本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，涉及基因的克隆和重組dna技術(shù)，尤其是一種中溫α-淀粉酶及其基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

α-淀粉酶是一種能水解淀粉的內(nèi)切酶，為糖苷水解酶類的第13家族。其能水解淀粉內(nèi)部的α-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生還原糖、低聚糖、麥芽糖和糊精等。α-淀粉酶來源廣泛，微生物發(fā)酵，動、植物提取均可獲得。目前工業(yè)上α-淀粉酶的大規(guī)模生產(chǎn)主要以微生物發(fā)酵進行?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌、米曲霉菌、黑曲霉菌等均可用來生產(chǎn)α-淀粉酶。α-淀粉酶作為一種重要的工業(yè)酶制劑，應(yīng)用十分廣泛，例如食品，發(fā)酵，紡織，造紙業(yè)，制藥業(yè)以及化學藥品工業(yè)等，甚至在臨床、醫(yī)學、分析化學等領(lǐng)域都有重要應(yīng)用。

用于工業(yè)生產(chǎn)α-淀粉酶的菌株長期以來都是人工誘變或自然突變的高產(chǎn)菌株。我國對于α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的選育和研究做了大量工作，從1965年開始就應(yīng)用解淀粉芽孢桿菌bf7658生產(chǎn)α-淀粉酶。高定華等利用x射線、γ射線以及激光等誘變bf7658，使酶活提高到500-600u/ml[高定華：食品與發(fā)酵工業(yè).1986]；鄔顯章等利用硫酸二乙酯、5-氟尿嘧啶和亞硝基胍等誘變bf7658變異株，獲得產(chǎn)酶達477u/ml的高產(chǎn)菌株[鄔顯章：生物工程學報.1985]。而隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們開始利用基因工程來獲得α-淀粉酶的高產(chǎn)菌株。自八十年代以來，國內(nèi)外用于α-淀粉酶生產(chǎn)的基因工程菌相關(guān)研究進展迅速。相較于國外，雖然我國酶制劑工業(yè)快速發(fā)展，但是仍然存在一定差距。

中溫α-淀粉酶是一種適用范圍比較廣泛的α-淀粉酶，其最適反應(yīng)溫度為50-70℃。目前中溫α-淀粉酶市場需求量比較大，但是現(xiàn)有中溫α-淀粉酶生產(chǎn)菌株的生產(chǎn)水平有待提高，亟待研發(fā)出中溫α-淀粉酶的高效表達菌株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種中溫α-淀粉酶及其基因、工程菌(重組菌株)和制備方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述中溫α-淀粉酶的基因工程方法。

本發(fā)明的另一目的提供上述中溫α-淀粉酶及基因工程菌的應(yīng)用。

本發(fā)明從解淀粉芽孢桿菌crvab100(bacillusamyloliquefaciens)中分離得到一種新的中溫α-淀粉酶。

本發(fā)明提供了一種中溫α-淀粉酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示：

本發(fā)明的中溫α-淀粉酶，具有良好的熱穩(wěn)定性以及ph穩(wěn)定性。其最適溫度為60℃，在50-70℃之間剩余酶活達到80％以上，甚至在80℃保溫1h后仍有60％的剩余酶活；其最適ph值為6.0，在ph值5.0-6.5時，相對酶活達到將近80％。

本發(fā)明提供了編碼上述中溫α-淀粉酶。具體地，該基因的基因組序列如seqidno.2所示：

本發(fā)明通過pcr的方法分離克隆了所述中溫α-淀粉酶的編碼基因，dna全序列分析結(jié)果表明，中溫α-淀粉酶的編碼基因全長1452bp。將中溫α-淀粉酶的編碼基因經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)與genbankaccessionnumber為am409180的α-淀粉酶基因相似度達99％，為一新的中溫α-淀粉酶。

本發(fā)明還提供了包含上述中溫α-淀粉酶基因的重組載體，優(yōu)選為包含權(quán)利要求2或3所述中溫α-淀粉酶基因的質(zhì)粒pwb980。所述重組質(zhì)粒pwb980還含有kan抗性基因、p43啟動子序列、spsacb信號肽序列、枯草芽孢桿菌終止子序列；本發(fā)明所述中溫α-淀粉酶基因位于重組質(zhì)粒pwb980的spsacb信號肽序列和枯草芽孢桿菌終止子序列之間。

本發(fā)明還提供了包含上述中溫α-淀粉酶基因的重組菌株，優(yōu)選所述重組菌株為枯草芽孢桿菌，例如，通過改造枯草芽孢桿菌168(b.subtilis)獲得的、含上述中溫α-淀粉酶基因重組菌株zkb(b.subtilis)。本發(fā)明的制備上述基因工程菌的方法，除了將含中溫α-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒(例如，pwb980)導入宿主細胞外，還包括將宿主細胞的基因lytc、spbc、xpf、apre、npre與spo0a敲除，以及將宿主細胞的基因prsa與groesl過量表達。

本發(fā)明還提供了一種制備上述的中溫α-淀粉酶方法，包括以下步驟：

1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養(yǎng)重組菌株使其發(fā)酵，誘導重組中溫α-淀粉酶表達；

3)回收并純化所表達的中溫α-淀粉酶。

其中，優(yōu)選所述宿主細胞為枯草芽孢桿菌，優(yōu)選將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，得到重組菌株。

所述發(fā)酵培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，主要成分包括：20-40g/l的玉米粉，20-40g/l的玉米淀粉，30-50g/l的豆餅粉，0.5-3g/l的氯化鈣，7-9g/l的磷酸氫二鈉。

所述發(fā)酵溫度為36.5℃-38℃，優(yōu)選37℃。

本發(fā)明還提供了上述中溫α-淀粉酶的應(yīng)用。優(yōu)選地，提供上述中溫α-淀粉酶在飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本發(fā)明中的中溫α-淀粉酶，具有良好的熱穩(wěn)定性以及ph穩(wěn)定性。其最適溫度為60℃，在50-70℃之間剩余酶活達到80％以上，甚至在80℃保溫1h后仍有60％的剩余酶活；其最適ph值為6.0，在ph值5.0-6.5時，相對酶活達到將近80％?？蓱?yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域。

本發(fā)明運用基因工程技術(shù)構(gòu)建了含有中溫α-淀粉酶基因的重組質(zhì)粒，并在枯草芽孢桿菌中實現(xiàn)了中溫α-淀粉酶的高效表達。構(gòu)建的中溫α-淀粉酶重組菌株具有較高的應(yīng)用價值，具有很高的產(chǎn)中溫α-淀粉酶的能力，在同等發(fā)酵條件下，較野生菌酶活提高了90％。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中溫α-淀粉酶基因的pcr擴增電泳圖，其中：1、為中溫α-淀粉酶基因片段，2、為dna分子量標準。

圖2為本發(fā)明實施例2中基因敲除原理圖。

圖3為本發(fā)明重組質(zhì)粒pwb980-amy結(jié)構(gòu)示意圖。

圖4為本發(fā)明重組中溫α-淀粉酶最適溫度。

圖5為本發(fā)明重組中溫α-淀粉酶熱穩(wěn)定性。

圖6為本發(fā)明重組中溫α-淀粉酶最適ph值。

圖7為本發(fā)明重組中溫α-淀粉酶ph穩(wěn)定性。

具體實施方式

試驗材料和試劑

1、菌株及載體

表達載體pwb980購自于invitrogen公司；枯草芽孢桿菌株168購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(cicc)。

2、酶類及其它生化試劑

酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自takara公司，連接酶購自invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-l-arabionfuranoside(pnpaf)購自sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行。

實施例1、中溫α-淀粉酶基因的獲得。

解淀粉芽孢桿菌crvab100是在面粉廠附近采集的土壤樣品中分離得到。具體為將土壤樣品溶于無菌水中，經(jīng)富集培養(yǎng)后取合適稀釋梯度涂布于含1％玉米淀粉的平板上，根據(jù)平板上透明圈的大小篩選得到。

提取解淀粉芽孢桿菌crvab100(bacillusamyloliquefaciens)基因組dna：

(1)取0.5-2ml培養(yǎng)菌液，10000rpm，離心30s，盡可能的吸取上清，收集菌體；

(2)ep管中加200μl緩沖液rb重懸，10000rpm離心30s，棄上清；

(3)對于革蘭氏陽性菌：加入120μl溶菌酶，顛倒混勻，37℃水浴30-60min；

(4)12000rpm離心2min，棄上清后將細胞振蕩或者吹打重懸于180μl緩沖液rb中；

(5)加rnasea(25mg/ml)溶液20μl，振蕩混勻，室溫放置5-10min；

(6)加結(jié)合液cb800μl，再加入100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時可能出現(xiàn)絮狀沉淀；

(7)將上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一個吸附柱ac中，吸附柱放入收集管中，13000rpm離心30-60s，棄掉廢液；

(8)加抑制物去除液ir500μl，12000rpm離心30s，棄廢液；

(9)加入700μl漂洗液wb，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；

(10)加入500μl漂洗液wb，12000rpm，離心30s，棄掉廢液；

(11)將吸附柱ac放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液，一面漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)；

(12)取出吸附柱ac，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液eb，室溫放置3-5min，12000rpm離心1min。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min；

(13)得到的dna于-20℃保存。

以上述基因組dna為模板進行pcr擴增中溫α-淀粉酶基因。擴增引物為：上游引物：5’-gcaactcaagcttttgccgtaaatggcacgctgatgcag-3’；下游引物：5’-tgtgctgaagctagcttatttctgaacataaatggagacggacc-3’。pcr擴增得到約1500bp大小的dna片段，該片段回收后與peasy-t3載體進行連接后送測序。經(jīng)過基因測序得到1452bp的基因片段(seqidno.1)，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)與genbankaccessionnumber為am409180的α-淀粉酶基因相似度達99％。

實施例2、宿主菌株枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb的構(gòu)建

所述枯草芽孢桿菌為b.subtilis168改造菌株。包括基因lytc、spbc、xpf、apre、npre、spo0a的敲除，基因prsa、groesl的過量表達。

基因敲除采用ara3的方法(shenghaoliu,keijiendo,katsutoshiara,katsuyaozakiandnaotakeogasawara.introductionofmarker-freedeletionsinbacillussubtilisusingtheararrepressorandthearapromoter.microbiology(2008),154,2562–2570)。其原理圖如圖2。(1)將para-spe重組到枯草芽孢桿菌基因組上。(2)將重組片段up-dn-cat-arar-g轉(zhuǎn)化待敲除菌體(片段up和片段dn分別為待敲除基因g的上游片段和下游片段)，用氯霉素抗性來篩選轉(zhuǎn)化子。(3)將(2)中的轉(zhuǎn)化子進行影印，挑取有氯霉素抗性而沒有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落至裝有5mllb的試管，37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)14h使菌體自身基因組發(fā)生重組，取2μl菌液涂布于壯觀霉素抗性平板。在para-spe中，壯觀霉素基因的表達受阿拉伯糖操縱子的啟動子(para)的調(diào)控，而para受arar蛋白的阻遏調(diào)控，因此只有敲除arar基因，壯觀霉素抗性基因才得以表達。(4)通過菌落pcr驗證轉(zhuǎn)化子。

以基因xpf為例，其余基因均以其方式進行敲除實驗。(1)分別以引物xpf-up-f\r

(5’-gtcattgtggaacataccggtattgg-3’\5’-tctatgatcctcctcatttttggcaaataaaaaac-3’)、xpf-f\r

(5’-ccagtccgcacgaaaactgaatgaataaatgcaagacttactatttgaatataaacg-3’\5’-ggcaagtgatcgattcatttcttcctg-3’)、xpf-dn-f\r

(5’-ttttttatttgccaaaaatgaggaggatcatagatgaaagcttgtcatacgtttgccac-3’\5’-gttgaactaatgggtgctttagttgaagaattgatctggaaacaaatcaaaatataagg-3’)和cr-f\r

(5’-tcttcaactaaagcacccattagttc-3’\5’-ttattcattcagttttcgtgcggac-3’)通過pcr方法擴增出基因片段up(xpf基因上游片段)、xpf、dn(xpf基因下游片段)和cat-arar(氯霉素抗性基因和arar蛋白基因合成片段)，通過凝膠電泳回收基因片段。(2)通過融合pcr方法擴增出重組片段up-dn-cr-g。(3)融合pcr產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。通過氯霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子。(4)將(3)中的轉(zhuǎn)化子進行影印，挑取有氯霉素抗性而沒有壯觀霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，挑取單菌落至裝有5mllb的試管，37℃、200r/min震蕩培養(yǎng)14h使菌體自身基因組發(fā)生重組，取2μl菌液涂布于壯觀霉素抗性平板。(5)挑取轉(zhuǎn)化子單菌落以xpf-yz-f\r

(5’-gagcagcctacgagcttaaccatag-3’\5’-gttttctccgctttttgtttggcaag-3’)為引物進行菌落pcr驗證。

基因過量表達。分別擴增基因prsa以及groels與載體pdl片段連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌。由于質(zhì)粒pdl上有枯草芽孢桿菌基因組上amye基因的同源片段，因此通過同源重組將基因prsa以及groels整合到枯草芽孢桿菌基因組，實現(xiàn)其過量表達。

通過上述技術(shù)手段，最終獲得宿主菌株枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb。

實施例3、中溫α-淀粉酶表達載體pwb980-amy的構(gòu)建

以枯草表達質(zhì)粒pwb980為模板進行pcr擴增載體片段。擴增引物為：上游引物：5’-catttatgttcagaaataagctagcttcagcacaattccaag-3’；下游引物為：5’-cagcgtgccatttacggcaaaagcttgagttgcgcctcc-3’。pcr擴增得到約3738bp大小的載體dna片段，片段回收后與上述中溫α-淀粉酶基因片段進行多聚物融合pcr(youc,zhangxz,zhangyh(2012)simplecloningviadirecttransformationofpcrproduct(dnamultimer)toescherichiacoliandbacillussubtilis.applenvironmicrobiol78:1593–1595)，融合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌b.subtilis168感受態(tài)細胞，涂布在含卡那霉素(25μg/ml)的lb平板上，挑選陽性轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒測序驗證，確定成功獲得重組質(zhì)粒pwb980-amy。

實施例4、表達載體pwb980-amy轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb。

枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb感受態(tài)細胞制備方法如下所述：

(1)接種枯草芽孢桿菌(b.subtiliszkb)于5mllb培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。

(2)取2.5ml過夜培養(yǎng)物接入40ml(lb+0.5m山梨醇)中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)至od600為0.85-0.95之間。

(3)將菌液冰水浴10min，然后5000g，4℃離心5min，收集菌體。

(4)用50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基(0.5m山梨醇，0.5m甘露醇，10％葡萄糖)重懸菌體，5000g，4℃離心5min，去上清，如此漂洗4次。

(5)將洗滌后的菌體重懸于1ml電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，分裝于ep管，每管分裝60μl。

轉(zhuǎn)化條件如下所述：

(1)將50ng質(zhì)粒dna(1-8μl)加入到60μl感受態(tài)細胞中，冰上孵育2min，加入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯(1mm)中，電擊。電轉(zhuǎn)化參數(shù)設(shè)置：2.0kv、1mm、電擊1次。

(2)電擊完畢立即加入1ml復(fù)蘇培養(yǎng)基(lb+0.5m山梨醇+0.38m甘露醇)

(3)37℃搖床振蕩培養(yǎng)3h，培養(yǎng)物涂布在lb平板上，37℃培養(yǎng)24-36h，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb/pwb980-amy。

實施例5、重組枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb/pwb980-amy獲取中溫α-淀粉酶的方法。

將實施例3中獲得的重組枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb/pwb980-amy和解淀粉芽孢桿菌bacillusamyloliquefacienscrvab100(野生菌)劃線活化?；罨囵B(yǎng)基為lb平板。挑取單菌落至裝有25mllb的250ml搖瓶中，37℃，220rpm震蕩培養(yǎng)16-18小時，培養(yǎng)物作為種子液。

將上述種子液按照2％(v/v)接種量接種于裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500搖瓶中，37℃，220rpm振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵76h。

上述發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：玉米粉含20g/l的玉米粉，20g/l的玉米淀粉，30g/l的豆餅粉，0.5g/l的氯化鈣，8g/l的磷酸氫二鈉，其余為水。

取上述搖瓶發(fā)酵液，12000rpm離心10min去除沉淀，測量上清液中的酶活。酶活力單位定義：1g固體酶粉或1ml液體酶，于60℃、ph6.0條件，1h液化1g可溶性淀粉，即為1個酶活力單位，以u/g或u/ml表示(中華人民共和國國家標準，gb8275-2009)。

結(jié)果表明，發(fā)酵72小時，重組枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb/pwb980-amy的酶活達到831u/ml，而野生菌酶活為436u/ml，重組枯草芽孢桿菌b.subtiliszkb/pwb980-amy的酶活比野生菌提高近90％。

實施例6、重組中溫α-淀粉酶的酶學性質(zhì)分析。

(1)溫度對本發(fā)明中溫α-淀粉酶酶活力的影響

①最適溫度的測定：在ph6.0條件下，在不同溫度下測定酶活，最高酶活力定為100％。結(jié)果表明(圖4)，重組中溫α-淀粉酶的最適溫度為60℃，在50-70℃之間相對酶活為80％以上。

②熱穩(wěn)定性的測定：重組中溫α-淀粉酶分別在不同溫度下保溫2h，每隔20min在ph6.0條件下測定其殘余酶活力，未保溫的酶活力定為100％。結(jié)果表明(圖5)，重組中溫α-淀粉酶在50-70℃條件下保溫2h，剩余酶活在80％以上，甚至在80℃保溫1h后仍有60％的剩余酶活，說明該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

(2)ph對本發(fā)明中溫α-淀粉酶酶活力的影響

①最適ph的測定：在60℃條件下，在不同ph下測定酶活，最高酶活力定為100％。結(jié)果表明(圖6)，重組中溫α-淀粉酶最適ph為6.0，在ph5.5-6.5之間相對酶活達到80％以上。

②ph穩(wěn)定性的測定：將重組酶在不同ph條件下在60℃保溫1h，測定其剩余酶活力，相應(yīng)ph下未保溫的酶活力定為100％。結(jié)果表明(圖7)，重組中溫α-淀粉酶在ph5.5-6.5范圍內(nèi)剩余酶活力達到80％以上，說明該酶具有良好的ph耐受性。

當然，本發(fā)明還可以有多種實施例，在不背離本發(fā)明精神及其實質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明的公開做出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍。

<110>北京科為博生物科技有限公司

<120>一種中溫α-淀粉酶及其基因和應(yīng)用

<160>2

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<213>解淀粉芽孢桿菌crvab100（bacillusamyloliquefaciens）

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dlgefqqkgtvrtkygtkselqdaigslhsrnvqvygdvvlnhkagadatedvtavevnp120

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<213>解淀粉芽孢桿菌crvab100（bacillusamyloliquefaciens）

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