本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中，mir-31-5p與mir-99a-5p區(qū)分活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染中的應用。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病(tuberculosis,tb)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)感染引發(fā)的慢性傳染性疾病，嚴重威脅人類健康。全國第五次結(jié)核病流行病學調(diào)查顯示我國現(xiàn)有超過500萬名成人活動性肺結(jié)核患者。成人感染結(jié)核分枝桿菌后，部分呈現(xiàn)帶菌生存狀態(tài)，并不會發(fā)展為結(jié)核病，稱為結(jié)核潛伏感染者(latenttuberculosisinfection,ltbi)；約5-10％的潛伏感染者會繼續(xù)發(fā)展為活動性結(jié)核病(activetuberculosis,atb)?；顒有苑谓Y(jié)核是指結(jié)核病灶屬于活動期,胸片上常有斑片狀陰影或是結(jié)核空洞,或者播散病灶,說明結(jié)核分枝桿菌繁殖活躍,毒力強。國內(nèi)各地區(qū)流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，基于γ-干擾素釋放試驗(igra)得出的結(jié)核分枝桿菌感染率大約在20％-30％之間，即全國約有3-4億人為結(jié)核分枝桿菌感染者，數(shù)目龐大的無臨床癥狀的結(jié)核潛伏感染者是活動性肺結(jié)核的重要來源。此外，由于結(jié)核潛伏感染的預防性治療方案與活動性肺結(jié)核的抗癆治療方案顯著不同。因此，如何實現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者與活動性肺結(jié)核病者的早期鑒別診斷至關(guān)重要。常用的結(jié)核分枝桿菌感染診斷方法包括傳統(tǒng)的結(jié)核菌素實驗(tst)以及γ-干擾素釋放試驗(igras)，tst方法容易受到卡介苗接種和非結(jié)核分枝桿菌的干擾，結(jié)核分枝桿菌感染診斷不夠明確，更無法區(qū)別結(jié)核潛伏感染和活動性肺結(jié)核。新近推行的igras方法，雖然能夠檢測結(jié)核分枝桿菌感染，但無法區(qū)分結(jié)核桿菌潛伏感染和活動性肺結(jié)核。目前活動性肺結(jié)核的診斷金標準仍然是經(jīng)典的痰涂片染色顯微鏡下查找抗酸桿菌以及結(jié)核桿菌培養(yǎng)法，已有近百年的歷史。這兩種檢測方法的敏感性均不高，痰涂片染色法的敏感性約30％，結(jié)核桿菌培養(yǎng)法的敏感性約60％。痰涂片染色法雖然可以當天出結(jié)果，但不能區(qū)分結(jié)核桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，也不能區(qū)分mtb是活菌還是死菌。結(jié)核桿菌培養(yǎng)法的敏感性雖高一些，但耗時較長，即使快速培養(yǎng)也需要1個月的時間才能得到結(jié)果。另外，對于臨床上大量的涂陰、菌陰的活動性肺結(jié)核患者，金標準檢測方法的應用受到限制，加劇了診斷的困難，給及時治療帶來了阻力。近年來雖然陸續(xù)出現(xiàn)了一些先進的基于核酸擴增的分子生物學檢測技術(shù)(如xpertmtb/rifassay)，但由于受到儀器設(shè)備和診斷費用的限制，還無法全面推廣。因此，現(xiàn)行的結(jié)核病診斷方法或輔助診斷手段都無法實現(xiàn)快速有效的鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性肺結(jié)核，使得臨床上面臨嚴重的治療延誤以及過度治療等問題?；诖耍瑢ふ倚碌幕顒有苑谓Y(jié)核特異標志物，鑒別診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染和活動性肺結(jié)核，已經(jīng)成為結(jié)核病臨床診斷中一項亟待解決的難題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者。本發(fā)明還提供了檢測mir-31-5p或/和mir-99a-5p表達量的物質(zhì)在制備區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者產(chǎn)品中的應用。上述應用中，所述檢測mir-31-5p表達量的物質(zhì)可為下述m1)或m2)：m1)利用定量pcr檢測mir-31-5p表達量所需的試劑和/或儀器；m2)利用rna-seq檢測mir-31-5p表達量所需的試劑和/或儀器；所述檢測mir-99a-5p表達量的物質(zhì)可為下述n1)或n2)：n1)利用定量pcr檢測mir-99a-5p表達量所需的試劑和/或儀器；n2)利用rna-seq檢測mir-99a-5p表達量所需的試劑和/或儀器。m1)可為包含針對mir-31-5p序列的dna探針的assayid*002279，n1)可為包含針對mir-99a-5p序列的dna探針的assayid*000435，assayid*002279和assayid*000435均為美國abi公司產(chǎn)品。上述應用中，所述mir-31-5p表達量可為血液中mir-31-5p的表達量；所述mir-99a-5p表達量可為血液中mir-99a-5p的表達量。所述mir-31-5p表達量具體可為外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達量；所述mir-99a-5p表達量為外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達量。所述m1)和m2)還均可包括數(shù)據(jù)處理裝置1，所述數(shù)據(jù)處理裝置1用于將來自待測對象的mir-31-5p的表達量轉(zhuǎn)換為所述待測對象的診斷值，根據(jù)所述待測對象的診斷值確定所述待測對象是否為活動性肺結(jié)核患者或結(jié)核潛伏感染者。所述n1)和n2)還均可包括數(shù)據(jù)處理裝置2，所述數(shù)據(jù)處理裝置2用于將來自待測對象的mir-99a-5p的表達量轉(zhuǎn)換為所述待測對象的診斷值，根據(jù)所述待測對象的診斷值確定所述待測對象是否為活動性肺結(jié)核患者或結(jié)核潛伏感染者。所述待測對象可為結(jié)核分枝桿菌感染者。本發(fā)明還提供了以檢測mir-31-5p或/和mir-99a-5p作為標志物的區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者的物質(zhì)在制備區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者產(chǎn)品中的應用。上述應用中，所述區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者的物質(zhì)可為x1)或/和x2)：x1)m1)或m2)所述檢測mir-31-5p表達量的物質(zhì)；x2)n1)或n2)所述檢測mir-99a-5p表達量的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了mir-31-5p或/和mir-99a-5p作為區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者的標志物在區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者中的應用。本發(fā)明還提供了區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者的物質(zhì)，為x1)或/和x2)：x1)m1)或m2)所述檢測mir-31-5p表達量的物質(zhì)；x2)n1)或n2)所述檢測mir-99a-5p表達量的物質(zhì)。本發(fā)明還提供了非診斷目的的區(qū)分或輔助區(qū)分活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者的方法，包括檢測待測對象mir-31-5p或/和mir-99a-5p的表達量，根據(jù)mir-31-5p或/和mir-99a-5p的表達量確定待測對象是活動性肺結(jié)核患者還是結(jié)核潛伏感染者。上述方法中，所述待測對象可為結(jié)核分枝桿菌感染者。所述mir-31-5p或/和mir-99a-5p表達量可為血液中mir-31-5p或/和mir-99a-5p的表達量。所述mir-31-5p或/和mir-99a-5p表達量具體可為外周血單個核細胞中mir-31-5p或/和mir-99a-5p的表達量。本發(fā)明中，所述活動性肺結(jié)核患者第一診斷為活動性肺結(jié)核(icd-10：a15.001)，符合以下條件：具有活動性結(jié)核病臨床癥狀、胸部x線有結(jié)核病變、痰培養(yǎng)陽性或連續(xù)兩次以上痰涂片陽性。結(jié)核潛伏感染者可符合以下條件：無任何結(jié)核病臨床癥狀，胸片無異常，結(jié)核菌素皮試tst硬結(jié)直徑大于10mm，γ－干擾素釋放試驗igra檢測陽性。以結(jié)核潛伏感染者為對照、活動性肺結(jié)核患者為疾病患者，mir-31-5p的表達量的曲線下面積auc＝0.923。此時，判定為活動性肺結(jié)核患者的閾值為mir-31-5p的表達水平≤31.6506，敏感性為74.5％、特異度為100％。當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達水平小于或等于31.6506，該檢測對象疑似為活動性肺結(jié)核患者，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達水平大于31.6506，該檢測對象候選為結(jié)核潛伏感染者。以結(jié)核潛伏感染者為對照、活動性肺結(jié)核患者為疾病患者，mir-99a-5p的表達量的曲線下面積auc＝0.871。此時，判定為活動性肺結(jié)核患者的閾值為mir-99a-5p的表達水平≤2.0514，敏感性為70.6％、特異度為90.2％。當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達水平小于或等于2.0514，該檢測對象疑似為活動性肺結(jié)核患者，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達水平大于2.0514，該檢測對象候選為結(jié)核潛伏感染者。實驗證明，2個mirna的auc均大于0.8，且特異性非常好，可用于區(qū)別診斷活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染患者。附圖說明圖1為qpcr驗證mir-31-5p與mir-99a-5p在活動性肺結(jié)核和潛伏感染者間的表達差異，樣本數(shù)均為20例，縱坐標表示表達量，橫坐標表示組別。圖2為差異mirna的擴大樣本(50例)qpcr驗證和roc曲線分析。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑、儀器等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中的活動性肺結(jié)核患者符合以下條件：具有活動性結(jié)核病臨床癥狀、胸部x線有結(jié)核病變、痰培養(yǎng)陽性或連續(xù)兩次以上痰涂片陽性抗結(jié)核治療時間少于30天。結(jié)核潛伏感染者符合以下條件：無任何結(jié)核病臨床癥狀，胸片無異常，結(jié)核菌素皮試tst硬結(jié)直徑大于10mm，γ－干擾素釋放試驗igra檢測陽性。實施例1、mir-31-5p與mir-99a-5p在活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者間具有表達差異1)rna-seq發(fā)現(xiàn)mir-31-5p與mir-99a-5p在活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者間具有表達差異①樣本rna提取：募集活動性肺結(jié)核患者(tb)和結(jié)核潛伏感染者(ltbi)各3例，即tb組和ltbi組，ficoll法分離各患者的外周血單個核細胞(pbmc)，提取外周血單個核細胞總rna，經(jīng)agilent2000分析rna質(zhì)量，符合要求。提取使用的是qiagenmirneasy試劑盒cat：217004。②mirna測序結(jié)果：將6例患者的樣本總rna經(jīng)illuminahiseq2500測序，質(zhì)控結(jié)果提示樣本測序q20、q30均符合要求。rna-seq實驗過程如下：將各樣本總rna使用dnasei消化dna后，用oligod(t)磁珠純化總rna中的mrna，向得到的mrna中加入適量打斷試劑高溫條件下使其片斷化，再以片斷后的rna為模板，合成cdna，經(jīng)過磁珠純化、末端修復、3’末端加堿基a、加測序接頭后，進行pcr擴增，從而完成整個文庫制備工作。構(gòu)建好的文庫用agilent2100bioanalyzer和abisteponeplusreal-timepcrsystem進行質(zhì)量和產(chǎn)量檢測，文庫質(zhì)控合格后進行測序。③組間差異基因分析：將兩組樣本的測序數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)，mir-31-5p與mir-99a-5p在ltbi組的表達量均為tb組的2倍以上。④在測序樣本中進行qpcr(定量pcr)驗證：利用上述各樣本的總rna驗證mir-31-5p和mir-99a-5p在tb組和ltbi組間的表達差異，結(jié)果顯示mir-31-5p和mir-99a-5p的qpcr檢測結(jié)果在兩組樣本中的表達趨勢與rna-seq測序結(jié)果一致。具體見表1。表1.rna-seq測序結(jié)果和qpcr結(jié)果比較qpcr檢測方法如下：mir-31-5p采用abi公司的assayid*002279探針進行檢測，mir-99a-5p采用abi公司的assayid*000435探針進行檢測。1.-80℃冰箱中取出總rna，4℃下解凍，在0.2mlpcr管中按以下比例配置反轉(zhuǎn)錄反應液：試劑成分體積(μl)100mmdntps0.25multiscribereversetranscriptase1.610×reversetranscriptionbuffer2.5rnaseinhibitor(20u/μl)0.35×rtprimer(1.6μl/基因)1.6×3rna+ddh2o15.55(包含100ng總rna)總量252.將pcr管放置于pcr儀，運行以下程序，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：3.按以下比例配置pcr檢測液，加入到96孔反應板中，2×taqmanuniversalpcrbuffer和20×taqmanmicrornaassaymix均為assayid*002279或assayid*000435中試劑：試劑成分體積(μl)2×taqmanuniversalpcrbuffer1020×taqmanmicrornaassaymix1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.25ddh2o7.75總量204.將96孔板放入abiquantstudiotm7熒光定量pcr儀中，運行如下程序：內(nèi)參為u6snrna(abi公司的taqman探針，assayid*001973)，內(nèi)參探針對應的靶序列為：gugcucgcuucggcagcacauauacuaaaauuggaacgauacagagaagauuagcauggccccugcgcaaggaugacacgcaaauucgugaagcguuccauauuuu。2)qpcr驗證mir-31-5p與mir-99a-5p在活動性肺結(jié)核患者和結(jié)核潛伏感染者間的表達差異選取20例活動性肺結(jié)核患者，組成tb組，選取20例結(jié)核潛伏感染者，組成ltbi組，按照步驟1)中qpcr檢測方法檢測mir-31-5p與mir-99a-5p在這兩組間的表達差異，結(jié)果顯示，mir-31-5p和mir-99a-5p的表達量均保持組間差異(p<0.05)，見圖1。將tb組和ltbi組樣本量擴大至每組各50例，對mir-31-5p和mir-99a-5p繼續(xù)進行qpcr檢測(表2)，并進行roc曲線分析(圖2)。表2、mir-31-5p和mir-99a-5p的qpcr檢測結(jié)果(相對表達量×1000)以結(jié)核潛伏感染者為對照組、活動性肺結(jié)核患者為疾病組，對表3中外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達量進行roc曲線分析，曲線下面積auc＝0.923。此時，判定為活動性肺結(jié)核患者的閾值為mir-31-5p的表達水平≤31.6506，敏感性(sensitivity)為74.5％、特異度(specificity)為100％。具體的，當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，根據(jù)上述結(jié)果，得到檢測結(jié)果判定標準如下：當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達水平小于或等于31.6506，該檢測對象疑似為活動性肺結(jié)核患者，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-31-5p的表達水平大于31.6506，該檢測對象候選為結(jié)核潛伏感染者。以結(jié)核潛伏感染者為對照組、活動性肺結(jié)核患者為疾病組，對表3中外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達量進行roc曲線分析，曲線下面積auc＝0.871。此時，判定為活動性肺結(jié)核患者的閾值為mir-99a-5p的表達水平≤2.0514，敏感性為70.6％、特異度為90.2％。具體的，當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，根據(jù)上述結(jié)果，得到檢測結(jié)果判定標準如下：當以結(jié)核感染者作為檢測對象時，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達水平小于或等于2.0514，該檢測對象疑似為活動性肺結(jié)核患者，如果所述檢測對象的外周血單個核細胞中mir-99a-5p的表達水平大于2.0514，該檢測對象候選為結(jié)核潛伏感染者。2個mirna的auc均大于0.8，且特異性非常好，可用于區(qū)別診斷活動性肺結(jié)核和結(jié)核潛伏感染。當前第1頁12