本發(fā)明涉及一種馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于植物檢疫技術(shù)領(lǐng)域，適用于進(jìn)出境馬鈴薯檢疫和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上馬鈴薯黃矮病毒的檢測(cè)。
背景技術(shù)：
馬鈴薯黃矮病毒（potatoyellowdwarfvirus，pydv）是我國檢疫性的馬鈴薯病毒之一，為核型彈狀病毒屬（nucleorhabdovirus）成員，能引起馬鈴薯毀滅性的黃化矮縮病。馬鈴薯黃矮病毒的病毒粒體為桿菌狀或子彈狀，大小約380nm×75nm，核酸為單鏈rna，分子量約為4.3×106。病毒粒體含有20%的類脂，有4～5種結(jié)構(gòu)蛋白。馬鈴薯黃矮病毒侵染雙子葉植物的茄科、菊科、十字花科、唇形科、豆科、蓼科和玄參科植物60余種，自然寄主有馬鈴薯、花煙草、萬壽菊、野菊花、百日菊、白三葉草、長(zhǎng)春花山芥等，其中侵染馬鈴薯引起病株矮縮、黃化，莖的生長(zhǎng)點(diǎn)早期壞死以及塊莖裂等癥狀。目前，馬鈴薯黃矮病毒僅在加拿大、美國有發(fā)生的報(bào)道，我國未有明確發(fā)生的報(bào)道。近年來，隨著越來越多的馬鈴薯種薯從國外輸入，馬鈴薯黃矮病毒隨進(jìn)境種薯傳入的風(fēng)險(xiǎn)越來越高。該病毒一旦傳入，將給我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展帶來巨大影響。因此，研究開發(fā)快速、準(zhǔn)確和靈敏的檢測(cè)技術(shù)，具有極其重要的意義。
國內(nèi)外關(guān)于馬鈴薯黃矮病毒檢測(cè)技術(shù)的研究報(bào)道甚少。當(dāng)前，用于馬鈴薯黃矮病毒檢測(cè)的方法主要有鑒別寄主、電鏡觀察、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定三種方法。鑒別寄主法需要種植專門的指示植物，對(duì)環(huán)境要求較高；電鏡觀察需要昂貴的設(shè)備，且因病毒粒體易變形而導(dǎo)致較難準(zhǔn)確判斷；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法的靈敏度低，結(jié)果易出現(xiàn)假陰性。利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)植物病毒，特異性好、靈敏度高，但該方法在馬鈴薯黃矮病毒上應(yīng)用的報(bào)道極少。關(guān)于tc-rt-pcr技術(shù)檢測(cè)馬鈴薯黃矮病毒，國內(nèi)外至今尚未有報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷和不足，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、靈敏地檢測(cè)馬鈴薯黃矮病毒。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
（一）一種用于馬鈴薯黃矮病毒檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括：
1）上游引物：10μmol/l，引物序列為5’-agacacatatccgacatgcaa-3’；
2）下游引物：10μmol/l，引物序列為5’-ttggcatattcaggaccat-3’；
3）rtbuffer：5×；
4）rna酶抑制因子：40u/μl；
5）反轉(zhuǎn)錄酶：200u/μl；
6）dntps：10mmol/l；
7）pcrmix：2×；
8）馬鈴薯黃矮病毒的陽性對(duì)照樣品；
9）不含馬鈴薯黃矮病毒的陰性對(duì)照樣品；
10）病毒抽提緩沖液：1×；
11）pbst緩沖液：1×；
12）rnase-freeddh2o。
（二）上述馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
1）試管捕捉：將100μl待測(cè)樣品提取液加入pcr管中，4℃包被過夜；
2）反轉(zhuǎn)錄：倒去pcr管中的樣品提取液，先用pbst緩沖液洗管3次，再用rnase-freeddh2o洗管2次，在pcr管中直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；先向pcr管中加入rnase-freeddh2o10μl、下游引物1μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列試劑：5×rtbuffer5μl、濃度為10mmol/ldntps2μl、濃度為40u/μlrna酶抑制因子1μl、濃度為200u/μl反轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
3）pcr反應(yīng)：取步驟2）合成的cdna3μl，按每管加2×pcrmix12.5μl、濃度為10μmol/l上游引物1μl、濃度為10μmol/l下游引物1μl、rnase-freeddh2o7.5μl，使反應(yīng)總體積為25μl；混合后的反應(yīng)液于94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，如此共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后于72℃繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
4）pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)：取pcr反應(yīng)產(chǎn)物10μl，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；含有馬鈴薯黃矮病毒樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為在429bp處出現(xiàn)明亮的dna條帶。
馬鈴薯黃矮病毒是我國重要的檢疫性有害生物。本發(fā)明將試管捕捉和rt-pcr兩種技術(shù)有機(jī)結(jié)合，首先利用試管捕捉病毒粒體，再在pcr管中直接進(jìn)行rt-pcr。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明所提供的馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法優(yōu)點(diǎn)如下：1）特異、準(zhǔn)確：特異性引物的設(shè)計(jì)保證了檢測(cè)結(jié)果的特異性和準(zhǔn)確性，本發(fā)明僅從感染馬鈴薯黃矮病毒的樣品上擴(kuò)增到大小為429bp的目的片段，而從其他病毒樣品及健康馬鈴薯上都未擴(kuò)增到目的片段，同時(shí)本發(fā)明具有良好的靈敏度，完全能夠滿足日常檢測(cè)的需要；2）操作簡(jiǎn)便：本發(fā)明省去了復(fù)雜的rna提取步驟，不僅避免了受植物成分影響造成無法提取高質(zhì)量的rna，而且有效去除了樣品中pcr抑制因子；3）安全：由于無需提取rna，因此操作人員可避免接觸用于rna提取的有毒化學(xué)試劑；4）經(jīng)濟(jì)：與傳統(tǒng)普通rt-pcr相比，本發(fā)明大大節(jié)約了檢測(cè)成本。
附圖說明
圖1為實(shí)施例2的馬鈴薯黃矮病毒檢測(cè)結(jié)果。其中m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp）；1：馬鈴薯黃矮病毒的陽性對(duì)照樣品；2：馬鈴薯黃矮病毒病葉；3：馬鈴薯黃矮病毒的陰性對(duì)照樣品；4：空白對(duì)照。
圖2為實(shí)施例3的特異性測(cè)定結(jié)果。其中m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp）；1：馬鈴薯黃矮病毒（pydv）樣品；2：馬鈴薯a病毒（pva）樣品；3：馬鈴薯m病毒（pvm）樣品；4：馬鈴薯s病毒（pvs）樣品；5：馬鈴薯v病毒（pvv）樣品；6：馬鈴薯x病毒（pvx）樣品；7：馬鈴薯y病毒（pvy）樣品；8：煙草花葉病毒（tmv）樣品；9：馬鈴薯卷葉病毒（plrv）樣品；10：陰性對(duì)照。
圖3為實(shí)施例4的靈敏度測(cè)定結(jié)果。其中m：dna分子量標(biāo)準(zhǔn)（100bp）；1：馬鈴薯黃矮病毒樣品提取液原液；2：10-1稀釋；3：10-2稀釋；4：10-3稀釋；5：10-4稀釋；6：10-5稀釋；7：10-6稀釋；8：10-7稀釋；9：10-8稀釋；10：陰性對(duì)照。
具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的配置（10次檢測(cè)量）
1）上游引物：10μmol/l，引物序列為5’-agacacatatccgacatgcaa-3’，1管（100μl）；
2）下游引物：10μmol/l，引物序列為5’-ttggcatattcaggaccat-3’，1管（100μl）；
3）rtbuffer：5×，1管（100μl）；
4）rna酶抑制因子：40u/μl，1管（20μl）；
5）反轉(zhuǎn)錄酶：200u/μl，1管（20μl）；
6）dntps：10mmol/l，1管（20μl）；
7）pcrmix：2×，1管（100μl）；
8）馬鈴薯黃矮病毒的陽性對(duì)照樣品，1管（1ml）；
9）不含馬鈴薯黃矮病毒的陰性對(duì)照樣品，1管（1ml）；
10）病毒抽提緩沖液：1×，1管（100ml）；
11）pbst緩沖液：1×，1管（100ml）；
12）rnase-freeddh2o，1管（5ml）。
實(shí)施例2：馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法
上述馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
1）試管捕捉：將100μl待測(cè)樣品提取液加入pcr管中，4℃包被過夜；
2）反轉(zhuǎn)錄：倒去pcr管中的樣品提取液，先pbst緩沖液洗管3次，再用rnase-freeddh2o洗管2次，在pcr管中直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；先向pcr管中加入rnase-freeddh2o10μl、下游引物1μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列試劑：5×rtbuffer5μl、濃度為10mmol/ldntps2μl、濃度為40u/μlrna酶抑制因子1μl、濃度為200u/μl反轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
3）pcr反應(yīng)：取步驟2）合成的cdna3μl，按每管加2×pcrmix12.5μl、濃度為10μmol/l上游引物1μl、濃度為10μmol/l下游引物1μl、rnase-freeddh2o7.5μl，使反應(yīng)總體積為25μl；混合后的反應(yīng)液于94℃預(yù)變性5min，然后94℃變性30s，48℃退火45s，72℃延伸1min，如此共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后于72℃繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
4）pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)：取pcr反應(yīng)產(chǎn)物10μl，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果；含有馬鈴薯黃矮病毒樣品的電泳檢測(cè)結(jié)果為在429bp處出現(xiàn)明亮的dna條帶（圖1），否則無。
實(shí)施例3：馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的特異性測(cè)定
1）樣品提取液的制備：分別以馬鈴薯黃矮病毒（pydv）、馬鈴薯a病毒（pva）、馬鈴薯m病毒（pvm）、馬鈴薯s病毒（pvs）、馬鈴薯v病毒（pvv）、馬鈴薯x病毒（pvx）、馬鈴薯y病毒（pvy）、煙草花葉病毒（tmv）、馬鈴薯卷葉病毒（plrv）樣品和健康馬鈴薯葉片為材料，按1:10（w/v）比例加入病毒抽提緩沖液，充分研磨，4℃下10000rpm離心10min，取上清作為樣品提取液；
2）試管捕捉：將100μl待測(cè)樣品提取液加入pcr管中，4℃包被過夜；
3）反轉(zhuǎn)錄：倒去pcr管中中的樣品提取液，先用pbst緩沖液洗管3次，再用rnase-freeddh2o洗管2次，在pcr管中直接進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；先向pcr管中加入rnase-freeddh2o10μl、下游引物1μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列試劑：5×rtbuffer5μl、濃度為10mmol/ldntps2μl、濃度為40u/μlrna酶抑制因子1μl、濃度為200u/μl反轉(zhuǎn)錄酶1μl，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>
4）pcr反應(yīng)：取步驟3）合成的cdna3μl，按每管加2×pcrmix12.5μl、濃度為10μmol/l上游引物1μl、濃度為10μmol/l下游引物1μl、rnase-freeddh2o7.5μl，使反應(yīng)總體積為25μl；混合后的反應(yīng)液于94℃預(yù)變性5min,然后94℃變性30s、48℃退火45s、72℃延伸1min，如此共35個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束后于72℃繼續(xù)延伸10min，反應(yīng)結(jié)束；
5）pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)：取pcr反應(yīng)產(chǎn)物10μl用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）；由圖2可見，僅從馬鈴薯黃矮病毒的樣品上擴(kuò)增到大小為429bp的目的片段，而從其他病毒樣品及健康馬鈴薯上都未擴(kuò)增到目的片段。
實(shí)施例4：馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒的靈敏度測(cè)定
利用健康馬鈴薯葉片提取液將馬鈴薯黃矮病毒（pydv）樣品提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，依次稀釋為10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7和10-8倍，按實(shí)施例2方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用血清學(xué)elisa方法進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的靈敏度。結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒具有良好的靈敏度，可以檢測(cè)到稀釋至10-1倍的馬鈴薯黃矮病毒樣品提取液（圖3），而采用血清學(xué)elisa方法，僅能檢測(cè)到馬鈴薯黃矮病毒樣品提取液原液。
實(shí)施例5：馬鈴薯樣品的實(shí)際檢測(cè)
以口岸進(jìn)境和我國田間采集的馬鈴薯樣品為材料，共60份，按實(shí)施例2方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用普通rt-pcr方法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果從30份進(jìn)境美國馬鈴薯樣品上檢出馬鈴薯黃矮病毒2份，檢出率為6.7%，30份我國田間馬鈴薯樣品上未檢出馬鈴薯黃矮病毒，該結(jié)果與普通rt-pcr方法的測(cè)定結(jié)果完全一致。
sequencelisting
<110>福清出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
<120>一種馬鈴薯黃矮病毒分子檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
<130>
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
agacacatatccgacatgcaa21
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
ttggcatattcaggaccat19