專利名稱：降解吲哚丁酸菌株的篩選分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種降解吲哚丁酸菌株的篩選分離方法。
背景技術(shù)：
吲哚丁酸(Indolebutyric acid，IBA)是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，分子式為C2H13O2N2，分子量為203.2，純品為白色或微黃色晶體，稍有異臭，熔點(diǎn)為123℃-125℃。不溶解于水和氯仿，能溶于醇、醚和丙酮等有機(jī)溶劑。劑型為92％粉劑。應(yīng)用IBA促進(jìn)花卉、樹苗、藥材的根的生長發(fā)育已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上不可缺少的重要技術(shù)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全國每年生產(chǎn)IBA質(zhì)量達(dá)100噸。目前，國際上暫時沒有很好的藥劑代替。IBA對人畜低毒大鼠口服LD50為100mg·kg-1；大鼠皮膚注射LD50為5000mg·kg-1，小鼠為1760mg·kg-1；小鼠腹膜注射LD50為150mg·kg-1。呼吸道攝入及皮膚、眼睛接觸會引起相應(yīng)部位的過敏。
由于IBA性質(zhì)穩(wěn)定，不易降解，比較穩(wěn)定，不傳導(dǎo)，處理后大部分進(jìn)入土壤中，只有少部分被植物吸收；進(jìn)入環(huán)境后不可避免會產(chǎn)生污染，在土壤中殘留的IBA降解問題一直未解決。
當(dāng)前，國際上解決土壤植物生長調(diào)節(jié)劑殘量的方法主要集中在(1)保證植物生長調(diào)節(jié)劑最佳生理效應(yīng)的前提下，減少生長調(diào)節(jié)劑的用量。有2篇報(bào)道指出(潘瑞熾、韓寒冰，表面活性劑“粵輔1號”提高水稻植株對赤霉素的吸收和利用研究，中國水稻科學(xué)，1993，3153-158；何國振、潘瑞熾，用表面活性劑提高稻苗葉片對6-BA的吸收和利用的研究，中國水稻科學(xué)，1994，4239-242)，在生長調(diào)節(jié)劑赤霉素或芐基腺嘌呤(6-BA)溶液中加0.05-0.1％表面活性劑，處理水稻，使植株對赤霉素或芐基腺嘌呤的吸收量增加，赤霉素或芐基腺嘌呤的作用效果明顯，由于使用量減少，對土壤的污染也降低；(2)利用微生物降解作用，降解植物生長調(diào)節(jié)劑多效唑處理的土壤中的殘量(裘娟萍，耕地受多效唑農(nóng)藥污染后的再生修復(fù)技木，土壤學(xué)報(bào)，2002，145-51)。但在國內(nèi)外尚未有降解吲哚丁酸微生物菌種的報(bào)道。
一般篩選分離微生物菌種的方法是稱取一定鮮重的土壤，加入去離子水，充分振蕩后，靜置澄清，過濾。取土壤浸汁，加入培養(yǎng)液(含一定濃度的待分解物質(zhì))，30℃、150rpm振蕩培養(yǎng)。定期換新鮮培養(yǎng)液。將分離培養(yǎng)基(牛肉膏30％，蛋白胨10％，NaCl 50％，瓊脂150g，pH7-7.6)倒平板，取菌液100μL均勻涂布，30℃恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑出單菌落接入新鮮的分離培養(yǎng)基中劃線分離3～4次進(jìn)行純化，純化后接斜面培養(yǎng)基4℃保存。
(三)發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種降解IBA的微生物菌種的篩選分離方法。該方法操作簡便，所分離出的菌種能夠明顯降解IBA，減少土壤中的IBA殘留。
本發(fā)明的方法具體包括如下步驟(1)土壤浸汁的制備稱取40-100g土壤，加入100-200ml去離子水，充分振蕩，靜置澄清，過濾，獲得土壤浸汁待用；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入99-200ml配方為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+2-10％IBA、或者配方為0.1％K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+0.04-0.05％NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA的含IBA無機(jī)鹽培養(yǎng)液中30±5℃、150±10rpm條件下振蕩培養(yǎng)4-9天，pH6.0-10.0；2-4天更換一次新鮮培養(yǎng)液，以確保土壤有足夠的營養(yǎng)源，同時可以排除產(chǎn)生的代謝物；培養(yǎng)過程通或不通氧氣；(3)分離細(xì)菌將配方為牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+瓊脂2.0％的分離培養(yǎng)基倒平板，取馴化后的菌液100-200μL均勻涂布，20-35℃培養(yǎng)14-48h；挑出單菌落接入新鮮的平板分離培養(yǎng)基中劃線分離3-4次進(jìn)行純化，純化后接同樣配方的斜面培養(yǎng)基4±2℃保存或分析鑒定菌種。
在上述方法中，步驟(2)的培養(yǎng)基最好為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％NaCl和/或KCl+0.04-0.05％NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA；培養(yǎng)過程最好通入氧氣；其pH范圍最好為7-9。
在本方法中，經(jīng)分離培養(yǎng)基培養(yǎng)后得到一種菌落，革蘭氏染色為陰性，菌落大小為2-3mm，菌落圓形，光滑圓整，邊緣整齊，呈乳白色油狀。單個或成短鏈排列。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)或效果1.由于本發(fā)明采用含氮培養(yǎng)基作為馴化細(xì)菌的基本培養(yǎng)基，促進(jìn)了降解吲哚丁酸菌株的生長，又進(jìn)一步采用有氧、適宜pH條件下培養(yǎng)的方法，提高菌株降解吲哚丁酸的能力，達(dá)到了本發(fā)明的目的。
2.本發(fā)明方法與已有的分離微生物菌種常規(guī)方法相比，無需增加專有設(shè)備，操作簡便。
3.本發(fā)明方法獲得的菌株能安全、有效地降解土壤中的吲哚丁酸含量，為恢復(fù)由吲哚丁酸造成污染的土壤提供有效、簡便的方法。
(四)具體的實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明實(shí)施例1(1)土壤浸汁的制備稱取40g土壤，加入100ml去離子水，充分振蕩，靜置澄清，過濾，獲得土壤浸汁待用；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入99mL配方為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+0.04％NH4Cl+2％IBA的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中30℃、pH7.0、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)9天，每4天更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程通氧氣；(3)分離細(xì)菌將配方為牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+瓊脂2.0％的分離培養(yǎng)基倒平板，取馴化后的菌液100μL均勻涂布，20℃培養(yǎng)14h；挑出單菌落接入新鮮的平板分離培養(yǎng)基中劃線分離3次進(jìn)行純化，獲得所須的菌種，將純化后的菌種接同樣配方的斜面培養(yǎng)基4±2℃保存或分析鑒定菌種。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所獲得的菌種降解IBA能力為58％。
實(shí)施例2(1)土壤浸汁的制備稱取100g土壤，加入200ml去離子水，充分振蕩，靜置澄清，過濾，獲得土壤浸汁待用；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入150mL配方為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.6％KCl++0.05％NH4NO3+8％IBA的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中25℃、160rpm條件下振蕩培養(yǎng)5天，pH9.0；每2天更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程通氧氣；(3)分離細(xì)菌將配方為牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl 50％+瓊脂2.0％的分離培養(yǎng)基倒平板，取馴化后的菌液200μL均勻涂布，35℃培養(yǎng)24h；挑出單菌落接入新鮮的平板分離培養(yǎng)基中劃線分離4次進(jìn)行純化，獲得所須的菌種，將純化后的菌種接同樣配方的斜面培養(yǎng)基4℃±2℃保存或分析鑒定菌種。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所獲得的菌種降解IBA能力為41％。
實(shí)施例3(1)同實(shí)施例1；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入200mL配方為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+8％IBA的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中35℃、140rpm條件下振蕩培養(yǎng)4天，pH6.0；每2天更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程不通氧氣；(3)分離細(xì)菌其它同實(shí)施例2，培養(yǎng)時間為48h。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所獲得的菌種降解IBA能力為15％。
實(shí)施例4(1)同實(shí)施例1；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入99mL配方為0.1％K2HPO4+0.02％Mg2SO4·7H2O+0.5％NaCl+0.04％NH4Cl+10％IBA的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中30℃、pH10、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)9天；每3天更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程不通氧氣；(3)分離細(xì)菌同實(shí)施例1。
經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，所獲得的菌種降解IBA能力為10％。
權(quán)利要求
1.一種降解吲哚丁酸菌株的篩選分離方法，其特征在于包括如下步驟(1)土壤浸汁的制備稱取40-100g土壤，加入100-200ml去離子水，充分振蕩，靜置澄清，過濾，獲得土壤浸汁待用；(2)馴化細(xì)菌取土壤浸汁1mL，加入99-200ml配方為0.1％K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+2-10％ IBA、或者配方為0.1％ K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+0.04-0.05％ NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％IBA的含IBA無機(jī)鹽培養(yǎng)液中30±5℃、150±10rpm條件下振蕩培養(yǎng)4-9天，pH6.0-10.0；2-4天更換一次新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)過程通或不通氧氣；(3)分離細(xì)菌將配方為牛肉膏30％+蛋白胨10％+NaCl50％+瓊脂2.0％的分離培養(yǎng)基倒平板，取馴化后的菌液100-200μL均勻涂布，20-35℃培養(yǎng)14-48h；挑出單菌落接入新鮮的平板分離培養(yǎng)基中劃線分離3-4次進(jìn)行純化，純化后接同樣配方的斜面培養(yǎng)基4±2℃保存或分析鑒定菌種。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)的培養(yǎng)基為0.1％ K2HPO4+0.02％ Mg2SO4·7H2O+0.5-0.6％ NaCl和/或KCl+0.04-0.05％ NH4Cl和/或NH4NO3+2-10％ IBA。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(2)中，培養(yǎng)過程通入氧氣。
4.如權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于步驟(2)中，其培養(yǎng)基的pH范圍為7-9。
全文摘要
降解吲哚丁酸菌株的篩選分離方法，包括土壤浸汁的制備、馴化細(xì)菌和分離細(xì)菌三個步驟，在馴化細(xì)菌步驟中，培養(yǎng)基配方為0.1％K
文檔編號C12Q1/04GK1740336SQ200510037069
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月7日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月7日
發(fā)明者李玲, 趙昕, 李海航 申請人:華南師范大學(xué)