本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用金針菇制備降血糖肽的方法。

背景技術(shù)：

目前，糖尿病已成為繼腫瘤、心血管疾病之后嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的慢性病，是威脅人類(lèi)健康的三大慢性疾病之一，餐后高血糖是糖尿病的主要風(fēng)險(xiǎn)因子，α－葡萄糖苷酶抑制劑能通過(guò)抑制小腸上皮絨毛膜刷狀緣上α－葡萄糖苷酶的活性，減少食物中碳水化合物的消化，延緩葡萄糖的生成，在降低餐后血糖中具有重要作用。目前用于臨床治療的α-葡萄糖苷酶抑制劑，多為化學(xué)合成，長(zhǎng)期使用對(duì)人體能產(chǎn)生一定的副作用，如損害肝臟，導(dǎo)致胃腸氣脹和腸功能紊亂等。

生物活性肽是源于蛋白質(zhì)的多功能化合物，在生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)節(jié)作用，有促進(jìn)免疫、激素調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血壓、降血脂、降血糖等作用，并具有易消化、安全性高的特點(diǎn)，是極具發(fā)展前景的功能因子。從天然蛋白中提取制備具有營(yíng)養(yǎng)性和生理活性的功能肽，能夠有效的提高富含蛋白的食品及農(nóng)產(chǎn)品附加值。

金針菇不僅味道鮮美，同時(shí)具有一定的保健功能，經(jīng)常食用可以提高智力，抗疲勞，抗菌消炎等作用。金針菇富含鋅、鉀，鉀可以控制血糖的升高，鋅可以增加胰島素原轉(zhuǎn)化為胰島素的能力，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)葡萄糖的利用，抑制血糖的升高。金針菇也可抑制血脂升高，降低膽固醇，防治糖尿病心腦血管疾病，降低糖尿病并發(fā)疾病的發(fā)病率。

我國(guó)是金針菇生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，隨著金針菇工廠化生產(chǎn)的普及，金針菇的產(chǎn)量增多，但金針菇深加工技術(shù)落后，缺乏高附加值的產(chǎn)品，不利于金針菇產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。金針菇蛋白質(zhì)含量高，氨基酸含量非常豐富，目前關(guān)于金針菇蛋白酶解制備生物活性肽的研究不多，有研究采用金針菇制備抗菌肽。

201610381719.3的發(fā)明《一種金針菇提取物及其制備方法與應(yīng)用》告知了一種金針菇提取物的制備方法，金針菇以水提、醇沉制得金針菇提取物；該金針菇提取物中主要包括多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明，該金針菇提取物能抑制體外α糖苷酶的活力。體內(nèi)試驗(yàn)表明，金針菇提取物可以明顯降低2型糖尿病大鼠的血糖，調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗，降低血清游離脂肪酸水平，增加肝糖原、肌糖原儲(chǔ)備，修復(fù)受損胰腺，有明顯的治療2型糖尿病作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種成本低、效果好的利用金針菇制備降血糖肽的方法。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種利用金針菇制備降血糖肽的方法，包括以下步驟：

1)、將含水量≤15％的金針菇干粉(能過(guò)60目的篩)與質(zhì)量濃度為0.4％～0.6％的氫氧化鈉水溶液按1：11～13的重量比混合(金針菇干粉被溶解)后，50～70℃水浴1.5～2.5h，取上清液，調(diào)節(jié)上清液ph值至4±0.5；將調(diào)節(jié)ph值后的上清液冷凍離心，得沉淀(為金針菇蛋白沉淀)；

2)、將步驟1)所得的沉淀與水按照1:3～5的重量比混合后，調(diào)節(jié)ph值至7～7.5，然后升溫至45～50℃，再加入沉淀重量1％的中性蛋白酶于震蕩條件進(jìn)行酶解反應(yīng)，酶解溫度為45～50℃，酶解反應(yīng)時(shí)間為3～4h；

3)、將步驟2)所得的酶解反應(yīng)產(chǎn)物于5～10min內(nèi)升溫至95～100℃，保溫10～15min，然后自然冷卻至室溫，離心，得酶解液；

4)、將步驟3)所得的酶解液于0.1～0.2mpa的工作壓力和20～45℃的工作溫度下，采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，得到超濾酶解液，所述超濾膜的截留分子量為3kda；

5)、將超濾酶解液進(jìn)行噴霧干燥，得金針菇降血糖肽粉。

作為本發(fā)明的利用金針菇制備降血糖肽的方法的改進(jìn)：步驟2)中：中性蛋白酶的酶活力為100u/mg；震蕩頻率為150～200r/min。

作為本發(fā)明的利用金針菇制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟1)中的冷凍離心為：將調(diào)節(jié)ph值后的上清液在3～5℃的溫度下于7000～9000r/min離心10～20min。

作為本發(fā)明的利用金針菇制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟3)的離心為：在3～5℃的溫度下于2500～3500r/min離心15～25min，所得的上清液即為酶解液。

作為本發(fā)明的利用金針菇制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：所述步驟5)的噴霧干燥為：進(jìn)風(fēng)溫度控制在170～190℃(較佳為180℃)，出風(fēng)溫度控制在90～100℃(較佳為95℃)。

作為本發(fā)明的利用金針菇制備降血糖肽的方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

所述步驟1)中，將金針菇干粉與質(zhì)量濃度0.5％的氫氧化鈉水溶液按1：12的重量比混合后，60℃水浴2h，取上清液，調(diào)節(jié)上清液ph值至4，然后4℃、8000r/min下離心15min，得沉淀。

在本發(fā)明中，室溫一般指10～30℃。

本發(fā)明的利用金針菇制備功能肽(降血糖肽)的方法，具有如下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

1、本發(fā)明所制備的金針菇功能肽是經(jīng)生物酶水解而得，具有強(qiáng)抑制a-葡萄糖苷酶活性的作用，對(duì)高血糖患者具有輔助治療作用，安全、無(wú)毒副作用。

2、本發(fā)明以金針菇原料，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的技術(shù)轉(zhuǎn)化，可以有效提高金針菇產(chǎn)品的利用價(jià)值，對(duì)繼續(xù)促進(jìn)農(nóng)業(yè)提質(zhì)增效具有重要意義。

3、本發(fā)明方法通過(guò)最佳制備工藝條件的選擇，得出的最佳制備方法，并通過(guò)超濾膜處理技術(shù)，最大限度選擇了具有優(yōu)異活性的肽段，有效增強(qiáng)了活性肽的含量。

4、本發(fā)明的產(chǎn)品可以作為藥品、保健食品、食品、食品添加劑、藥物增效劑等，工藝科學(xué)合理，操作簡(jiǎn)單，具有較強(qiáng)的工業(yè)實(shí)施性。

本發(fā)明的金針菇降血糖肽的服用方式為口服，用量約為4～5g/天.人。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。

以下案例中的金針菇干粉含水量≤15％，能過(guò)60目的篩。

實(shí)施例1、一種利用金針菇制備降血糖肽的方法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)、稱(chēng)取金針菇干粉2kg，加24kg的0.5％的氫氧化鈉水溶液混合后，60℃提取2h，取上清液，用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)上清液ph值至4.0，8000r/min冷凍(4℃)離心15min，得沉淀0.5kg，

2)、在步驟1)所得沉淀中加水1.5kg并攪拌均勻，利用0.1mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.0，升溫至45℃，然后加入中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，于震蕩條件下(180r/min)45℃酶解反應(yīng)3h；

3)、將步驟2)所得的酶解反應(yīng)產(chǎn)物于10min內(nèi)升溫至95～100℃，保持此溫度15min，自然冷卻至室溫，采用j-6m型大容量冷凍離心機(jī)(beckman公司)在轉(zhuǎn)速3000r/min及4℃條件下離心20min，所得的上清液即為酶解液。

4)、將所述酶解液在0.1～0.2mpa的工作壓力和20～45℃的工作溫度下，采用超濾膜進(jìn)行超濾處理，得超濾酶解液，該超濾膜截留分子量為3kda。

5)、將超濾酶解液噴霧干燥(噴霧干燥的工藝參數(shù)為：進(jìn)風(fēng)溫度控制：180℃，出風(fēng)溫度控制：95℃)，即得金針菇降血糖肽。

該金針菇降血糖肽粉，色澤微黃。將該肽粉配置成3mg/ml的溶液，測(cè)得對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性為60.2％。

備注說(shuō)明：對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性的檢測(cè)方法為(此為常規(guī)技術(shù))：

分別取50μl一定濃度的酶解肽溶液(0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液配置)，100μl10mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液(用0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液配制)，加入酶標(biāo)板中，混勻后，25℃下放置10min。然后加入50μl5mmol/l的pnpg(對(duì)硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷)溶液(用0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液配制)，37℃下培養(yǎng)30min后，加入50μl0.67mol/l的na2co3溶液終止反應(yīng)，測(cè)定405nm下吸光度。該體系稱(chēng)為樣品。

同時(shí)設(shè)置以下3個(gè)體系：對(duì)照、樣品空白、和對(duì)照空白。

對(duì)照：以50μl0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液替代50μl的酶解肽溶液。

樣品空白：以100μl的0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液代替100μl10mg/ml的α-葡萄糖苷酶溶液；

對(duì)照空白：分別以相應(yīng)體積量的0.1mol/l，ph＝6.9磷酸緩沖液代替酶解肽溶液和α-葡萄糖苷酶溶液，抑制率按下式計(jì)算。

實(shí)施例2、一種利用金針菇制備降血糖肽的方法，依次進(jìn)行以下步驟：

1)、稱(chēng)取金針菇干粉5kg，加60kg的0.5％的氫氧化鈉水溶液混合后，60℃提取2h，取上清液，用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)上清液ph值至4.0，8000r/min冷凍(4℃)離心15min，得沉淀1.3kg；

2)、在步驟1)所得沉淀中加水6.5kg并攪拌均勻，利用0.1mol/l的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值為7.5，升溫至50℃，然后加入中性蛋白酶(100u/mg)13.0g，于震蕩條件(180r/min)下50℃酶解反應(yīng)4h；

后續(xù)步驟同實(shí)施例1。

所得的金針菇降血糖肽粉，色澤微黃。配置成3mg/ml的溶液，測(cè)得對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性為62.1％。

對(duì)比例1、將實(shí)施例1步驟2)中的中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，改為酸性蛋白酶(50u/mg)5g，將調(diào)節(jié)ph值為7.0相應(yīng)改為調(diào)節(jié)ph值為4，其余等同實(shí)施例1。所得結(jié)果：

該肽粉配置成3mg/ml的溶液，測(cè)得對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性為9.8％。

對(duì)比例2、取消實(shí)施例1步驟1)中的“用1mol/l的hcl調(diào)節(jié)上清液ph值至4.0”，即，將上清液直接進(jìn)行8000r/min冷凍離心15min；

其余內(nèi)容等同于實(shí)施例1。

所得結(jié)果：離心后，基本無(wú)沉淀，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)相應(yīng)酶解實(shí)驗(yàn)。

對(duì)比例3-1、將實(shí)施例1步驟1)中的氫氧化鈉水溶液的重量由24kg改成30kg；其余內(nèi)容等同于實(shí)施例1。

步驟1)所得沉淀為0.46kg。

對(duì)比例3-2、將實(shí)施例1步驟1)中的氫氧化鈉水溶液的重量由24kg改成15kg；其余內(nèi)容等同于實(shí)施例1。

步驟1)所得沉淀為0.43kg。

對(duì)比例4、將實(shí)施例1步驟2)中的中性蛋白酶(100u/mg)5.0g，改為酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶(1：1)10g，將調(diào)節(jié)ph值為7.0相應(yīng)改為調(diào)節(jié)ph值為6，將酶解溫度45℃改為58.62℃。其余等同實(shí)施例1。

該肽粉配置成3mg/ml的溶液，測(cè)得對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制活性為12.6％。

最后，還需要注意的是以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。