專利名稱：抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用檢測(cè)試劑盒，特別是心肌抗體檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
病毒性心臟病(VHD)是一組與病毒感染有關(guān)的心臟疾病，常見的有病毒性心肌炎(VMC)和擴(kuò)張型心肌病(DCM)[參見Kandolf R，Klingel K，Zell R，et al.Molecular mechanismsin the pathogenisis of enteroviral heart diseaseacute and persistent infections.Clin Immuno Immunopathol，1993，68(2)153]。
近年來，VHD的發(fā)病率有逐漸增高的趨勢(shì)。在病毒感染的流行期約有5％的患者發(fā)生心肌炎，其中12.5％可轉(zhuǎn)化為DCM，而普通人群中DCM發(fā)病率僅8-10/10萬人口[參見劉穎，廖玉華，涂源淑，柯薩奇病毒感染與抗ADP/ATP載體抗體在病毒性心臟病發(fā)病中的意義。臨床心血管病雜志，1997；13147]。
我國(guó)廣西南寧地區(qū)66632人中DCM的普查患病率為84.04/10萬，占該地區(qū)各種心臟病自然發(fā)病率的第4位[參見廣西醫(yī)學(xué)院內(nèi)科，南寧地區(qū)醫(yī)院內(nèi)科，南寧地區(qū)心血管病協(xié)作組。廣西南寧地區(qū)66632例人口普查心肌病調(diào)查報(bào)告。廣西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1979；157]。一般認(rèn)為，DCM患者癥狀出現(xiàn)后5年生存率約40％，10年生存率僅22％左右。
目前超聲心動(dòng)圖、胸部X線和心內(nèi)膜心肌活檢等檢查是DCM臨床診斷的常用工具。但超聲心動(dòng)圖和胸部X線出現(xiàn)改變時(shí)，患者已有明顯的心臟形態(tài)學(xué)改變，常伴有心力衰竭。心內(nèi)膜心肌活檢缺乏特異性，且難以在臨床推廣。故尋求對(duì)擴(kuò)張型心肌病(DCM)進(jìn)行早期診斷的有效方法，是本領(lǐng)域面臨的重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供一種抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒，該試劑盒能實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒性心肌炎的診斷，以及對(duì)擴(kuò)張型心肌病(DCM)的早期診斷。
擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者血清中存在抗心肌自身抗體，檢測(cè)疑診擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌肽類抗體，可提高DCM的診斷水平。由于天然心肌抗原分離提純困難，難以長(zhǎng)期保存，限制了心肌抗體檢測(cè)的臨床應(yīng)用。
本發(fā)明根據(jù)心肌抗原的氨基酸序列及抗原決定簇的分布狀況，設(shè)計(jì)并合成多肽，并以此多肽作為抗原檢測(cè)患者體內(nèi)的抗心肌肽類抗體。
本發(fā)明提供的抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒的組成包括
1.包被反應(yīng)板4塊，每塊96孔；2.樣品稀釋液1瓶40ml；3.濃縮洗液4瓶，每瓶50ml；4.酶標(biāo)二抗1瓶40ml；5.顯色劑A 4支，每支10ml；6.顯色劑B 4支，每支10ml；7.陰性對(duì)照血清1支50μl；8.終止液4支，每支10ml；9.說明書1份。
包被反應(yīng)板為四塊96孔板，四塊反應(yīng)板分別包被有與四種心肌抗原有相同抗原原性的人T合成的抗原多肽。
樣品稀釋液是PH為7.4的磷酸緩沖液與小牛血清的混合液，磷酸緩沖液與小牛血清的容積比為9∶1；濃縮洗液為含0.1％Tween-20的磷酸緩沖液，其PH為7.4；酶標(biāo)二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG；顯色劑A由磷酸氫二鈉14.6g和檸檬酸9.33g溶于0.75％過氧化氫尿素4.6ml中，再加水至1000ml配制而成；顯色劑B由四甲基聯(lián)苯胺(TMB)200mg溶于無水乙醇100ml中，再加水至1000ml配制而成；陰性對(duì)照血清為健康人血清；終止液為2mol/L硫酸。
試劑盒檢測(cè)試劑的制備一、抗原肽的合成合成與四種心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽。
1.四種心肌抗原及合成的相應(yīng)心肌細(xì)胞抗原肽段的氨基酸序列四種心肌抗原是①心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原(ANT)；②β1腎上腺素能受體抗原(β1)；③M2-膽堿能受體抗原(M2)；
④心肌肌球蛋白重鏈抗原(MHC)。
合成的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列ANT-1 Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-GlnANT-2 Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Val合成的β1腎上腺素能受體肽段的氨基酸序列His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Arg-Cys合成的M2-膽堿能受體肽段的氨基酸序列Val-Arg-The-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-The-Phe-Gly-The-Ala-Ile-Cys合成的心肌肌球蛋白重鏈(MHC)肽段的氨基酸序列MHC-1Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-AspMHC-2Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-ValMHC-3Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成儀合成心肌抗原肽段，包括以下步驟(1)去保護(hù)Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
(2)激活和交聯(lián)下一個(gè)氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。激活的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。
(3)循環(huán)這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
(4)裂解切割和脫保護(hù)多肽從柱上切割下來，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑(TFA)洗脫和脫保護(hù)。
3.多肽抗原合成后分離與純化用甲醇(優(yōu)級(jí)純)清洗5次，每次1分鐘，再用t-J甲基醚(優(yōu)級(jí)純)清洗2次，此倆種清洗的目的是洗去游離的未結(jié)合的氨基酸。用脫樹脂溶液(sigma公司的三氟乙酸)將合成好的多肽從樹脂上切割下來，再用乙醚(分析純)沉淀，離心分離，使脫樹脂溶液(三氟乙酸)與合成好的多肽分離；倒掉上層的脫樹脂溶液，最后用氮?dú)?N2)將沉淀的合成好的多肽吹干，置-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 二.抗原的包被將ANT、β1、M2、MHC抗原多肽片段分別溶解于四個(gè)裝有PH為9.2碳酸緩沖液的容器中，以每孔中100μl的碳酸緩沖液含1μg的相應(yīng)多肽抗原量進(jìn)行包被，置4℃冰箱18小時(shí)后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘，拍干后將含1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液作為封閉液，每孔150μl封閉，置37℃孵浴2h，以消除非特異性反應(yīng)，拍干干燥后保存于4℃或-20℃冰箱備用。
三.試劑的配制(1)樣品的稀釋液(容積比)9份磷酸緩沖液(PH7.4)+1份小牛血清；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體；(3)顯色劑A200mg溶于無水乙醇100ml加水至1000ml(4)顯色劑B將磷酸氫二鈉14.6g，檸檬酸9.33g，0.75％過氧化氫尿素4.6ml溶于1000ml蒸餾水中即得顯色劑B；(5)終止液為2mol/L H2S04；(6)洗液含0.1％Tween-20的0.01mol/L磷酸緩沖液(PH7.4)。
(7)陰性對(duì)照血清健康人血清50μl。
使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的步驟1.取出分別包被有ANT、β1、M2、MHC多肽抗原的包被板；用樣品稀釋液稀釋待測(cè)血清，稀釋度為1∶100，每孔加100μl，置37℃溫浴60分鐘；2用洗滌液洗3次，每次3分鐘，拍干，每孔加1∶16000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體100μl，置37℃溫浴30分鐘后，同上洗3次；3.加顯色劑每孔分別加入顯色劑A 50μl后，再在每孔中加入顯色劑B 50μl，混勻，37℃溫箱10分鐘；4.顯色完畢后，立即加50μl終止液于各反應(yīng)孔；5.在酶標(biāo)儀上450nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值，實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照陰性；6.結(jié)果判斷以空白對(duì)照為零，以P/N值≥2.1為陽性，P/N＝樣本OD值/陰性對(duì)照OD值。
使用本發(fā)明診斷試劑盒的注意事項(xiàng)有1.試劑的使用整個(gè)檢測(cè)工作中應(yīng)嚴(yán)格防止交叉感染，嚴(yán)格按操作程序工作；2.試劑盒保存于2-8℃，試劑開封后如未用完，應(yīng)密封干燥保存；3.洗滌時(shí)應(yīng)注意洗凈，拍干。4.不用批號(hào)的試劑盒中的組分不能混用，試劑瓶蓋切勿交叉使用。
使用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的步驟、使用本發(fā)明診斷試劑盒的注意事項(xiàng)和試劑的配制可作為使用說明書裝入試劑盒中。
實(shí)驗(yàn)資料1.用本發(fā)明試劑盒對(duì)臨床上已經(jīng)確診的69例DCM患者和78例健康獻(xiàn)血員血清進(jìn)行了驗(yàn)證性檢測(cè)，以檢驗(yàn)本發(fā)明診斷試劑盒的敏感性和特異性。檢測(cè)結(jié)果為抗ANT抗體的敏感性62.3％，特異性93.6％；抗β1受體抗體的敏感性50.7％，特異性92.3％；抗M2-膽堿能受體抗體的敏感性40.6％，特異性94.9％；抗肌球蛋白重鏈抗體的敏感性44.9％，特異性96.2％。聯(lián)合應(yīng)用四種抗心肌多肽抗體檢測(cè)DCM的敏感性和特異性分別高達(dá)82.6％和89.7％。通過比較我們還發(fā)現(xiàn)合成肽結(jié)果與天然心肌抗原的檢測(cè)結(jié)果具有高度一致性，合成肽基本上可以反映心肌抗原的主要抗原決定簇，可以代替天然抗原用以檢測(cè)患者血清中抗心肌自身抗體。
2.使用本發(fā)明試劑盒對(duì)病毒性心臟病患者抗心肌多肽抗體檢測(cè)結(jié)果的比較對(duì)病毒性心臟病患者及健康人進(jìn)行抗心肌多肽抗體檢測(cè)，相互比較后發(fā)現(xiàn)，DCM組和慢性病毒性心肌炎(CVMC)組抗心肌多肽抗體陽性率明顯高于急性病毒性心肌炎(AVMC)組及健康人組(P＜0.05，P＜0.01)，而急性病毒性心肌炎(AVMC)組與健康人組間無明顯差異(P＞0.05)。同時(shí)慢性病毒性心肌炎(CVMC)組與DCM組間亦無明顯差異(P＞0.05)，見表1及表2。各種抗心肌多肽抗體對(duì)DCM檢測(cè)的敏感性及特異性分別為ANT 57.1％，96.7％；β142.9％，93.3％；M2 38.1％，96.7％；MHC 38.1％，96.7％，見表3。
表1病毒性心臟病患者及對(duì)照組抗心肌多肽抗體檢測(cè)分析(1)

注與健康人組比較*P＞0.05**P＜0.01與AVMC組比較#P＜0.05與CVMC組比較⊿P＞0.05表2病毒性心臟病患者及對(duì)照組抗心肌多肽抗體檢測(cè)分析(2)

注與健康人組比較*P＞0.05**P＜0.01與AVMC組比較#P＜0.05與CVMC組比較⊿P＞0.05表3DCM患者抗心肌多肽抗體檢測(cè)敏感性與特異性比較

檢測(cè)結(jié)果說明本發(fā)明試劑盒在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)心肌病和DCM有較高的敏感性和很強(qiáng)的特異性。
本發(fā)明試劑盒的意義在于1.因DCM患者血清中存在抗心肌自身抗體，利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)疑診擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌肽類抗體，可提高DCM的診斷水平，實(shí)現(xiàn)早期診斷。
2.本發(fā)明試劑盒可用于監(jiān)測(cè)病毒性心肌炎(VMC)向DCM轉(zhuǎn)化。大量實(shí)驗(yàn)研究及臨床資料表明病毒性心肌炎可以轉(zhuǎn)化為擴(kuò)張型心肌病[參見Kandolf R，Klingel K，Zell R，ctal.Molecular mechanisms in the pathogeni sis of enteroviral heart diseaseacuteand persistent infections.Clin Immuno Immunopathol，1993，68(2)153]，許多慢性病毒性心肌炎患者體內(nèi)存在抗心肌自身抗體，通過各種免疫學(xué)機(jī)制導(dǎo)致DCM的發(fā)病，即抗心肌抗體介導(dǎo)的心肌損害是DCM發(fā)病的一個(gè)始動(dòng)因素及其早期發(fā)展的重要因素，故本發(fā)明試劑盒可用于監(jiān)測(cè)VMC向DCM轉(zhuǎn)化。
3.本發(fā)明試劑盒檢測(cè)可用于指導(dǎo)DCM的防治。在DCM早期，對(duì)抗心肌抗體檢測(cè)中抗ANT抗體陽性的患者，應(yīng)用鈣通道阻滯劑如地爾硫卓，抗β1受體抗體陽性的患者應(yīng)用β受體阻滯劑如美多心安，阻止抗體效應(yīng)，可以防止抗體介導(dǎo)的心肌損害，保護(hù)心肌，對(duì)DCM患者進(jìn)行早期、及時(shí)干預(yù)，可降低患者的再住院率和死亡率。


圖1為抗原合成流程圖見附，圖中S、L為側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1試劑盒檢測(cè)試劑的制備一、抗原肽的合成合成與四種心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽。
1.四種心肌抗原肽段及其氨基酸序列是④心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原肽段(ANT)；⑤β1腎上腺素能受體抗原肽段(β1)；⑥M2-膽堿能受體抗原肽段(M2)；④心肌肌球蛋白重鏈抗原肽段(MHC)。
ADP/ATP載體蛋白肽段的氨基酸序列ANT-1 Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-GlnANT-2 Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Valβ1腎上腺素能受體肽段的氨基酸序列His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Arg-CysM2-膽堿能受體肽段的氨基酸序列Val-Arg-The-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-The-Phe-Gly-The-Ala-Ile-Cys心肌肌球蛋白重鏈(MHC)肽段的氨基酸序列MHC-1 Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-AspMHC-2 Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-ValMHC-3 Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成儀合成心肌抗原肽段，包括以下步驟(1)去保護(hù)Fmoc保護(hù)的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護(hù)基團(tuán)。
(2)激活和交聯(lián)下一個(gè)氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。激活的單體與游離的氨基反應(yīng)交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅(qū)使反應(yīng)完成。
(3)循環(huán)這兩步反應(yīng)反復(fù)循環(huán)直到合成完成。
(4)裂解切割和脫保護(hù)多肽從柱上切割下來，其保護(hù)基團(tuán)被一種脫保護(hù)劑(TFA)洗脫和脫保護(hù)。
3.多肽抗原合成后分離與純化用甲醇(優(yōu)級(jí)純)清洗5次，每次1分鐘，再用t-J甲基醚(優(yōu)級(jí)純)清洗2次，此倆種清洗的目的是洗去游離的未結(jié)合的氨基酸。用脫樹脂溶液(sigma公司的三氟乙酸)將合成好的多肽從樹脂上切割下來，再用乙醚(分析純)沉淀，離心分離，使脫樹脂溶液(三氟乙酸)與合成好的多肽分離；倒掉上層的脫樹脂溶液，最后用氮?dú)?N2)將沉淀的合成好的多肽吹干，置-40℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 二.抗原的包被將ANT、β1、M2、MHC抗原多肽片段分別溶解于四個(gè)裝有PH為9.2碳酸緩沖液的容器中，以每孔中100μl的碳酸緩沖液含1μg的相應(yīng)多肽抗原量進(jìn)行包被，置4℃冰箱18小時(shí)后，用洗滌液洗3次，每次3分鐘，拍干后將含1％牛血清白蛋白的磷酸緩沖液作為封閉液，每孔150μl封閉，置37℃孵浴2h，以消除非特異性反應(yīng)，拍干干燥后保存于4℃或-20℃冰箱備用。
三.試劑的配制(1)樣品的稀釋液(容積比)9份磷酸緩沖液(PH7.4)+1份小牛血清；(2)辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體；(3)顯色劑A200mg溶于無水乙醇100ml加水至1000ml(4)顯色劑B將磷酸氫二鈉14.6g，檸檬酸9.33g，0.75％過氧化氫尿素4.6ml溶于1000ml蒸餾水中即得顯色劑B；(5)終止液為2mol/L H2SO4；(6)洗液含0.1％Tween-20的0.01mol/L磷酸緩沖液(PH7.4)。
(7)陰性對(duì)照血清健康人血清50μl。
四、試劑盒的裝配本發(fā)明抗心肌抗體四聯(lián)診斷裝配有1.包被反應(yīng)板4塊，每塊96孔；2.樣品稀釋液1瓶40ml；3.洗液4瓶，每瓶50ml；4.酶標(biāo)二抗1瓶40ml；5.顯色劑A 4支，每支10ml；6.顯色劑B 4支，每支10ml；7.陰性對(duì)照血清1支50μl；8.終止液4支，每支10ml；9.說明書1份。
實(shí)施例2使用本發(fā)明診斷試劑盒的操作程序
1.配洗液取適量濃洗滌液，按1∶9(容積比)比例用蒸餾水稀釋備用；2.加樣品稀釋液用加樣器在每個(gè)反應(yīng)孔中加入100μl；3.加標(biāo)本和留空白對(duì)照將每份待檢標(biāo)本各1μl分別加入已有樣品稀釋液的各孔中，留下一孔不加標(biāo)本作為空白對(duì)照。
4.加陰性對(duì)照在設(shè)定為陰性對(duì)照的2孔中加入陰性對(duì)照血清，每孔加1μl；5.充分混合，37℃溫箱溫育60分鐘；6.洗板傾去內(nèi)容物，用洗滌液注滿反應(yīng)孔，靜置3分鐘，拍干如此重復(fù)3次；7.加酶標(biāo)二抗每孔各加入酶標(biāo)二抗100μl后，37℃溫育30分鐘；8.洗板傾去內(nèi)容物，用洗滌液注滿反應(yīng)孔，靜置3分鐘，拍干如此重復(fù)3次；9.加顯色劑每孔分別加入顯色劑A50μl后，再在每孔中加入顯色劑B50μl，混勻，37℃溫箱10分鐘；10.終止顯色完畢后立即加50μl終止液于各反應(yīng)孔；11.判讀用空白對(duì)照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)吸光值。
結(jié)果判定樣品吸光值-空白對(duì)照吸光值/陰性對(duì)照吸光值-空白對(duì)照吸光值(P/N)≥2.1為陽性。
以下為本發(fā)明涉及的氨基酸序列表。
序列1為合成的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列1；序列2為合成的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列2；序列3為合成的β1腎上腺素能受體肽段的氨基酸序列；序列4為合成的M2-膽堿能受體肽段的氨基酸序列；序列5為合成的心肌肌球蛋白重鏈(MHC)肽段的氨基酸序列1；序列6為合成的心肌肌球蛋白重鏈(MHC)肽段的氨基酸序列2；序列7為合成的心肌肌球蛋白重鏈(MHC)肽段的氨基酸序列3。
序列表<110>華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院<120>抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒<130>1<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>PRT<213>人類<400>1Pro Ile Gly Arg Val Lys Leu Leu Leu Gln1 5 10<210>2<211>8<212>PRT<213>人類<400>2Tyr Asp Glu Ile Lys Lys Phe Val1 5<210>3<211>27<212>PRT<213>人類<400>3His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp1 5 10 15Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys20 25<210>4<211>26<212>PRT<213>人類<400>4Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys Tyr Ile Gln Phe Phe Ser Asn1 5 10 15Ala Ala Val Thr Phe Gly Thr Ala Ile Cys20 25<210>5<211>10<212>PRT<213>人類<400>5Glu Ile Glu Arg Lys Leu Ala Glu Lys Asp1 5 10<210>6<211>8<212>PRT<213>人類
<400>6Val Asp Lys Leu Gln Leu Lys Val1 5<210>7<211>13<212>PRT<213>人類<400>7Ala Lys Ser Arg Asp Ile Gly Ala Lys Gly Leu Asn Glu1 5 10
權(quán)利要求
1.一種抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒，包括A.分別包被有與心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ADP/ATP載體蛋白抗原、β1腎上腺素能受體抗原、M2-膽堿能受體抗原和心肌肌球蛋白重鏈抗原四種心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反應(yīng)板，該人工合成的抗原多肽分別具有序列表中序列1至序列7的氨基酸序列。B.辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG酶標(biāo)二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于還包括樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色劑A、顯色劑B、陰性對(duì)照血清、終止液和說明書，樣品稀釋液是PH為7.4的磷酸緩沖液與小牛血清的混合液，磷酸緩沖液與小牛血清的容積比為9∶1；濃縮洗液為含0.1％Tween-20的磷酸緩沖液，其PH為7.4；顯色劑A由磷酸氫二鈉14.6g和檸檬酸9.33g溶于0.75％過氧化氫尿素4.6ml中，再加水至1000ml配制而成；顯色劑B由四甲基聯(lián)苯胺(TMB)200mg溶于無水乙醇100ml中，再加水至1000ml配制而成；陰性對(duì)照血清為健康人血清；終止液為2mol/L硫酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒在診斷病毒性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗心肌抗體四聯(lián)診斷試劑盒，包括包被有與四種心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反應(yīng)板、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG酶標(biāo)二抗、樣品稀釋液、濃縮洗液、顯色劑A、顯色劑B、陰性對(duì)照血清、終止液和說明書，本發(fā)明試劑盒對(duì)病毒性心肌炎和擴(kuò)張型心肌病有較高的敏感性和較強(qiáng)的特異性。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1967249SQ20051001980
公開日2007年5月23日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者廖玉華, 王敏, 汪朝暉, 苑海濤, 董繼華, 王朝暉, 袁瑾, 程翔 申請(qǐng)人:華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院