本發(fā)明涉及微生物分離培養(yǎng)技術領域，尤其涉及溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基及制備方法。

背景技術：

昆蟲流行病害的發(fā)生需要具備三個重要因子：昆蟲、病原微生物以及適宜的環(huán)境條件，三者相互影響、相互制約。昆蟲疾病的流行主要取決于病原微生物的致病力、生存能力及感染力以及適宜的氣候條件，同時寄主昆蟲的種類、密度、抗病力也是主要影響因子。目前，針對生防菌流行病的研究，主要通過釋放生防菌的孢子，在靶標害蟲種群中流行，以降低蟲口率。流行病發(fā)生以后，生防菌會以較低的濃度在寄主和土壤中宿存，當環(huán)境條件適宜時會再次引發(fā)流行病。這種流行病的復蘇一般是不規(guī)則的，具有偶然性。

玫煙色棒束孢(isariafumosorosea)是一種重要的蟲生真菌。分布廣泛，能寄生同翅目、半翅目、雙翅目、鞘翅目和膜翅目等多種有害昆蟲。玫煙色棒束孢的分生孢子形成于昆蟲體表，容易脫落，且數(shù)量多，重量輕，容易隨風傳播，侵染有害靶標生物，在害蟲種群中形成流行病，是一種優(yōu)良的生防菌。當蟲害發(fā)生時，可通過人工增殖、釋放玫煙色棒束孢分生孢子進行生防控制。而通過監(jiān)測生防區(qū)域空氣中分生孢子數(shù)量與擴散分布情況，對于生防菌防治的評價和指導害蟲防治都具有重要意義。

在時間和空間上進行生防菌群體動態(tài)的分析研究中。其中一個重要內(nèi)容是涉及空氣微生物的采集與分離方法。目前，主要包括兩大類：一是利用微生物采樣器進行采樣檢測，二是通過自然沉降采樣進行檢測。在實驗室條件下玫煙色棒束孢可通過接種的方法可以在許多培養(yǎng)基上培養(yǎng)，但是在溫室條件下，由于與外界環(huán)境交流，并無特殊過濾設施，微生物種類多，需要對靶標真菌的分生孢子采集和分離方法進行研究與改進。特別是需要一種能采集和培養(yǎng)玫煙色棒束孢的選擇性培養(yǎng)基，以檢測空氣中玫煙色棒束孢分生孢子的擴散情況。目前用于監(jiān)測空氣中玫煙色棒束孢分生孢子的方法尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基及制備方法。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基能夠?qū)崿F(xiàn)玫煙色棒束孢分生孢子的采集與快速分離，通過檢測平板上的靶標菌落數(shù)量，對溫室防治區(qū)域的玫煙色棒束孢分生孢子擴散情況和數(shù)量情況進行檢測與定量評估。具有分離快速、檢測效率高的特征，為害蟲防治策略的制定提供科學依據(jù)。

本發(fā)明提供了一種溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基，包括以下質(zhì)量百分含量的組分：馬鈴薯15～20％，蔗糖1.5～2.0％，25～100ug/ml氨芐青霉素，25～100ug/ml潮霉素b，瓊脂1.0～3.0％，和余量的蒸餾水，ph值為7.0～10.0。

本發(fā)明還提供了上述技術方案所述培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

1)將馬鈴薯與蒸餾水混合，煮沸后過濾，得到馬鈴薯濾液；

2)將所述馬鈴薯濾液與蔗糖和瓊脂混合，滅菌；

3)當所述滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，加入氨芐青霉和潮霉素b，再調(diào)節(jié)ph值，得到采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基。

優(yōu)選的是，所述步驟1)中煮沸的時間為20～30min。

優(yōu)選的是，所述步驟1)中過濾為紗布過濾。

優(yōu)選的是，所述步驟2)中滅菌的溫度為121℃，滅菌的時間為30min。

本發(fā)明還提供了上述技術方案所述培養(yǎng)基或上述技術方案所述方法制備的培養(yǎng)基的使用方法，包括以下步驟：

將培養(yǎng)基裝入檢測容器中，在溫室空氣中暴露后，將檢測容器轉(zhuǎn)移至無菌、黑暗環(huán)境中進行培養(yǎng)，分離得到玫煙色棒束孢菌落。

優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)的溫度為28～32℃。

優(yōu)選的是，所述培養(yǎng)的時間為2～3d。

優(yōu)選的是，所述在溫室空氣中暴露的時間為30～60min。

本發(fā)明提供了一種檢測、分離玫煙色棒束孢分生孢子用培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基中的馬鈴薯，蔗糖構(gòu)成了玫煙色棒束孢生長的必需營養(yǎng)成份，氨芐青霉素添加能夠抑制細菌和放線菌的生長，而潮霉素b添加能夠抑制非靶標真菌菌落擴散，從而避免了某些氣生性強的霉菌菌落的蔓延。同時提供的偏堿性條件可有效抑制細菌的生長速度，而較高的培養(yǎng)溫度使目標菌株的分生孢子得到有效萌發(fā)和快速的生長。培養(yǎng)2d后即可通過肉眼觀測比對以及后續(xù)的分子標記方法對防治區(qū)玫煙色棒束孢分生孢子擴散和數(shù)量情況進行檢測與定量評估，具有分離快速、檢測效率高的特征，為害蟲防治策略的制定提供科學依據(jù)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明比較例1提供的溫室大棚分生孢子分離情況結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明比較例1提供的檢測、分離玫煙色棒束孢分生孢子的培養(yǎng)基分生孢子生長情況結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明比較例1提供的馬鈴薯培養(yǎng)基條件下，fz-01菌株分生孢子生長情況結(jié)果圖；

圖4為本發(fā)明比較例2提供的不同培養(yǎng)基對fz-01菌絲生長影響對比結(jié)果圖；

圖5為本發(fā)明比較例2提供的fz-01菌株在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)4d的菌絲生長長度對比結(jié)果圖；

圖6為本發(fā)明比較例2提供的馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)4d的菌絲生長結(jié)果圖；

圖7為本發(fā)明比較例3提供的酸堿度對fz-01菌株菌絲生長影響對比圖；

圖8為本發(fā)明比較例3提供的潮霉素b對fz-01菌株菌絲生長影響結(jié)果圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基，包括以下質(zhì)量百分含量的組分：馬鈴薯15～20％，蔗糖1.5～2.0％，25～100ug/ml氨芐青霉素，25～100ug/ml潮霉素b，瓊脂1.0～3.0％，和余量的蒸餾水，ph值為7.0～10.0。

本發(fā)明的培養(yǎng)基包括質(zhì)量百分含量為15～20％的馬鈴薯，更優(yōu)選為20％。在本發(fā)明中，所述馬鈴薯的作用是為玫煙色棒束孢生長提供必要的碳源、氮源和微量元素。本發(fā)明對所述馬鈴薯的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的馬鈴薯的常規(guī)市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明的培養(yǎng)基包括質(zhì)量百分含量為1.5～2.0％的蔗糖，更優(yōu)選為1.6％。在本發(fā)明中，所述蔗糖的作用是為玫煙色棒束孢生長提供易于分解利用的碳源。本發(fā)明對所述蔗糖的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的常規(guī)蔗糖的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明的培養(yǎng)基包括質(zhì)量百分含量為25～100ug/ml的氨芐青霉素，更優(yōu)選為50ug/ml。在本發(fā)明中，所述氨芐青霉素的作用是抑制培養(yǎng)基中細菌和放線菌的生長。本發(fā)明對所述氨芐青霉素的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的常規(guī)氨芐青霉素的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明的培養(yǎng)基包括質(zhì)量百分含量為25～100ug/ml的潮霉素b，更優(yōu)選為100ug/ml。在本發(fā)明中，所述潮霉素b的作用是抑制真核和原核生物的多肽合成，能有效抑制非靶標真菌以及細菌生長。本發(fā)明對所述潮霉素b的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的潮霉素b的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明的培養(yǎng)基包括質(zhì)量百分含量為1.0～3.0％的瓊脂，更優(yōu)選為2.0％。在本發(fā)明中，所述瓊脂的作用是為培養(yǎng)基提供最好的固體劑，便于經(jīng)常觀察研究。本發(fā)明對所述瓊脂的來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的常規(guī)瓊脂的市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基還包括余量的蒸餾水。蒸餾水的采用本領域技術人員熟知的蒸餾水即可。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)基的ph值優(yōu)選為7.0～10.0，更優(yōu)選為8.0。在本發(fā)明中，所述ph值調(diào)節(jié)，采用化學酸堿試劑naoh和hcl溶液進行調(diào)節(jié)，本發(fā)明對所述naoh和hcl來源沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的常規(guī)naoh和hcl市售產(chǎn)品即可。

本發(fā)明還提供了上述技術方案所述培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：

1)將馬鈴薯與蒸餾水混合，煮沸后過濾，得到馬鈴薯濾液；

2)將所述馬鈴薯濾液與蔗糖和瓊脂混合，滅菌；

3)當所述滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，與氨芐青霉和潮霉素b素混合，再調(diào)節(jié)ph值，得到檢測、分離玫煙色棒束孢分生孢子的培養(yǎng)基。

本發(fā)明將馬鈴薯與蒸餾水混合，煮沸后過濾，得到馬鈴薯濾液。在本發(fā)明中，所述煮沸的時間為20～30min，更優(yōu)選為25min。在本發(fā)明中，所述過濾為紗布過濾，更優(yōu)選為雙層紗布過濾。

得到馬鈴薯濾液后，本發(fā)明將所述馬鈴薯濾液與蔗糖和瓊脂混合，滅菌。在本發(fā)明中，所述滅菌的溫度為121℃，滅菌的時間為30min。

滅菌后，本發(fā)明優(yōu)選在滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，與氨芐青霉和潮霉素b素混合，后調(diào)整培養(yǎng)基ph值，得到檢測、分離玫煙色棒束孢分生孢子的培養(yǎng)基。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)基的ph值為7.0～10.0，通過naoh和hcl溶液來調(diào)節(jié)ph值，更優(yōu)選ph值為8.0。

本發(fā)明還提供了上述技術方案所述培養(yǎng)基或上述技術方案所述方法制備的培養(yǎng)基的使用方法，包括以下步驟：

將培養(yǎng)基裝入檢測容器中，在溫室空氣中暴露后，將檢測容器轉(zhuǎn)移至無菌、黑暗環(huán)境中進行培養(yǎng)，分離得到玫煙色棒束孢菌落。

本發(fā)明所述檢測容器優(yōu)選放置在具有代表性位置的采樣點處，本發(fā)明對所述采樣點的數(shù)量和位置沒有特殊的限定，采樣點可依據(jù)具體采樣空間設置。具體地，在本發(fā)明實施例中，設置5個采樣點，即溫室內(nèi)墻角對角線交點為一采樣點，該交點與四墻角連線的中點為另外4個采樣點。

在本發(fā)明中，所述分離優(yōu)選通過每天觀察菌落情況，與標準樣品進行比對，人工分離出玫煙色棒束孢分生孢子。

本發(fā)明對所述檢測容器沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的細菌采集裝置即可，如玻璃培養(yǎng)皿等。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的溫度為28～32℃，更優(yōu)選為30℃。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)的時間為2～3d，更優(yōu)選為2d。在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)時間的限定有利于菌落更準確的觀察。

在本發(fā)明中，所述暴露在溫室空氣中的時間為30～60min，更優(yōu)選為30min。

本發(fā)明對檢測的玫煙色棒束孢沒有特殊的限定，檢測本領域技術人員熟知的玫煙色棒束孢即可，如福建農(nóng)科院植保所收藏的編號為fz-01的玫煙色棒束孢。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明提供的溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基及制備方法做進一步詳細的介紹，本發(fā)明的技術方案包括但不限于以下實施例。

實施例1

配方：馬鈴薯200g，蔗糖20g，潮霉素b100ug/ml，氨芐青霉素100ug/ml，瓊脂10g，加蒸餾水至1000ml

制備方法：

1)取新鮮的馬鈴薯，洗凈剝皮后，稱取配方所述質(zhì)量，加蒸餾水至990ml，煮沸20分鐘，雙層紗布過濾；

2)濾液中加入配方所述質(zhì)量的蔗糖、瓊脂，煮沸后補足蒸餾水量至990ml；

3)放入高壓火菌鍋中，溫度121℃，保持30分鐘后，自然冷卻；

4)滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，990ml培養(yǎng)基加入剛配制的相應質(zhì)量百分比濃度的氨芐青霉素和潮霉素b溶液各100ug/ml，調(diào)節(jié)ph值為7.0。

實施例2

配方：馬鈴薯150g，蔗糖16g，潮霉素b30ug/ml，氨芐青霉素30ug/ml，瓊脂10g，加蒸餾水至1000ml

制備方法：

1)取新鮮的馬鈴薯，洗凈剝皮后，稱取配方所述質(zhì)量，加蒸餾水至990ml，煮沸20分鐘，雙層紗布過濾；

2)濾液中加入配方所述質(zhì)量的蔗糖、瓊脂，煮沸后補足蒸餾水量至990ml；

3)放入高壓火菌鍋中，溫度121℃，保持30分鐘后，自然冷卻；

4)滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，990ml培養(yǎng)基加入剛配制的相應質(zhì)量百分比濃度的氨芐青霉素和潮霉素b溶液各30ug/ml，調(diào)節(jié)ph值為8.0。

實施例3

配方：馬鈴薯180g，蔗糖17g，潮霉素b50ug/ml，氨芐青霉素50ug/ml，瓊脂10g，加蒸餾水至1000ml

制備方法：

1)取新鮮的馬鈴薯，洗凈剝皮后，稱取配方所述質(zhì)量，加蒸餾水至990ml，煮沸20分鐘，雙層紗布過濾；

2)濾液中加入配方所述質(zhì)量的蔗糖、瓊脂，煮沸后補足蒸餾水量至990ml；

3)放入高壓火菌鍋中，溫度121℃，保持30分鐘后，自然冷卻；

4)滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至55℃時，990ml培養(yǎng)基加入剛配制的相應質(zhì)量百分比濃度的氨芐青霉素和潮霉素b溶液各50ug/ml，調(diào)節(jié)ph值為10.0。

比較例1

溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基與馬鈴薯培養(yǎng)基分離效果對比：

1)培養(yǎng)基配比

a:溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基：(20％馬鈴薯+2％蔗糖+2％瓊脂+100ug/ml潮霉素b+100ug/ml氨芐青霉素，ph8.0)

b:馬鈴薯培養(yǎng)基：(20％馬鈴薯+2％蔗糖，+2％瓊脂，ph7.0)；

c:對照培養(yǎng)基：(蔗糖3％+0.3％nano3+0.1％k2hpo3+0.05％kcl+0.05％mgso4+0.001％feso4+2％瓊脂+0.2％利福平，自然ph)

在構(gòu)建好的溫室空間內(nèi)，設置具有代表性的5個位點作為空氣分生孢子檢測的采樣點，即室內(nèi)墻角對角線交點為一采樣點，該交點與四墻角連線的中點為另外4個采樣點，將3種培養(yǎng)基平板豎直放置，以免露水濺入。本實驗在通風處掛置風扇，地面采樣點設置5個。將用大麥培養(yǎng)基培養(yǎng)好長滿分生孢子的玫煙色棒束孢放在風扇前，打開風扇5分鐘，將分生孢子釋放到該溫室大棚中，放置采集菌類孢子時間為30min，然后收回，重復2次。轉(zhuǎn)入生化培養(yǎng)箱30℃，黑暗條件培養(yǎng)。每隔12h觀察一次，在溫室采集分離用玫煙色棒束孢分生孢子培養(yǎng)基上，棒束孢開始生產(chǎn)速度較快，24h即可形成1～2mm/d的菌落，由于兩種抗生素聯(lián)合作用，這時其他雜菌尚未形成肉眼看清的菌落，48h后可清楚地對靶標棒束孢菌落進行計數(shù)(見圖1-1)，從而達到快速分離，定量評估大棚棒束孢分生孢子密度的作用。馬鈴薯培養(yǎng)基上，由于缺乏抗生素的作用，非靶標雜菌一開始萌發(fā)生長，生長速度超過靶標的棒束孢，48h已經(jīng)無法對棒束孢進行分離鑒定(見圖1-2)。而對照培養(yǎng)基上，由于利福平的作用，具有一定的選擇效果，但對靶標棒束孢分離效果依然不明顯，24h后已有白色雜菌生成，48h也無法對棒束孢進行分離鑒定(見圖1-3)。培養(yǎng)4-5d以后，對照選擇培養(yǎng)基上非靶標雜菌大量生長，特別是抗性較強的競爭性放線菌、青霉類，容易侵染棒束孢，已無法對棒束孢進行有效鑒定(見圖2)。普通馬鈴薯培養(yǎng)基由于一開始有大量雜菌滋生，包括青霉、木霉、曲霉、鏈孢霉、毛霉和根霉等，還有細菌類，培養(yǎng)4-5d后根本無法對靶標棒束孢進行分離與鑒定(見圖3)。

比較例2

不同培養(yǎng)基對玫煙色棒束孢fz-01的影響

所用菌株玫煙色棒束孢為福建農(nóng)科院植保所收藏(編號fz-01)。打孔器取直徑4mm菌塊至含至不同平板培養(yǎng)基(設5種不同固體培養(yǎng)基，重復3次)。

1)培養(yǎng)基配比

a:馬鈴薯培養(yǎng)基(20％馬鈴薯+2％蔗糖+2％瓊脂，ph7.0)；

b:黑麥培養(yǎng)基(50％黑麥+2％瓊脂，ph7.0)；

c:胡蘿卜培養(yǎng)基(20％胡蘿卜+2％瓊脂，ph7.0)；

d:牛肉膏培養(yǎng)基(0.3％牛肉膏+1％蛋白胨+0.5％氯化鈉+2％瓊脂，ph7.0)；

e:薩氏培養(yǎng)基(1％蛋白胨+1％葡萄糖+2％瓊脂，ph7.0)；

f:對照培養(yǎng)基(蔗糖3％+0.3％nano3+0.1％k2hpo3+0.05％kcl+0.05％mgso4+0.001％feso4+2％瓊脂，自然ph)

按配比稱取原料，121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘備用。打孔器取直徑4mm菌塊至含至不同平板培養(yǎng)基，30℃，黑暗條件培養(yǎng)，每天將培養(yǎng)物取出觀察、描述。培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)24h后，玫煙色棒束孢均能在6種培養(yǎng)基生長，其中馬鈴薯和黑麥培養(yǎng)基生長恢復速度快，比對照培養(yǎng)基要更好，較其它3種培養(yǎng)基菌落恢復速度要快12小時左右(圖4)，4d后馬鈴薯培養(yǎng)基的菌落長勢最好，菌絲生長速度明顯優(yōu)于其它培養(yǎng)基，菌落直徑平均可達50～60mm(圖5)，圖6為4d后馬鈴薯培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果圖。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇出最適宜的檢測棒孢束分生孢子的培養(yǎng)基為馬鈴薯培養(yǎng)基。

比較例3

不同酸堿度(ph值)對玫煙色棒束孢fz-01的影響

所用菌株玫煙色棒束孢為福建農(nóng)科院植保所收藏(編號fz-01)。馬鈴薯培養(yǎng)基酸堿度分別調(diào)至ph值為3～11共9個梯度121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘備用，打孔器取直徑4mm菌塊至培養(yǎng)基，重復3次。30℃，黑暗條件培養(yǎng)4天，將培養(yǎng)物取出觀察、描述。

將空氣采集后的培養(yǎng)皿培養(yǎng)天后進行觀察，培養(yǎng)基ph值為3～11。當分ph為3.0,4.0,11.0時幾乎沒有微生物生長，說明這幾種ph值對真菌的生長具有明顯抑制作用，而ph值為5～10時，都檢測到了真菌菌落，雜菌有青霉、曲霉、根霉，以及細菌類等。根據(jù)前人的經(jīng)驗和資料，我們知道培養(yǎng)基ph為為堿性時，細菌類生長還是受到一定抑制。而實驗結(jié)果表明棒束孢在偏堿性環(huán)境時，生長基本不受影響。根據(jù)實驗結(jié)果，為了使培養(yǎng)基有更好的選擇分離效果，我們選擇出最適宜的檢測棒孢束分生孢子的培養(yǎng)基ph值為8.0。實驗結(jié)果如圖7所示。

比較例4

不同濃度潮霉素b對菌絲生長影響

所用菌株玫煙色棒束孢為福建農(nóng)科院植保所收藏(編號fz-01)。馬鈴薯培養(yǎng)基121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘備用，加入潮霉素b分別調(diào)至共6個梯度為0，10，100，200，300，500ug/ml。打孔器取直徑4mm菌塊至培養(yǎng)基，重復3次。30℃，黑暗條件培養(yǎng)4天，將培養(yǎng)物取出觀察、描述。實驗結(jié)果如圖8所示。將空氣采集后的培養(yǎng)皿培養(yǎng)2d后進行觀察，當培養(yǎng)基潮霉素b為100ug/ml以上時幾乎沒有其它微生物生長，說明這種濃度潮霉素b對非靶標真菌的生長具有明顯抑制性，但棒束孢生長基本不受影響。而濃度為10ug/ml時，可檢測到了非靶標真菌。根據(jù)實驗結(jié)果，選擇出最適宜的檢測棒孢束分生孢子的培養(yǎng)基潮霉素b濃度為100ug/ml。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。