專(zhuān)利名稱(chēng)：使用硬骨魚(yú)體內(nèi)篩選心臟毒性劑的方法
使用硬骨魚(yú)體內(nèi)篩選心臟毒性劑的方法背景——發(fā)明領(lǐng)域心律失常，是指心搏過(guò)快(心搏過(guò)速)、過(guò)慢或不規(guī)則(心搏徐緩) 的一組狀況，是一種威脅生命的醫(yī)學(xué)緊急情況，其引起心搏停止和猝死(Kleber和Rudy. 2004 )。先天性或獲得性心律失常的通常起因是遺傳 的和化學(xué)/疾病誘導(dǎo)的心律的擾動(dòng)。超過(guò)50種治療化合物已表現(xiàn)出誘導(dǎo) 意外的心律失常的可能，且其中的一些已在市場(chǎng)上被撤回。心律失常目 前被認(rèn)為是用于預(yù)測(cè)新治療化合物的人體安全性的重要的風(fēng)險(xiǎn)要素。因 此，藥物管理機(jī)構(gòu)現(xiàn)在增加了對(duì)治療化合物引起心律失常的潛在可能性 的關(guān)注，且對(duì)促進(jìn)心律失常的評(píng)估的管理建議已經(jīng)發(fā)行(Stockbridge和 Throckmorton. 2004)。背景知識(shí)和現(xiàn)有技術(shù)描述心律失常的細(xì)胞電生理學(xué)基礎(chǔ)是由于離子通道阻塞，從而導(dǎo)致復(fù)極 化的延遲和QT間隔的延長(zhǎng)，Q點(diǎn)與T點(diǎn)之間的間隔更長(zhǎng)的ECG的特征(Keating和Sanguinetti. 2001; Roden等人，2002 )。因?yàn)閔ERG (人 "/^^-go-go-re/a^/基因)是大多數(shù)引起心律失常的非心臟類(lèi)藥物的耙(Abriel等人.2004; Joshi等人.2004 ),所以hERG受到了特別的關(guān)注， 該基因編碼快激活延遲整流鉀通道的孔形成性a亞單元。該通道負(fù)責(zé)讓 鉀流復(fù)極化，所迷鉀流因?yàn)閺?qiáng)的內(nèi)向整流而區(qū)別于其他流。該通道的抑 制，不管是通過(guò)外源化合物還是由于遺傳突變，增加了心臟肌細(xì)胞中動(dòng) 作電位復(fù)極化的持續(xù)時(shí)間，從而導(dǎo)致心律失常。然而，心律失常不僅僅 是因?yàn)閔ERG的功能失常，還因?yàn)槠渌x子通道的功能失常，例如納通 道和4丐通道。因此，重點(diǎn)被放在通過(guò)高靈敏的和特異的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)有任 何意外的心臟毒性作用的新治療化合物在臨床前的篩選上(Joshi等人, 2004)。傳統(tǒng)上，膜片箝電生理學(xué)被認(rèn)為是測(cè)量離子通道活性的"黃金標(biāo)準(zhǔn)" (Fermini和Fossa. 2003)。膜片箝允許在全細(xì)胞才莫型中直接和實(shí)時(shí)地監(jiān)控 在施用測(cè)試化合物期間離子通道的活性。然而，這是一種低通量的方法 并且需要高度純熟的操作員。雖然近期發(fā)展了其他先進(jìn)的篩選技術(shù)來(lái)增加通量程度，但是所有這些技術(shù)都是基于體外細(xì)胞培養(yǎng)模型的。使用體 外模型的缺點(diǎn)是在體外系統(tǒng)中無(wú)法模擬體內(nèi)存在的復(fù)雜生理環(huán)境。 一些 心臟電生理學(xué)的生物學(xué)問(wèn)題無(wú)法簡(jiǎn)單地通過(guò)體外測(cè)定得到解決。在這種 情況下已采用了體內(nèi)模型，包括豚鼠、狗和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物。在麻醉的動(dòng)物中在一定范圍的漸增劑量上連續(xù)記錄ECG來(lái)測(cè)定任何心率失常的出現(xiàn)。而且，由于道德問(wèn)題和成本效率，它們并沒(méi)有被廣泛使用。因此有需要 發(fā)展一種低成本且高效率的新技術(shù)。斑馬魚(yú)已經(jīng)作為模型在發(fā)育生物學(xué)研究、毒理學(xué)研究以及藥學(xué)研究中使用。斑馬魚(yú)體內(nèi)生物測(cè)定結(jié)合了與哺乳動(dòng)物體內(nèi)測(cè)定相比的高通量 和與體外測(cè)定相比的高相關(guān)性的優(yōu)點(diǎn)。近來(lái)，已有兩篇論證斑馬魚(yú)對(duì)已熟知的誘導(dǎo)人類(lèi)心率失常的化合物有相似的生理學(xué)反應(yīng)的文章發(fā)表(Langheinrich等人，2003; Milan等人，2003)。而且，hERG的直向同源物 被克隆，并在孔區(qū)域以及環(huán)核苷酸結(jié)合區(qū)域的蛋白質(zhì)序列中表現(xiàn)出高度 的相似性，其中一些心臟毒性化合物與所述區(qū)域結(jié)合(Langheinrich等人, 2003)。另外，在zERG中的突變顯出與人類(lèi)相似的心率失常表型。這些 結(jié)果提示斑馬魚(yú)可能可以被用作篩選有心臟毒性的化合物的模型。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了在斑馬魚(yú)中測(cè)量心臟功能的方法。但是，這些方法通常 低通量、耗時(shí)且是勞動(dòng)密集型的。最簡(jiǎn)單的方法是在常規(guī)光學(xué)顯微鏡或 立體顯微鏡下用秒表對(duì)每分鐘心搏數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)(Langheinrich等人， 2003)。已開(kāi)發(fā)了對(duì)心臟的數(shù)字影片的圖象分析方法(Milan等人，2003)。 測(cè)量心臟特定區(qū)域的平均像素強(qiáng)度。對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行快速傅里葉變換來(lái) 確定心搏率。除心搏率之外，還發(fā)展了其他心臟參數(shù)如心輸出量、血流 動(dòng)力學(xué)及電特性((Schwerte和Fritsche. 2003)綜述)。心輸出量是心臟生 理學(xué)的重要參數(shù)，能通過(guò)經(jīng)由拍攝搏動(dòng)的心室計(jì)算心動(dòng)周期期間的心室 體積非侵入性地在透明的斑馬魚(yú)胚胎中進(jìn)行測(cè)定。體積計(jì)算公式需要心 室的軸長(zhǎng)，該軸長(zhǎng)可以通過(guò)手工或借助計(jì)算機(jī)程序自動(dòng)畫(huà)出心室輪廓來(lái) 獲得。由血壓確定的血流動(dòng)力學(xué)能使用伺服零位微壓(servo-null micropressure )系統(tǒng)測(cè)量。在該系統(tǒng)中，充滿(mǎn)高濃度氯化鈉溶液的^皮璃 毛細(xì)管被使用顯微操作器插入目標(biāo)血管中。血管中壓力的變化會(huì)移動(dòng)血 漿與氯化鈉溶液之間的界面，從而導(dǎo)致在玻璃毛細(xì)管中的電極的電阻發(fā) 生變化。近來(lái)，已開(kāi)發(fā)了對(duì)斑馬魚(yú)胚胎中電特性進(jìn)行測(cè)量的方法 (Forouhar等人，2004)。在該方法中，將5天大的胚胎沿它們背腹側(cè)方向4放置，且兩根電極通過(guò)顯微操作器確定好位置， 一個(gè)放置在心臟外的體 表，而另一個(gè)參考電極放置在周?chē)娜芤褐?。然而，這些方法同樣是耗 時(shí)和勞動(dòng)密集型的，特別在樣品制備步驟中，從而使它們不適合高通量 的研究。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用硬骨魚(yú)作為模型來(lái)篩選有任何心臟毒性作用的試 劑的方法，這種毒性作用特指心搏率和心搏節(jié)律的改變。將硬骨魚(yú)的胚 胎或幼體浸泡在含有測(cè)試試劑的培養(yǎng)基中一段特定的時(shí)間。接著，將硬 骨魚(yú)用瓊脂糖、瓊脂或是曱基纖維素固定。血細(xì)胞的循環(huán)通過(guò)裝配有連接到諸如VCR記錄儀、數(shù)碼攝像機(jī)或個(gè)人電腦的記錄設(shè)備的數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡進(jìn)行錄像。血液循環(huán)的錄像然后通過(guò)圖像分析軟件用視頻圖像分析方法分析，在這里在每個(gè)圖像幀(video frame)中的移動(dòng)的血細(xì)胞 被檢測(cè)并定量。從部分視頻或完整視頻中的每個(gè)圖像幀中都獲得 一 系列 的數(shù)據(jù)點(diǎn)。再使用功率譜分析對(duì)這一系列的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行分析，通過(guò)分析 可以獲得心搏率和心搏節(jié)律的定量參數(shù)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過(guò)本 發(fā)明計(jì)算出的心搏率與通過(guò)直接檢查心臟獲得的心搏率相等。而且，我 們的結(jié)果還顯示心搏節(jié)律的定量參數(shù)，即通過(guò)本發(fā)明計(jì)算所得的心臟節(jié) 律性指數(shù)，與心搏節(jié)律的規(guī)則性負(fù)相關(guān)。發(fā)明詳述本發(fā)明描述了使用硬骨魚(yú)來(lái)篩選有任何心臟毒性作用的試劑的方 法，這種毒性作用特指心搏率和心搏節(jié)律的改變。硬骨魚(yú)可以是屬于硬骨魚(yú)類(lèi)(Teleostomi)亞綱的任何魚(yú)的胚胎或 幼體，優(yōu)選地，如斑馬魚(yú)和青鄉(xiāng)，因?yàn)楫?dāng)用于心臟毒性測(cè)定時(shí)，它們相 對(duì)于其他動(dòng)物模型提供體外受精和透明的優(yōu)勢(shì)。向硬骨魚(yú)暴露試劑可以從受精時(shí)開(kāi)始或從受精后的特定時(shí)間開(kāi)始。 暴露的長(zhǎng)度可以覆蓋從開(kāi)始暴露到檢查時(shí)，或在特定長(zhǎng)度的暴露時(shí)間后 緊跟一段恢復(fù)時(shí)間，在此期間硬骨魚(yú)將被浸泡在不含測(cè)試試劑的培養(yǎng)基 里。試劑可以溶解于用于浸泡硬骨魚(yú)的水或培養(yǎng)基中?？蛇x地，不溶于 水的試劑可以以高濃度溶解于DMSO中，且在暴露期間直接加入到浸泡 培養(yǎng)基中。在對(duì)血細(xì)胞循環(huán)錄像前，硬骨魚(yú)被固定化于表面上，如載玻片或塑 料培養(yǎng)皿。固定化培養(yǎng)基可以是瓊脂糖、瓊脂或曱基纖維素。使用的最
佳瓊脂糖或瓊脂的濃度是0.5。/。(w/v)或更低。使用的曱基纖維素的濃度 是2-4。/。(w/v)。硬骨魚(yú)的方向應(yīng)該是沿它們自發(fā)的側(cè)向位置。優(yōu)選地， 在硬骨魚(yú)后尾部的循環(huán)對(duì)本發(fā)明中進(jìn)行心臟毒性分析而言是理想的。
錄制成像系統(tǒng)由擁有低放大倍數(shù)物鏡的顯微鏡組成，立體顯微鏡或 常規(guī)光學(xué)顯微鏡都行(

圖1)。顯微鏡與相機(jī)相連，模擬的或數(shù)碼的都 行，所述相機(jī)連接記錄設(shè)備，如VCR記錄儀、數(shù)碼攝像機(jī)或帶有有圖 像幀抓取器的個(gè)人電腦。被記錄在諸如VCR帶或迷你DV帶這樣的介 質(zhì)上，或被記錄在個(gè)人電腦里的錄像;波轉(zhuǎn)換回諸如AVI或WMV格式的 可讀形式，并儲(chǔ)存于個(gè)人電腦中以供進(jìn)一步作錄像圖像分析。對(duì)每個(gè)硬 骨魚(yú)樣品的錄像長(zhǎng)度應(yīng)不少于20秒。
隨后通過(guò)在自制軟件中實(shí)現(xiàn)的新算法進(jìn)行錄像圖像分析。在這種算 法里，從個(gè)人電腦中存儲(chǔ)的AVI或WMV格式的錄像文件中抓取圖像幀， 并立即用與它連續(xù)的圖像幀相減。這種相減是以 一 個(gè)像素 一 個(gè)像素的方 式對(duì)像素強(qiáng)度值進(jìn)行的。任何出現(xiàn)在兩個(gè)連續(xù)圖像幀的運(yùn)動(dòng)都將導(dǎo)致像 素強(qiáng)度的差異。因此，相減將揭示在錄像中移動(dòng)的血細(xì)胞。相減結(jié)果的 例子展現(xiàn)在圖2中。由于每個(gè)圖像幀之間的時(shí)間間隔是恒定的，而有差 別像素的量與兩圖像幀之間血細(xì)胞行進(jìn)的距離相關(guān)，所以有差別像素的 量能被用來(lái)估算血細(xì)胞的速度。將有差別像素，即，與連續(xù)圖像幀中相 應(yīng)的像素有不同像素強(qiáng)度的像素的量，對(duì)以秒表示的時(shí)間作圖，表現(xiàn)出 具有規(guī)則振動(dòng)的波形曲線(xiàn)(圖3),從而提示血細(xì)胞速度中的振動(dòng)。
對(duì)從錄像圖像分析中得到的 一 系列有差別像素的量的數(shù)據(jù)分析是 用在自制軟件中實(shí)現(xiàn)的方法進(jìn)行的。有差別像素的量的數(shù)據(jù)系列是通過(guò) 包含功率譜分析來(lái)分析的，其中有差別像素的數(shù)據(jù)系列通過(guò)離散傅里葉 變換被分解。使用離散傅里葉變換算法(Ferguson. 1979)。功率鐠經(jīng)過(guò)傅 里葉系列的自相關(guān)獲得，并對(duì)頻率值進(jìn)行作圖(圖4)。譜的總功率值 被計(jì)算出來(lái)。具有最低頻率值的最高峰(pmax)被定義為輸入信號(hào)的基 本頻率組分。該頻率值與心搏率相等。最高峰值與總功率值的比被當(dāng)作 是心臟節(jié)律性指數(shù)。所述計(jì)算的原理是當(dāng)輸入信號(hào)具有圍繞基本頻率組 分變動(dòng)的頻率時(shí)，基本頻率組分在其功率譜中的峰將較低而它周?chē)念l 率組分較高。這樣，基本頻率組分的功率與總功率的比降低。本實(shí)施方案是在52hpf的野生型胚胎中測(cè)試的。心臟與尾循環(huán)被錄 像用于分析。心搏率通過(guò)直接目測(cè)計(jì)數(shù)一分鐘中心搏數(shù)而確定。另外， 通過(guò)將功率譜中的基本頻率組分乘以60計(jì)算得出心搏率。計(jì)算出的心 搏率與通過(guò)直接對(duì)心臟檢查得到的心搏率是相關(guān)的(圖5)。另外，心 臟節(jié)律作為心搏時(shí)間間隔的標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定。如果心搏不規(guī)則，那么心搏
時(shí)間間隔的標(biāo)準(zhǔn)差就會(huì)增加。心臟節(jié)律性指數(shù)計(jì)算為基本頻率值的功率 值與完整譜總功率值的比。心臟節(jié)律性指數(shù)與通過(guò)直接對(duì)心臟檢查得到 的心搏時(shí)間間隔的標(biāo)準(zhǔn)差是負(fù)相關(guān)的(圖6)，從而提示節(jié)律性指數(shù)越 大心搏節(jié)律就越規(guī)則。
附圖簡(jiǎn)述
圖1成像系統(tǒng)示意圖。
圖2圖像相減結(jié)果示例。
圖3 4秒鐘持續(xù)時(shí)間內(nèi)有差別像素的圖。
圖4說(shuō)明基本頻率組分和它的功率峰值的鑒定以及總功率計(jì)算的 示意圖。
圖5通過(guò)功率譜分析從心臟與尾循環(huán)測(cè)定的心搏率之間的相關(guān)性。 圖6通過(guò)功率鐠分析測(cè)定的心臟節(jié)律與節(jié)律性指數(shù)之間的相關(guān)性。 圖7通過(guò)直接檢查心臟和功率譜分析確定的氟哌丁苯誘導(dǎo)的心搏 率變化的比較。星號(hào)表示對(duì)照組和氟哌丁苯組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差異 (/ <0.05)。
圖8通過(guò)直接檢查心臟和功率譜分析確定的氟哌丁苯誘導(dǎo)的心搏 節(jié)律性變化的比較。星號(hào)表示對(duì)照組和氟哌丁苯組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差 異(/ <0.05),而雙星號(hào)表示對(duì)照組和氟哌丁苯組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的差 異(/ <0.01 )。
實(shí)施例
本實(shí)施例說(shuō)明了使用本發(fā)明來(lái)確定暴露在眾所周知的誘導(dǎo)人心率 失常的藥物——氟哌丁苯下的斑馬魚(yú)幼體中心搏率和心臟節(jié)律性指數(shù)。 氟哌丁苯是苯丙曱酮(butyropherone )的衍生物，有抗緊張劑的性質(zhì)。 心率失常已經(jīng)與經(jīng)口使用氟哌丁苯相關(guān)(Henderson等人，1991 )而且氟哌 丁苯誘導(dǎo)的心率失常的才幾制涉及hERG通道的阻塞(Suessbrich等人,1997)。
氟哌丁苯的儲(chǔ)備溶液是通過(guò)將其溶于DMSO中制得的，終濃度為 2mM。收集斑馬魚(yú)卵并將卵放置于卵培養(yǎng)基(19.3 mM NaCl, 0.23 mM KC1, 0.13 mM MgS04ci7H20, 0.2 mM Ca(N03)2, 1.67 mM Hepes (pH 7.2) 中，在根據(jù)生活力分選前在28.5。C下放4個(gè)小時(shí)。健康的胚胎然后在 28.5。C下溫育最多48hpf。將6 pi儲(chǔ)備溶液加入6ml的含有20個(gè)健康的 48-hpf胚胎的卵培養(yǎng)基中。氟哌丁苯的終濃度是2 ^M,且DMSO的終 濃度是0.1%，在所述濃度在斑馬魚(yú)中未觀察到效果。經(jīng)過(guò)4小時(shí)的溫育， 斑馬魚(yú)的血液循環(huán)通過(guò)裝有以S-視頻電纜與數(shù)碼攝像機(jī)相連的CCD 相機(jī)的立體顯微鏡被檢查和錄像。錄像被存儲(chǔ)在迷你DV帶上，并通過(guò) 數(shù)碼攝像機(jī)與電腦之間的i-Link連接被轉(zhuǎn)移回個(gè)人電腦上。錄像剪輯以 AVI格式存儲(chǔ)于個(gè)人電腦上。圖像分析和數(shù)據(jù)分析都通過(guò)我們自制的軟 件實(shí)現(xiàn)的圖像分析和數(shù)據(jù)分析算法進(jìn)行。
在經(jīng)過(guò)氟哌丁苯的處理后，心搏率顯著降低(圖7),與已公布數(shù) 據(jù)相似(Langheinrich等人，2003; Milan等人，2003)。除心搏率以外，我 們還分析了氟哌丁苯處理后心搏的節(jié)律性，這還沒(méi)有在任何評(píng)估斑馬魚(yú) 胚胎心臟功能的文章中公布過(guò)。通過(guò)直接才全查心臟測(cè)定的每次心搏之間 的時(shí)間間隔的標(biāo)準(zhǔn)差增加了 (圖8)。與此同時(shí)，經(jīng)處理的胚胎的心臟 節(jié)律性指數(shù)降低了 (圖8)。
權(quán)利要求
1.一種篩選有干涉心搏率和心搏節(jié)律能力的試劑的方法，該方法包括a.將硬骨魚(yú)在含有測(cè)試試劑的培養(yǎng)基中溫育；b.將硬骨魚(yú)在用含測(cè)試試劑的培養(yǎng)基浸泡的載玻片上固定化；c.對(duì)血液循環(huán)錄像；d.利用錄像圖像分析法分析心臟功能。
2. 權(quán)利要求l的方法，其中所述硬骨魚(yú)是指斑馬魚(yú)。
3. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)包括至少?gòu)氖芫?天開(kāi)始 溫育硬骨魚(yú)的受精卵。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(a)將硬骨魚(yú)在含有待測(cè)試劑的 溫育培養(yǎng)基中再溫育4個(gè)小時(shí)。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(b)包括將硬骨魚(yú)胚胎或幼體固 定化在固定化培養(yǎng)基中，如瓊脂糖、瓊脂或曱基纖維素。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)包括對(duì)胚胎或幼體身體任意 部分的血液循環(huán)進(jìn)行至少20秒的錄4象記錄。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)優(yōu)選的待記錄部分是尾。
8. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)包括在錄像中能夠鑒定移動(dòng) 的血細(xì)胞的錄像圖像分析方法。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中該分析方法能計(jì)算出血細(xì)胞在分析的時(shí) 間間隔內(nèi)行進(jìn)的距離，且因而血細(xì)胞的速度。
10. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)進(jìn)一步包括通過(guò)計(jì)算血細(xì)胞 出現(xiàn)兩次最大速度之間的時(shí)間間隔計(jì)算心搏率的算法。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)進(jìn)一步包括對(duì)血細(xì)胞速度數(shù) 據(jù)點(diǎn)的數(shù)學(xué)分析以獲取頻率信息和功率譜信息。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用硬骨魚(yú)胚胎和幼體，基于觀察心搏率和心節(jié)律的改變來(lái)針對(duì)心臟毒性篩選試劑的方法。本發(fā)明還涉及一種對(duì)硬骨魚(yú)中與心臟功能有關(guān)的基因的鑒定方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK101646941SQ200780049451
公開(kāi)日2010年2月10日 申請(qǐng)日期2007年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月8日
發(fā)明者鄭淑嫻, 陳保國(guó) 申請(qǐng)人:香港城市大學(xué)