dá)的玉米品種比生根能力弱的玉米品種具有更高的將iaa轉(zhuǎn)化為iba的能力（ludwig-müllerj,epsteine.occurrenceandinvivobiosynthesisofindole-3-butyricacidincorn(zeamaysl.)[j].plantphysiology,1991,97(2):765-770.）；用標(biāo)記的iaa供給無菌培養(yǎng)的擬南芥幼苗，產(chǎn)生一種與ibafr值相似的標(biāo)記化合物，隨后iba含量很快下降，形成iba結(jié)合物（ludwig-müllerj,epsteine.indole-3-butyricacidinarabidopsisthalianaiii.invivobiosynthesis[j].plantgrowthregulation,1994,14(1):7-14.）。由于iba比iaa具有相對較好的穩(wěn)定性，具有更好的促生能力，因此利用微生物將iaa轉(zhuǎn)化為iba是一條可行的途徑。關(guān)于微生物發(fā)酵制備iba未見相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是從植株根際土壤分離篩選一種具備合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌。

本發(fā)明的另一目的是提供一種通過上述酵母菌發(fā)酵制備3-吲哚丁酸的方法。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：

具備合成3-吲哚丁酸功能的酵母菌，拉丁名稱為saccharomycessp.，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2017年4月11日，保藏編號：cgmccno.14011。

所述的酵母菌在發(fā)酵制備3-吲哚丁酸上的應(yīng)用，其特征在于該酵母菌進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，添加培養(yǎng)基和底物3-吲哚乙酸，制備3-吲哚丁酸。

所述的酵母菌在發(fā)酵制備3-吲哚丁酸上的應(yīng)用，其特征在于將該酵母菌接種到含合成-吲哚乙酸的底物的發(fā)酵液中，進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，從而合成3-吲哚丁酸。

所述的酵母菌在發(fā)酵制備3-吲哚丁酸上的應(yīng)用，其特征在于將該酵母菌接種到產(chǎn)-吲哚乙酸的微生物發(fā)酵液中，補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)繼續(xù)發(fā)酵，從而合成3-吲哚丁酸。

本發(fā)明所述的酵母菌具備合成3-吲哚丁酸功能，發(fā)酵制備iba條件溫和，環(huán)境友好，解決了化學(xué)合成工藝復(fù)雜，環(huán)境污染等問題。

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1：

本發(fā)明酵母菌saccharomycessp.，詳細(xì)分離篩選步驟如下：

（1）樣品采集：采取根系發(fā)達(dá)的植株根際土壤。

（2）菌株分離：稱取上述土樣10g置于盛有100ml無菌水的250ml滅菌三角瓶中，置28℃搖床中振蕩半小時(shí)得懸浮液，再用無菌水逐步將懸浮液稀釋至10^-3，10^-4，10^-5三種稀釋度待用，分別取0.1ml上述稀釋懸浮液涂布于含固體pda培養(yǎng)基平板，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，置28℃溫箱中培養(yǎng)一周，長出的菌株純化后做后續(xù)試驗(yàn)。固體pda培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂15~20、自來水1000毫升、自然ph。

（3）具有合成iba功能的菌株篩選：將步驟（2）中得到的各個(gè)菌株分別接種于有50ml液體pda培養(yǎng)基的三角瓶中，并置于28℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)2d后，按200mg/kg的量添加iaa到液體培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2d后離心取上清液通過液相色譜測定是否有iba，選取有iba的菌株為具有合成iba功能的菌株。液體pda培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、自來水1000毫升、自然ph。

（4）菌株合成iba性能鑒定：將步驟（3）分離到的具有合成iba功能的菌株轉(zhuǎn)接到盛有50ml液體pda培養(yǎng)基的250ml三角瓶中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，添加3-吲哚乙酸iaa繼續(xù)培養(yǎng)后測定iba得率。不同時(shí)間重復(fù)3次以上操作。結(jié)果表明，具有合成iba功能的菌株的iba得率為添加iaa含量的65%-70%，性能穩(wěn)定。

（5）具有合成iba功能的酵母菌有如下特征：

菌落形態(tài)特征：液體pda培養(yǎng)基上菌落為乳白色，有光澤，平坦，邊緣整齊。

（6）菌株的分類鑒定：利用its序列鑒定，即酵母its序列通用引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增并測序，再與國際ncbigenbank（www.ncbi.nlm.nih.gov）核苷酸數(shù)據(jù)庫比對，核苷酸同源性為99%，結(jié)合菌落、菌體形態(tài)特征鑒定為酵母菌（saccharomycessp.）。于2017年4月11日送交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)登記保藏，其保藏號為cgmccno.14011，自編號：ly1。

實(shí)施例2：

具有合成iba功能的酵母菌連續(xù)培養(yǎng)在合成iba上的應(yīng)用。

（1）從斜面保藏管接種一環(huán)酵母菌ly1到50ml液體pda培養(yǎng)基中，置28℃搖床中，150rpm振蕩培養(yǎng)到指數(shù)期，作為一級種子液；液體pda培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、自來水1000毫升、自然ph，

（2）取步驟（1）中得到的種子液，以5%體積的接種量接種到20l發(fā)酵罐的液體pda培養(yǎng)基中，28℃通氣培養(yǎng)到指數(shù)期，作為二級種子液，

（3）將二級種子液接種到200l發(fā)酵罐的ypda培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至穩(wěn)定期，添加重量百分濃度為0.8%濃度的3-吲哚乙酸溶液（3-吲哚乙酸用飽和碳酸氫鈉溶液溶解或少量乙醇溶解），調(diào)節(jié)ph至6.5，溫度28℃，發(fā)酵罐壓力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，發(fā)酵12h后將溶氧降低到0-10mg/kg，繼續(xù)培養(yǎng)12h，放出發(fā)酵液，補(bǔ)充ypda培養(yǎng)基按以上操作參數(shù)進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。ypda培養(yǎng)基為：20g蛋白胨、10g酵母浸粉、2g葡萄糖，適量水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l，

（4）放出的發(fā)酵液進(jìn)行減壓濃縮至原體積的五分之一加酸調(diào)節(jié)ph至灰白色結(jié)晶析出，抽濾、水洗后烘干即的iba，iba得率為iaa添加量的68%，提取iba后的濾液調(diào)節(jié)ph至中性可制成液體肥料，無廢棄物排放，安全環(huán)保。

實(shí)施例3：

該具有合成iba功能的菌株種到產(chǎn)iaa的微生物發(fā)酵液中合成iba的應(yīng)用。

（1）微生物發(fā)酵iaa：將產(chǎn)iaa菌株-腸桿菌ly6（保藏編號cgmccno9539）接種到培養(yǎng)基（胰蛋白胨0.8%、酵母膏0.4%、nacl0.7%、葡萄糖2%、果糖0.7%、l-色氨酸0.12%、丙酮酸鈉0.02%、硫酸銅0.01%、水1l，ph7.2），發(fā)酵完成后滅菌15分鐘，滅菌后的發(fā)酵液用于該具有合成iba功能的酵母菌合成iba。

（2）酵母菌種子液制備：從斜面保藏管接種一環(huán)該酵母菌ly1到50ml液體pda培養(yǎng)基中，置28℃搖床中，150rpm振蕩培養(yǎng)到指數(shù)期，作為一級種子液；將一級種子液以5%體積的接種量接種到20l發(fā)酵罐的液體pda培養(yǎng)基中，28℃通氣培養(yǎng)到指數(shù)期，作為二級種子液。液體pda培養(yǎng)基配方如下：馬鈴薯200克、葡萄糖20克、自來水1000毫升、自然ph。

（3）ypda培養(yǎng)基濃縮液制備：分別稱取100g蛋白胨、50g酵母浸粉、10g葡萄糖，加入適量水溶解后加入75ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l，配制成10倍ypda培養(yǎng)基濃縮液，滅菌后裝入發(fā)酵罐補(bǔ)料系統(tǒng)。

（4）二次發(fā)酵：將步驟（2）的酵母菌二級種子液和步驟（3）的ypda培養(yǎng)基濃縮液分別按2%~5%的比例（v:v）泵入步驟（1）已滅菌的發(fā)酵液中，調(diào)節(jié)ph至6.5，溫度28℃，發(fā)酵罐壓力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，發(fā)酵20h后將溶氧降低到0-10mg/kg，在ypda培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，放出二次發(fā)酵液。ypda培養(yǎng)基為：20g蛋白胨、10g酵母抽提物、2g葡萄糖，適量雙蒸水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l。

（5）放出的發(fā)酵液進(jìn)行減壓濃縮至原體積的四分之一加酸調(diào)節(jié)ph至灰白色結(jié)晶析出，抽濾、水洗后烘干即得iba。提取iba后的濾液調(diào)節(jié)ph至中性可制成液體肥料，無廢棄物排放，安全環(huán)保。

實(shí)施例4：

該具有合成iba功能的菌株接種到含合成iaa的底物的培養(yǎng)基中，進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，從而合成iba的應(yīng)用。

（1）酵母菌一級二級種子液制備：方法同實(shí)施例2的（1）和（2）。

（2）含合成iaa的底物的培養(yǎng)基配制：l-色氨酸2%、丙酮酸鈉0.2%、硫酸鎂0.01%、20g蛋白胨、10g酵母浸粉、2g葡萄糖，適量水溶解后加入15ml0.2%腺嘌呤溶液，定容到1l（其中l(wèi)-色氨酸為合成iaa的底物）。

（3）將二級種子液接種到200l發(fā)酵罐的含合成iaa的底物的培養(yǎng)基中，維持ph至6-7，溫度28℃，發(fā)酵罐壓力0.05-0.08mpa、溶氧40-80mg/kg，攪拌速度160r/min，發(fā)酵36h后將溶氧降低到0-10mg/kg，攪拌轉(zhuǎn)速60r/min繼續(xù)培養(yǎng)12h，放出發(fā)酵液

（4）放出的發(fā)酵液的濃縮結(jié)晶得iba，濾液處理同實(shí)施例2的（4）。

上述實(shí)施例是對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于上述實(shí)施例。對于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會有改變之處，凡基于上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。