本發(fā)明涉及一種用于高通量測(cè)序檢測(cè)的腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變文庫(kù)的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

隨著多學(xué)科綜合治療的發(fā)展及早期篩查的推廣，近30年來(lái)癌癥死亡率呈現(xiàn)持續(xù)下降，然而，系統(tǒng)治療相關(guān)的臟器損傷發(fā)生率持續(xù)升高。隨著腫瘤患者生存期延長(zhǎng)，心血管疾病儼然已成為第二大致死病因。心血管事件可能對(duì)腫瘤患者生存及生活質(zhì)量構(gòu)成重大風(fēng)險(xiǎn)。早期乳腺癌的5年生存率已經(jīng)從79％提高到88％。據(jù)報(bào)道，心血管死亡率可能成為乳腺癌患者10年后的主要死因。許多研究顯示，大約75％診斷乳腺癌且存活10年的患者，治療心臟疾病有利于延長(zhǎng)患者的總生存。傳統(tǒng)化療藥物以及腫瘤靶向藥物，常?？梢鸢ㄗ笫夜δ軠p退、心力衰竭、高血壓、血管痙攣、血栓相關(guān)性心肌缺血、qt間期延長(zhǎng)等心血管事件。嚴(yán)重的qt間期延長(zhǎng)又可以導(dǎo)致室性心律失常的發(fā)生。心臟毒性具有不同的臨床表現(xiàn)：接受蒽環(huán)類藥物所致心臟毒性表現(xiàn)為持續(xù)的和不可逆的心肌損傷，接受曲妥珠單抗治療所致心臟毒性表現(xiàn)為可逆性心臟功能受損。因此，腫瘤系統(tǒng)治療面臨的挑戰(zhàn)不僅僅是選擇最優(yōu)的方案，同時(shí)還需兼顧降低治療過程中對(duì)重要靶器官(譬如心臟)的損傷。

蒽環(huán)類相關(guān)心臟毒性呈劑量依賴性，通過誘發(fā)活性氧介導(dǎo)的鐵依賴性化學(xué)反應(yīng)即心肌氧化應(yīng)激，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷和進(jìn)行性肌細(xì)胞丟失，導(dǎo)致左心室壁變薄，增加后負(fù)荷，減少收縮。心肌抑制作用還可能與拓?fù)洚悩?gòu)酶有關(guān)，特別是拓?fù)洚悩?gòu)酶iiβ(top2β)，top2β在心肌細(xì)胞中表達(dá)，介導(dǎo)蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的心肌病，通過各種途徑引發(fā)細(xì)胞死亡。急性心臟毒性為心電圖變化和/或心律失常。慢性心臟毒性主要表現(xiàn)為左心室射血分?jǐn)?shù)降低，蒽環(huán)類藥物所致心力衰竭發(fā)生率為3-30％，死亡率高達(dá)72％。這類藥物仍然是癌癥治療后心血管發(fā)病率和死亡率的主要原因。乳腺癌治療的眾多靶向藥物中，目前曲妥珠單抗對(duì)心臟功能的影響研究較為明確，25％乳腺癌患者過表達(dá)her-2基因，曲妥珠單抗治療使乳腺癌復(fù)發(fā)率降低50％、死亡率降低30％，但同時(shí)也提高了3.9％的心衰事件發(fā)生率。心臟收縮功能下降是主要心臟毒性，心力衰竭和心血管死亡事件發(fā)生率<1％和<0.5％。其影響心臟功能的作用機(jī)制可能與直接抑制心肌細(xì)胞表面的erbb2相關(guān)。不同于蒽環(huán)類藥物，曲妥珠單抗引起的心臟功能障礙多數(shù)是可逆的。

臨床中觀察到有些患者可耐受較高劑量的蒽環(huán)類藥物而未表現(xiàn)出心臟毒性，而有些患者耐受劑量不足閾值的一半即表現(xiàn)嚴(yán)重心臟毒副反應(yīng)，為什么一些個(gè)體對(duì)蒽環(huán)類藥物的心臟毒性特別敏感，以及如何識(shí)別哪些患者更容易受到藥物誘導(dǎo)的氧化損傷和細(xì)胞凋亡尚不清楚。超聲心動(dòng)圖用于監(jiān)測(cè)左心射血分?jǐn)?shù)及心肌應(yīng)變率，左室射血分?jǐn)?shù)<50％或者比基礎(chǔ)值低10％以上，可能提示患者發(fā)生心臟毒性的風(fēng)險(xiǎn)明顯增高。心臟相關(guān)標(biāo)記物尤其是肌鈣蛋白用于監(jiān)測(cè)、評(píng)估腫瘤治療過程中心肌損傷的情況。但在臨床實(shí)踐當(dāng)中，尚缺乏有效的預(yù)測(cè)因子判斷患者對(duì)蒽環(huán)類藥物的耐受性和藥物反應(yīng)性。如何篩選更敏感且能夠耐受其毒性的患者接受治療，是目前臨床實(shí)踐的一大挑戰(zhàn)。藥物不良效應(yīng)的出現(xiàn)也是癌癥治療失敗的主要原因。表觀遺傳和基因組的多態(tài)性與腫瘤治療療效相關(guān)聯(lián)，單核苷酸多態(tài)性(snp)是最常見的引起腫瘤特異性的表現(xiàn)形式，大多數(shù)患者療效間的差異和毒性差異產(chǎn)生于snp的遺傳變異，其影響抗癌藥物代謝通路和化療藥物代謝酶的靶基因。隨著全基因組的研究進(jìn)展，越來(lái)越多與藥物代謝酶活性相關(guān)的基因位點(diǎn)多態(tài)性在不同的人群中得以證實(shí)。因此，研究藥物代謝酶基因的多態(tài)性，探討其在療效預(yù)測(cè)及毒性反應(yīng)的價(jià)值，也是個(gè)體化治療的重要探索方向。基因庫(kù)的建立有助于更密切的監(jiān)測(cè)，幫助建立基因組評(píng)分改善藥物有效性預(yù)測(cè)系統(tǒng)，鑒定高風(fēng)險(xiǎn)患者從而提供更安全的治療方案。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種用于高通量測(cè)序檢測(cè)的腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變檢測(cè)文庫(kù)的構(gòu)建方法，覆蓋人類基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd上的總共56種遺傳性變異位點(diǎn)，具體包括如下步驟：

(1)針對(duì)目的基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd設(shè)計(jì)基本擴(kuò)增引物組，該基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；

(2)將模板、上述基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物、多對(duì)第一不對(duì)稱連接探針、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得文庫(kù)產(chǎn)物；

(3)將文庫(kù)產(chǎn)物組成所述用于高通量測(cè)序的腫瘤基因變異文庫(kù)；

上述ringcap-taq酶由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，所述基本擴(kuò)增引物組包括zq-xz-ugt1a6-1-f、zq-xz-ugt1a6-1-r、zq-xz-fancd2-2-f、zq-xz-fancd2-2-r、zq-xz-fancd2-1-f、zq-xz-fancd2-1-r、zq-xz-abcc5-1-f、zq-xz-abcc5-1-r、zq-xz-abcc5-2-f、zq-xz-abcc5-2-r、zq-xz-pik3r1-1-f、zq-xz-pik3r1-1-r、zq-xz-slc22a7-1-f、zq-xz-slc22a7-1-r、zq-xz-vegf-1-f、zq-xz-vegf-1-r、zq-xz-gsta1-1-f、zq-xz-gsta1-1-r、zq-xz-slc22a16-1-f、zq-xz-slc22a16-1-r、zq-xz-abcb1-2-f、zq-xz-abcb1-2-r、zq-xz-abcb1-3-f、zq-xz-abcb1-3-r、zq-xz-abcb1-4-f、zq-xz-abcb1-4-r、zq-xz-abcb1-1-f、zq-xz-abcb1-1-r、zq-xz-cyp3a5-1-f、zq-xz-cyp3a5-1-r、zq-xz-cyp3a5-2-f、zq-xz-cyp3a5-2-r、zq-xz-cyp3a4-1-f、zq-xz-cyp3a4-1-r、zq-xz-cyp3a4-2-f、zq-xz-cyp3a4-2-r、zq-xz-slc28a3-1-f、zq-xz-slc28a3-1-r、zq-xz-esr2-1-f、zq-xz-esr2-1-r、zq-xz-akr1c3-1-f、zq-xz-akr1c3-1-r、zq-xz-cyp2c8-2-f、zq-xz-cyp2c8-2-r、zq-xz-cyp2c8-1-f、zq-xz-cyp2c8-1-r、zq-xz-abcc2-1-f、zq-xz-abcc2-1-r、zq-xz-abcc2-2-f、zq-xz-abcc2-2-r、zq-xz-cat-1-f、zq-xz-cat-1-r、zq-xz-gstp1-1-f、zq-xz-gstp1-1-r、zq-xz-slco1b3-1-f、zq-xz-slco1b3-1-r、zq-xz-rarg-1-f、zq-xz-rarg-1-r、zq-xz-slc22a17-1-f、zq-xz-slc22a17-1-r、zq-xz-tcl1a-3-f、zq-xz-tcl1a-3-r、zq-xz-tcl1a-4-f、zq-xz-tcl1a-4-r、zq-xz-tcl1a-1-f、zq-xz-tcl1a-1-r、zq-xz-tcl1a-2-f、zq-xz-tcl1a-2-r、zq-xz-mrp1-1-f、zq-xz-mrp1-1-r、zq-xz-mrp1-2-f、zq-xz-mrp1-2-r、zq-xz-abcc1-3-f、zq-xz-abcc1-3-r、zq-xz-abcc1-1-f、zq-xz-abcc1-1-r、zq-xz-abcc1-2-f、zq-xz-abcc1-2-r、zq-xz-nqo1-1-f、zq-xz-nqo1-1-r、zq-xz-cyba-1-f、zq-xz-cyba-1-r、zq-xz-her2-2-f、zq-xz-her2-2-r、zq-xz-her2-1-f、zq-xz-her2-1-r、zq-xz-raptor-1-f、zq-xz-raptor-1-r、zq-xz-cyp2b6-1-f、zq-xz-cyp2b6-1-r、zq-xz-cbr1-1-f、zq-xz-cbr1-1-r、zq-xz-ncf4-1-f、zq-xz-ncf4-1-r、zq-xz-rac2-1-f、zq-xz-rac2-1-r、zq-xz-cyp2d6-1-f、zq-xz-cyp2d6-1-r、zq-xz-cbr3-1-f、zq-xz-cbr3-1-r、zq-xz-nos3-1-f、zq-xz-nos3-1-r、zq-xz-esr1-1-f、zq-xz-esr1-1-r、zq-xz-celf4-1-f、zq-xz-celf4-1-r、zq-xz-dpd-1-f、zq-xz-dpd-1-r、zq-xz-dpd-2-f、zq-xz-dpd-2-r、zq-xz-dpd-3-f和zq-xz-dpd-3-r，其序列依次如seqid01～seqid112所示。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，jer-2基因引物名稱：zq-xz-her2-1-f，序列信息ttttgggtcaccttctcttgaccttt；zq-xz-her2-1-r，序列信息ttttaaaggcaaaaacgtctttgacga；zq-xz-her2-2-f，序列信息tttttccgaatgccaaacaccttca；zq-xz-her2-2-r，序列信息ttttgatgaggatcccaaa；

cyp3a5基因引物名稱：zq-xz-cyp3a5-1-f，序列信息ttttatgtcaagaaagcagttatttttaa；zq-xz-cyp3a5-1-r，序列信息ttttttactggcacatca；

abcb1基因引物名稱：zq-xz-abcb1-1-f，序列信息tttttctgcatcagctggactgttg；zq-xz-abcb1-1-r，序列信息ttttacctagtgaacagtcag；

cyp2c8基因引物名稱：zq-xz-cyp2c8-1-f，序列信息ttttggtcaatgacgcagagtagagtc；zq-xz-cyp2c8-1-r，序列信息ttttatttccagcaatggaaagagatg；

cyba基因引物名稱：zq-xz-cyba-1-f，序列信息ttttgcccgaacatagtaattcctggt；zq-xz-cyba-1-r，序列信息ttttgtggtcagcag；

vegf基因引物名稱：zq-xz-vegf-1-f，序列信息ttttcccaaatcactgtggattttgga；zq-xz-vegf-1-r，序列信息ttttccaaaagcaggtcactcactt；

rac2基因引物名稱：zq-xz-rac2-1-f，序列信息ttttgaccatgttttcatctagtgcct；zq-xz-rac2-1-r，序列信息tttttggtctctgggttccttgaatg；

nqo1基因引物名稱：zq-xz-nqo1-1-f，序列信息ttttggctgcttggagcaaaatacag；zq-xz-nqo1-1-r，序列信息tttttgtatcctcagagtggcattctg；

gstp1基因引物名稱：zq-xz-gstp1-1-f，序列信息ttttagtgactgtgtgttgatcaggc；zq-xz-gstp1-1-r，序列信息ttttagatgctcacatagttggtgtagatg；

cyp2d6基因引物名稱：zq-xz-cyp2d6-1-f，序列信息ttttctcacggctttgtccaagaga；zq-xz-cyp2d6-1-r，序列信息ttttgtgatgggcagaagggcacaaag；

cyp3a5基因引物名稱：zq-xz-cyp3a5-2-f，序列信息ttttcacagcaaccttaggttctagttca；zq-xz-cyp3a5-2-r，序列信息ttttgaatgctctactgtcatttctaaccat；

cyp3a4基因引物名稱：zq-xz-cyp3a4-1-f，序列信息tttttatgcatgcaacaggaaacccaca；zq-xz-cyp3a4-1-r，序列信息ttttaggtaggtctaattcagttcagtgtct；

cyp2c8基因引物名稱：zq-xz-cyp2c8-2-f，序列信息ttttaaatggaaacgagtttctattacctgc；zq-xz-cyp2c8-2-r，序列信息tttttacttccagggcacaaccataatg；

cyp3a4基因引物名稱：zq-xz-cyp3a4-2-f，序列信息ttttggagccattggcataaaatctattaaat；zq-xz-cyp3a4-2-r，序列信息ttttgtttggaaggatgtgtaggagtctt；

mrp1基因引物名稱：zq-xz-mrp1-1-f，序列信息ttttccttccctgaagggtgacattc；zq-xz-mrp1-1-r，序列信息ttttgcatccaccttggaactctctttc；

cbr1基因引物名稱：zq-xz-cbr1-1-f，序列信息ttttcagctggacatcgacgatct；zq-xz-cbr1-1-r，序列信息ttttccagtgcatcggttcttctt；

abcc2基因引物名稱：zq-xz-abcc2-1-f，序列信息tttttctcacttcagcgagaccgtat；zq-xz-abcc2-1-r，序列信息ttttcaaagtacacacatgggtaaataccc；

slc28a3基因引物名稱：zq-xz-slc28a3-1-f，序列信息ttttctgtgggtagtcaaacatgtttcc；zq-xz-slc28a3-1-r，序列信息tttttgctatttcttgataaagtgattcagg；

abcc1基因引物名稱：zq-xz-abcc1-1-f，序列信息ttttcaggtgtgttgtgtcgtttcag；zq-xz-abcc1-1-r，序列信息ttttgctggtcctcatcctaccttgatag；zq-xz-abcc1-2-f，序列信息ttttagctgttgtctcgttgatcagatc；zq-xz-abcc1-2-r，序列信息tttttatcacggacctgtaatatggttcct；

fancd2基因引物名稱：zq-xz-fancd2-1-f，序列信息tttttactgcgttgatgttattagtgtctt；zq-xz-fancd2-1-r，序列信息ttttacatgctaaatatgaacagtgacta；

abcc1基因引物名稱：zq-xz-abcc1-3-f，序列信息ttttgccctggtgatcaccaattcag；zq-xz-abcc1-3-r，序列信息ttttacaggaggtagagagcaaggatg；

abcc2基因引物名稱：zq-xz-abcc2-2-f，序列信息ttttgcctggctgctatttagctttc；zq-xz-abcc2-2-r，序列信息ttttaaaaagaatgctacaacattgtctgac；

mrp1基因引物名稱：zq-xz-mrp1-2-f，序列信息ttttcttgaacaactcactttgcctttctaa；zq-xz-mrp1-2-r，序列信息ttttaatctcctgtattgtctaagtctagc；

ncf4基因引物名稱：zq-xz-ncf4-1-f，序列信息ttttgaaaatggaggccagcattctag；zq-xz-ncf4-1-r，序列信息tttttcagttgggtatcagaagcctt；

slc22a16基因引物名稱：zq-xz-slc22a16-1-f，序列信息tttttgcaactgcaccgtaacataatct；zq-xz-slc22a16-1-r，序列信息ttttttgtggtattcactacttggcttct；

ugt1a6基因引物名稱：zq-xz-ugt1a6-1-f，序列信息ttttgctacacaaagttttcagaccacatg；zq-xz-ugt1a6-1-r，序列信息ttttaaacagagaccttctgatataaggtg；

abcb1基因引物名稱：zq-xz-abcb1-2-f，序列信息ttttacatgctcccaggctgtttatt；zq-xz-abcb1-2-r，序列信息ttttattgctgagaacattgcctatgga；zq-xz-abcb1-3-f，序列信息ttttcaatgctgcagtcaaacaggatg；zq-xz-abcb1-3-r，序列信息tttttgatgttaattgtgctacattcaaagtgtg；zq-xz-abcb1-4-f，序列信息ttttccaaactagggaaccacagttagt；zq-xz-abcb1-4-r，序列信息ttttgccttggaaatgtcttcaaatgattca；

akr1c3基因引物名稱：zq-xz-akr1c3-1-f，序列信息ttttttcagaaactttacaagagtagctttggt；zq-xz-akr1c3-1-r，序列信息ttttaggcagcaagagtaagaatttctatctc；

cat基因引物名稱：zq-xz-cat-1-f，序列信息ttttgcccgaaggtccgtttagaaag；zq-xz-cat-1-r，序列信息ttttctgcttcggcgaatgtaaaag；

slco1b3基因引物名稱：zq-xz-slco1b3-1-f，序列信息tttttctgctgcttctactttctttgt；zq-xz-slco1b3-1-r，序列信息tttttccagggcaatcgtccaatattc；

slc22a7基因引物名稱：zq-xz-slc22a7-1-f，序列信息ttttaccttaggattcagacaggaaactatat；zq-xz-slc22a7-1-r，序列信息ttttatacacatcttcctgaacaaccttatg；

tcl1a基因引物名稱：zq-xz-tcl1a-1-f，序列信息ttttactaccagagattaaaggagaagatgg；zq-xz-tcl1a-1-r，序列信息ttttggcatttctctcaactaagttcaga；zq-xz-tcl1a-2-f，序列信息ttttgtcttgagaagggagcaagaggaca；zq-xz-tcl1a-2-r，序列信息ttttgtccttgcacagataacttctatc；

rarg基因引物名稱：zq-xz-rarg-1-f，序列信息ttttctcatcctcgctagaggcattg；zq-xz-rarg-1-r，序列信息ttttctctctctttctctctccattgtagg；

abcc5基因引物名稱：zq-xz-abcc5-1-f，序列信息ttttccctgtattttgatcagctgtca；zq-xz-abcc5-1-r，序列信息ttttagtcttcaggcaccagactct；

cyp2b6基因引物名稱：zq-xz-cyp2b6-1-f，序列信息ttttggcacttcagtctgtgtcctt；zq-xz-cyp2b6-1-r，序列信息ttttaaaagtctggtagaacaagttcagca；

tcl1a基因引物名稱：zq-xz-tcl1a-3-f，序列信息ttttgataggctaaatatgtgtgagtctct；zq-xz-tcl1a-3-r，序列信息ttttgctcactaagcaaggacagcaa；zq-xz-tcl1a-4-f，序列信息ttttttcattgaactagctcaagttaactc；zq-xz-tcl1a-4-r，序列信息tttttcagcatcttgccctgaatcttatt；

slc22a17基因引物名稱：zq-xz-slc22a17-1-f，序列信息ttttgggtagtttaagagacacttaggata；zq-xz-slc22a17-1-r，序列信息tttttggaaggtggcagcagaaaact；

raptor基因引物名稱：zq-xz-raptor-1-f，序列信息tttttgtgtggccaccctattgaatg；zq-xz-raptor-1-r，序列信息ttttaagaagtacaaaatggc；

fancd2基因引物名稱：zq-xz-fancd2-2-f，序列信息ttttagggagaagagtaaattttaaacttg；zq-xz-fancd2-2-r，序列信息tttttgagactcaatgatctgaa；

abcc5基因引物名稱：zq-xz-abcc5-2-f，序列信息ttttttgccatattaaaagatggcataaatt；zq-xz-abcc5-2-r，序列信息ttttaagtttcctattctgtgagctgtct；

pik3r1基因引物名稱：zq-xz-pik3r1-1-f，序列信息ttttgcttaatgaagaaagagctggaaatcc；zq-xz-pik3r1-1-r，序列信息tttttcattccagagtcttatcaacacaatc；

gsta1基因引物名稱：zq-xz-gsta1-1-f，序列信息ttttataagatcagtacttactttgttaaa；zq-xz-gsta1-1-r，序列信息ttttgagtggcttttccctaacttgact；

esr2基因引物名稱：zq-xz-esr2-1-f，序列信息tttttgctacaactcaacttcctacacaac；zq-xz-esr2-1-r，序列信息ttttttaagcaattgcatgggtagtgtt；

esr1基因引物名稱：zq-xz-esr1-1-f，序列信息ttttgggaagggaggtatcaacattg；zq-xz-esr1-1-r，序列信息ttttacctctcttgcattgctcaac；

celf4基因引物名稱：zq-xz-celf4-1-f，序列信息ttttcaatcattgctgactctcaaggag；zq-xz-celf4-1-r，序列信息tttttgataagttggcttcatttctctctt；

cbr3基因引物名稱：zq-xz-cbr3-1-f，序列信息ttttctttaagactcgcagcactgga；zq-xz-cbr3-1-r，序列信息ttttagagaactgtcggcacagt；

nos3基因引物名稱：zq-xz-nos3-1-f，序列信息ttttctggagatgaaggcaggagacag；zq-xz-nos3-1-r，序列信息ttttagtcaatccctttggtgctc；

dpd基因引物名稱：zq-xz-dpd-1-f，序列信息ttttagagaaagttttggtgagggca；zq-xz-dpd-1-r，序列信息ttttcctcttttacactcctattgatctg；zq-xz-dpd-2-f，序列信息ttttcaacagaaaatgctttctgccgta；zq-xz-dpd-2-r，序列信息ttttgaattgagcaacgt；zq-xz-dpd-3-f，序列信息ttttgcaaagcaactggcagattctt；zq-xz-dpd-3-r，序列信息ttttttggtgtcaaagtgt。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選方案，在步驟(2)中，多重富集pcr的反應(yīng)體系為：

1×pcr緩沖液

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)方案，該構(gòu)建方法的試劑盒，包括

一dna富集反應(yīng)組件，由第一擴(kuò)增引物組組成；

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成；

一管陽(yáng)性質(zhì)控品；

和一管陰性質(zhì)控品。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明的構(gòu)建方法針對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行單管，快速完成文庫(kù)的構(gòu)建，整個(gè)文庫(kù)構(gòu)建過程僅需要2～3小時(shí)，手動(dòng)時(shí)間僅僅需要45分鐘即可，結(jié)合高通量測(cè)序平臺(tái)可以十分有效的解決目前對(duì)于臨床上預(yù)測(cè)患者接受腫瘤藥物治療是否發(fā)生較嚴(yán)重心臟毒性，而需要對(duì)多基因、多靶點(diǎn)檢測(cè)這一難點(diǎn)，且成本低廉。

2、本發(fā)明的構(gòu)建方法所制備的文庫(kù)序列可被目前高通量測(cè)序系統(tǒng)識(shí)別并進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)文庫(kù)構(gòu)建進(jìn)行核酸序列的檢測(cè)的應(yīng)用，該核酸檢測(cè)可應(yīng)用于目前多種高通量測(cè)序平臺(tái)、基因芯片平臺(tái)、雜交檢測(cè)平臺(tái)，見圖1。

3、本發(fā)明的構(gòu)建方法適用于來(lái)自外周血樣品所獲得的dna，見圖2、圖3。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的實(shí)施例構(gòu)建的核酸文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序總數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明的實(shí)施例檢測(cè)腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變的檢測(cè)均一性結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明的實(shí)施例檢測(cè)腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變的檢測(cè)突變結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)地描述。

腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變文庫(kù)的構(gòu)建方法，覆蓋人類基因kras、jak3、akt1、crebbp、pten、rb1、tp53、ctnnb1、tsc2、tsc1、erbb2、pik3ca、sf3b1、jak2、cdh1、smad4、gata3、map2k4、map3k1和esr1上的總共56種遺傳性變異位點(diǎn)。

具體包括如下步驟：

(1)針對(duì)目的基因ugt1a6、fancd2、abcc5、pik3r1、slc22a7、vegf、gsta1、slc22a16、abcb1、cyp3a5、cyp3a4、slc28a3、esr2、akr1c3、cyp2c8、abcc2、cat、gstp1、slco1b3、rarg、slc22a17、tcl1a、mrp1、abcc1、nqo1、cyba、her2、raptor、cyp2b6、cbr1、ncf4、rac2、cyp2d6、cbr3、nos3、esr1、celf4和dpd設(shè)計(jì)基本擴(kuò)增引物組，該基本擴(kuò)增引物組的正向引物和反向引物的5’端設(shè)有額外的2～5個(gè)t，且該2～5個(gè)t的靠近3’端的第一個(gè)t具有pna修飾，同時(shí)該基本擴(kuò)增引物組的tm值相差不超過1℃；所述擴(kuò)增引物組包括zq-xz-ugt1a6-1-f、zq-xz-ugt1a6-1-r、zq-xz-fancd2-2-f、zq-xz-fancd2-2-r、zq-xz-fancd2-1-f、zq-xz-fancd2-1-r、zq-xz-abcc5-1-f、zq-xz-abcc5-1-r、zq-xz-abcc5-2-f、zq-xz-abcc5-2-r、zq-xz-pik3r1-1-f、zq-xz-pik3r1-1-r、zq-xz-slc22a7-1-f、zq-xz-slc22a7-1-r、zq-xz-vegf-1-f、zq-xz-vegf-1-r、zq-xz-gsta1-1-f、zq-xz-gsta1-1-r、zq-xz-slc22a16-1-f、zq-xz-slc22a16-1-r、zq-xz-abcb1-2-f、zq-xz-abcb1-2-r、zq-xz-abcb1-3-f、zq-xz-abcb1-3-r、zq-xz-abcb1-4-f、zq-xz-abcb1-4-r、zq-xz-abcb1-1-f、zq-xz-abcb1-1-r、zq-xz-cyp3a5-1-f、zq-xz-cyp3a5-1-r、zq-xz-cyp3a5-2-f、zq-xz-cyp3a5-2-r、zq-xz-cyp3a4-1-f、zq-xz-cyp3a4-1-r、zq-xz-cyp3a4-2-f、zq-xz-cyp3a4-2-r、zq-xz-slc28a3-1-f、zq-xz-slc28a3-1-r、zq-xz-esr2-1-f、zq-xz-esr2-1-r、zq-xz-akr1c3-1-f、zq-xz-akr1c3-1-r、zq-xz-cyp2c8-2-f、zq-xz-cyp2c8-2-r、zq-xz-cyp2c8-1-f、zq-xz-cyp2c8-1-r、zq-xz-abcc2-1-f、zq-xz-abcc2-1-r、zq-xz-abcc2-2-f、zq-xz-abcc2-2-r、zq-xz-cat-1-f、zq-xz-cat-1-r、zq-xz-gstp1-1-f、zq-xz-gstp1-1-r、zq-xz-slco1b3-1-f、zq-xz-slco1b3-1-r、zq-xz-rarg-1-f、zq-xz-rarg-1-r、zq-xz-slc22a17-1-f、zq-xz-slc22a17-1-r、zq-xz-tcl1a-3-f、zq-xz-tcl1a-3-r、zq-xz-tcl1a-4-f、zq-xz-tcl1a-4-r、zq-xz-tcl1a-1-f、zq-xz-tcl1a-1-r、zq-xz-tcl1a-2-f、zq-xz-tcl1a-2-r、zq-xz-mrp1-1-f、zq-xz-mrp1-1-r、zq-xz-mrp1-2-f、zq-xz-mrp1-2-r、zq-xz-abcc1-3-f、zq-xz-abcc1-3-r、zq-xz-abcc1-1-f、zq-xz-abcc1-1-r、zq-xz-abcc1-2-f、zq-xz-abcc1-2-r、zq-xz-nqo1-1-f、zq-xz-nqo1-1-r、zq-xz-cyba-1-f、zq-xz-cyba-1-r、zq-xz-her2-2-f、zq-xz-her2-2-r、zq-xz-her2-1-f、zq-xz-her2-1-r、zq-xz-raptor-1-f、zq-xz-raptor-1-r、zq-xz-cyp2b6-1-f、zq-xz-cyp2b6-1-r、zq-xz-cbr1-1-f、zq-xz-cbr1-1-r、zq-xz-ncf4-1-f、zq-xz-ncf4-1-r、zq-xz-rac2-1-f、zq-xz-rac2-1-r、zq-xz-cyp2d6-1-f、zq-xz-cyp2d6-1-r、zq-xz-cbr3-1-f、zq-xz-cbr3-1-r、zq-xz-nos3-1-f、zq-xz-nos3-1-r、zq-xz-esr1-1-f、zq-xz-esr1-1-r、zq-xz-celf4-1-f、zq-xz-celf4-1-r、zq-xz-dpd-1-f、zq-xz-dpd-1-r、zq-xz-dpd-2-f、zq-xz-dpd-2-r、zq-xz-dpd-3-f和zq-xz-dpd-3-r，其序列依次如seqid01～seqid112所示；

(2)將模板、上述基本擴(kuò)增引物組置于一含有ringcap-taq酶的pcr反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，純化后得擴(kuò)增產(chǎn)物；將擴(kuò)增產(chǎn)物、多對(duì)第一不對(duì)稱連接探針、通用引物和上述ringcap-taq酶混合進(jìn)行pcr，純化后獲得文庫(kù)產(chǎn)物；

(3)將文庫(kù)產(chǎn)物組成所述用于高通量測(cè)序的腫瘤治療心臟毒性預(yù)測(cè)基因突變文庫(kù)；

(4)通過iontorrentpgm高通量測(cè)序儀進(jìn)行文庫(kù)上機(jī)檢測(cè)，獲得目標(biāo)序列信息，通過vc軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)信息比對(duì)分析，得到樣本突變狀態(tài)。

上述模板所來(lái)自的樣品適用范圍包括外周血標(biāo)本。

外周血樣品，使用qiagen公司外周血dna提取試劑盒提取基因組dna，具體步驟按試劑盒操作說明。每次提取外周血不少于1000μl。所提dna溶于tris-hcl(10mmol/l,ph8.0)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取質(zhì)量，并確定濃度，用tris-hcl溶液(10mmol/l,ph8.0)調(diào)整dna濃度到2ng/μl作為pcr擴(kuò)增的模板。

基于上述構(gòu)建方法的試劑盒包括：

一dna富集反應(yīng)組件，由擴(kuò)增引物組組成，每人份的dna富集反應(yīng)組件的配方如下表所示：

一ringcap-taq酶，由taq酶、dna連接酶和dna末端修飾酶組成，比例為0.8～1.2:0.8～1.2:0.8～1.2，優(yōu)選比例1:1:1；

一陰性質(zhì)控品，具體為無(wú)核酸水；

和一陽(yáng)性質(zhì)控品，具體由10個(gè)陽(yáng)性突變質(zhì)粒序列野生型基因組dna混合而成，濃度為2ng/μl。

將上述試劑盒用前述的構(gòu)建方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來(lái)分析本發(fā)明的檢測(cè)腫瘤治療心臟毒性基因突變的方法。分別用20份臨床乳腺癌治療過程無(wú)嚴(yán)重心臟毒性的全血樣品、20份臨床乳腺癌治療過程存在嚴(yán)重心臟毒性的全血樣本：

所述pcr反應(yīng)體系的模板量(待測(cè)樣品、陽(yáng)性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品)為5ul，其余組分如下表所示：

pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：

上述pcr反應(yīng)體系所得的擴(kuò)增產(chǎn)物的純化具體如下：

取出agencourtampurexp試劑置于室溫，同時(shí)要打散磁珠，同時(shí)配制新鮮的70％的乙醇(230μl無(wú)水乙醇+100μl無(wú)核酸酶水)，必須是新鮮配制的。

第一輪純化步驟

(1)向每個(gè)樣品反應(yīng)管25μl產(chǎn)物中分別加入12.5μl(0.5x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育5分鐘，一直到溶液澄清；

(4)小心地吸取上清液置于新的離心管，不要擾動(dòng)磁珠；注意：上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物不要丟棄。

第二輪純化步驟

(1)向上述吸取的上清液25μl中加入30μl(1.2x樣本體積)的agencourtampurexp試劑，上下吸取吹打5次，完全混勻重懸dna；

(2)室溫孵育5分鐘；

(3)放置在磁力架上面，孵育3分鐘，一直到溶液澄清，小心地吸走并棄掉上清，不要擾動(dòng)磁珠；注意：磁珠上含有擴(kuò)增文庫(kù)不要丟棄。

(4)加入150μl新鮮配制的70％乙醇，沒過磁珠樣品即可，離心管正反方向移動(dòng)5次，然后磁力架上孵育2分鐘，去除上清液；

(5)重復(fù)上述步驟4，進(jìn)行第二次洗滌；

(6)確保乙醇液滴已全部從孔中吸走，將板放置于磁力架上，室溫空氣干燥5分鐘，注意不要過度干燥。

(7)將樣品管從磁力架上拿開，在每孔中加入25μlte(ph8.0)緩沖液充分浸潤(rùn)磁珠。充分振蕩混勻，快速離心將液體收集到管底。(也可以選擇用槍吸取一半以上的液體上下吹打至少5次來(lái)混勻)；注意：上清液含有擴(kuò)增文庫(kù)不要丟棄。

將樣品管置于磁力架上2分鐘。上清液中含有擴(kuò)增產(chǎn)物。取出20μl上清。

上述純化所得的擴(kuò)增產(chǎn)物制備文庫(kù)產(chǎn)物的pcr反應(yīng)的模板量為5ul，其余組分如下表所示：

pcr擴(kuò)增程序設(shè)置如下表：

pcr產(chǎn)物分別按純化擴(kuò)增產(chǎn)物方法進(jìn)行純化，制得文庫(kù)產(chǎn)物。

上述文庫(kù)產(chǎn)物的檢測(cè)具體如下：

采用iontorrentpgm半導(dǎo)體測(cè)序儀(thermofisher公司)一次可以檢測(cè)96份樣品(包括陰陽(yáng)性對(duì)照)。

前述40份全血樣品以及陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)本發(fā)明的體系檢測(cè)，只有陽(yáng)性質(zhì)粒和臨床接受腫瘤治療具有嚴(yán)重心臟毒性的有檢測(cè)到突變序列，而臨床接受腫瘤治療無(wú)嚴(yán)重心臟毒性樣品無(wú)突變序列，進(jìn)一步證明了該方法的特異性，具體結(jié)果如圖1至圖3所示。

重復(fù)性試驗(yàn)：每個(gè)反應(yīng)分別加入突變細(xì)胞系dna10ng、1ng和100pg，重復(fù)10次進(jìn)行高通量測(cè)序檢測(cè)，10次結(jié)果一致，符合率100％。

以上可知本發(fā)明腫瘤多基因文庫(kù)構(gòu)建反應(yīng)就可以同時(shí)檢測(cè)腫瘤治療心臟毒性基因56個(gè)遺傳性變異位點(diǎn)，文庫(kù)構(gòu)建時(shí)間僅需3小時(shí)，因此本發(fā)明省時(shí)省力，準(zhǔn)確性高，可滿足突變的快速診斷。

最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。