本發(fā)明屬于醫(yī)療診斷領(lǐng)域，具體涉及一種含有細(xì)胞的樣品中細(xì)菌的分離裝置和分離方法。
背景技術(shù)：
：人的痰液樣本主要由人體分泌物，人的免疫細(xì)胞，病原菌等微生物組成，是潛在的一個(gè)重要無創(chuàng)醫(yī)療診斷的信息來源。在使用抗生素前，往往需要對(duì)病原菌進(jìn)行培養(yǎng)并作耐藥性分析以避免抗生素的濫用。在這個(gè)過程中，病原菌的培養(yǎng)難度比較大，同時(shí)需要在治療前消耗大量的時(shí)間。而目前在做痰液病原菌基因組分析，或者利用微液滴技術(shù)做實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)的過程中，存在樣本難以去除痰液中有的大量的人的免疫細(xì)胞的問題，樣品難以滿足基因組分析或者微液滴定量pcr的需求。微流控技術(shù)是近幾年飛速發(fā)展的前沿學(xué)科，憑借其用量少、高通量和易于集成等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為生物樣品分析領(lǐng)域中一個(gè)強(qiáng)有力的手段。近來，微流控裝置(morijiri,t.etal.,2011.sedimentationpinched-flowfractionationforsize-anddensity-basedparticlesortinginmicrochannels.microfluidicsandnanofluidics,11(1),pp.105–110.)也被廣泛用來顆粒樣品的分離和提純。huanglr等人制作的分離芯片是基于確定性側(cè)向位移法(deterministiclateraldisplacement，dld)原理設(shè)計(jì)的。芯片內(nèi)有與流體流動(dòng)方向呈一定角度的微柱陣列。不同尺寸的顆粒在流動(dòng)過程中與微柱碰撞后具有不同的運(yùn)動(dòng)軌跡，尺寸大的顆粒會(huì)發(fā)生側(cè)向位移向一側(cè)匯聚，尺寸小的顆粒會(huì)按原軌跡運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到分離不同尺寸的顆粒(science.2004,304(5673):987-990)?？傮w來說，這些芯片目前還存在需要多路流體控制，分離效率不高，無法滿足真實(shí)痰液樣本病原菌的純化等缺點(diǎn)。本發(fā)明相對(duì)的單位時(shí)間上樣量更大，能夠手動(dòng)上樣，操作更為簡(jiǎn)便。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決本領(lǐng)域存在的問題，本發(fā)明在痰液樣本中病原菌的快速提純上做了有益改進(jìn)。本發(fā)明的第一個(gè)目的是提出一種痰液樣品中病原菌的快速提純裝置。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提出一種痰液樣品中病原菌的快速提純方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述目的的技術(shù)方案為：一種痰液樣品中病原菌的快速提純裝置，包括病原菌收集通道和由串聯(lián)的分離單元構(gòu)成的主通道，多個(gè)串聯(lián)的分離單元形成串狀結(jié)構(gòu)，所述串狀結(jié)構(gòu)與病原菌收集通道平行；每個(gè)分離單元包括至少有部分凸起朝向所述病原菌收集通道的弧形部分，弧形部分的凸起與所述病原菌收集通道通過柵欄連接。其中，所述快速提純裝置包括上層芯片和下層芯片，所述主通道和病原菌收集通道設(shè)置在中層芯片上，在上層芯片上一端設(shè)置有進(jìn)液孔，另一端設(shè)置有病原菌收集孔和廢液收集孔，所述進(jìn)液孔與所述分離單元串狀結(jié)構(gòu)的一端連通，所述病原菌收集孔與所述病原菌收集通道連通，所述廢液收集孔與分離單元串狀結(jié)構(gòu)的另一端連通。芯片的下層具有支撐作用，可采用玻片或其他材質(zhì)的支撐基底。上層芯片和中層芯片可采用聚二甲基硅氧烷(pdms)制成。本發(fā)明優(yōu)選技術(shù)方案之一為，在中層芯片上設(shè)置有1～100條串聯(lián)單元構(gòu)成的串狀結(jié)構(gòu)和1～100條病原菌收集通道設(shè)置，串狀結(jié)構(gòu)和病原菌收集通道相間設(shè)置。更優(yōu)選地，相鄰分離單元的弧形部分之間以“凹”形通道連接，“凹”形底部最窄處寬度d為10～80μm。其中，所述柵欄包括多個(gè)柵欄通道，所述柵欄通道的內(nèi)徑為3～10μm。其中，分離單元的弧形部分最寬處寬度d為200～900μm，所述柵欄的寬度為d的5～90％。上述的分離單元尺寸設(shè)計(jì)，使樣品在主通道內(nèi)保持層流形式，所以柵欄的寬度之和為d的5～90％，則可以對(duì)樣品中5～90％的液體進(jìn)行分離。所述的快速提純裝置，通過以下方法制備而得：步驟一，將印有所述痰液樣品中病原菌快速提純的裝置形狀的曝光掩膜覆蓋在涂有光刻膠的硅片上；步驟二，將步驟一所得硅片曝光，硅片的覆蓋有曝光掩膜部分上的光刻膠在紫外線照射下反應(yīng)，得到光刻膠模具；步驟三，將用于制作所述痰液樣品中病原菌快速提純的裝置的材料澆鑄在所述光刻膠模具內(nèi)；步驟四，將澆鑄后得到的產(chǎn)品固化，并與玻片通過氧等離子體鍵合得到痰液樣品中病原菌快速提純裝置，一種痰液樣品中病原菌的快速提純方法，包括步驟：1)樣品中病原菌快速提純的裝置的內(nèi)部抽成5-100pa的真空；2)由進(jìn)液孔填充入0.1％的牛血清蛋白(bsa)溶液備用。3)將含有細(xì)胞的樣品液化，從所述進(jìn)液孔向痰液樣品中病原菌快速提純的裝置推入液化的痰液溶液，所述痰液溶液在所述裝置被施加的壓力推入分離單元并由不同的出口收集；4)收集病原菌收集孔的樣本即為提純后的病原菌樣本。優(yōu)選地，推入樣品的推液速度為0.2～30ml/hr。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提出的痰液樣品中病原菌的快速提純裝置，制備簡(jiǎn)單，流速快于現(xiàn)有的提純裝置，提純時(shí)不需使用流量泵，可以用于現(xiàn)場(chǎng)或野外操作。與現(xiàn)有技術(shù)和產(chǎn)品相比，本發(fā)明提出的痰液樣品中病原菌的快速提純裝置操作方便，操作時(shí)只需要簡(jiǎn)單將樣品推過芯片即可。穩(wěn)定性高，對(duì)不同的流速大小(0.2-30ml/h)，不同粘度的樣品，不同細(xì)菌比率的樣本，分離去除動(dòng)物細(xì)胞的效率穩(wěn)定在99％以上，收集病原菌能保持接近原樣品一半的水平。附圖說明圖1本發(fā)明微流控芯片上中下三層結(jié)構(gòu)分解立體圖；圖2是本發(fā)明的芯片上流道結(jié)構(gòu)俯視圖，圖3為主通道部分的流入病原菌收集通道部分的局部放大圖圖4為實(shí)施例1分離單元局部放大圖。圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)芯片分離kyse30-gfp細(xì)胞/t23101-cherry細(xì)菌混合液的效果；a)為數(shù)量比約為1:1的kyse30-gfp細(xì)胞與細(xì)菌t23101-cherry混合上樣液；b)廢液收集通道收集部分；c)病原菌收集通道收集部分；p1：gfp區(qū)，p2：cherry區(qū)；圖6為本發(fā)明痰液樣本進(jìn)樣前(圖6之a(chǎn)))和病原菌收集通道收集(圖6之b))的共聚焦熒光顯微圖；圖中，1為上層芯片，101為進(jìn)液孔，102為病原菌收集孔，103為廢液收集孔；2為中層芯片，201為病原菌收集通道，202為廢液收集通道，203為主通道，204為柵欄；3為玻片。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1芯片結(jié)構(gòu)及制備參見圖1，本快速提純裝置包括具有上中下三層結(jié)構(gòu)的微流控芯片。中層芯片2上設(shè)置有主通道203、廢液收集通道202和病原菌收集通道201；本實(shí)施例中，在中層芯片2上設(shè)置有8條串聯(lián)單元構(gòu)成的串狀結(jié)構(gòu)和12條病原菌收集通道，串狀結(jié)構(gòu)和病原菌收集通道相間平行設(shè)置。在上層芯片1上一端設(shè)置有進(jìn)液孔101，另一端設(shè)置有病原菌收集孔102和廢液收集孔103，所述進(jìn)液孔與所述分離單元串狀結(jié)構(gòu)的一端連通，所述病原菌收集孔與所述病原菌收集通道連通，所述廢液收集孔與分離單元串狀結(jié)構(gòu)的另一端連通。下層為玻片3，起支撐作用。參見圖2，中層芯片上設(shè)置有多個(gè)串聯(lián)的分離單元和病原菌收集通道201，串聯(lián)單元構(gòu)成的串狀結(jié)構(gòu)與病原菌收集通道201平行，每個(gè)分離單元包括多個(gè)有部分為弧形的主通道203，相鄰分離單元的弧形主通道以“凹”形通道相連，使各分離單元串聯(lián)連接成為串狀的結(jié)構(gòu)，主通道中的弧形凸起部分通過柵欄與所述病原菌收集通道連接。圖2中箭頭表示推液方向。參見圖3，本實(shí)施例中，相鄰分離單元的弧形部分之間以“凹”形通道連接，“凹”形底部最窄處寬度d為40μm。柵欄包括多個(gè)柵欄通道，所述柵欄通道的內(nèi)徑(寬)為4μm。主通道203弧形部分最寬處寬度d為500μm，柵欄的寬度為d的20％。本快速提純裝置，通過以下方法制備而得：步驟一，將印有所述痰液樣品中病原菌快速提純的裝置形狀的曝光掩膜覆蓋在涂有光刻膠的硅片上；步驟二，將步驟一所得硅片曝光，硅片的覆蓋有曝光掩膜部分上的光刻膠在紫外線照射下反應(yīng)，得到光刻膠模具；步驟三，將用于制作所述痰液樣品中病原菌快速提純的裝置的pdms材料澆鑄在所述光刻膠模具內(nèi)；步驟四，將澆鑄后得到的產(chǎn)品固化，并與玻片通過氧等離子體鍵合得到痰液樣品中病原菌快速提純裝置。實(shí)施例2：芯片的使用以及分離效率的檢測(cè)分別以kyse30-gfp細(xì)胞與紅光標(biāo)記細(xì)菌t23101-cherry模擬痰液中的脫落細(xì)胞與病原菌，以一定數(shù)量比混合，通過快速提純裝置芯片分離檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)菌分離效率。具體步驟是，胰酶消化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染gfp食管癌細(xì)胞kyse30-gfp(綠光)，加入10％fbsrpm1640培養(yǎng)基終止，1000rpm離心5min，去除上清，加入含4％胎牛血清pbs(ph＝7.4)，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度0.5-1x106個(gè)/ml。挑取紅光標(biāo)記細(xì)菌t23101-cherry至2mllb培養(yǎng)基(amp+)37℃200rpm培養(yǎng)過夜，4000rpm離心5min，去除上清，加入pbs渦旋震蕩懸浮細(xì)菌，倍比稀釋菌液后，計(jì)數(shù)細(xì)菌。取500μl細(xì)胞懸液，加入400μlpbs(ph＝7.4)共3管，第一管加入108個(gè)/ml細(xì)菌(100μl)，以下各管10倍比稀釋，比例見表1第一行。將實(shí)施例1的病原菌快速提純的裝置的內(nèi)部抽成10pa的真空，并由進(jìn)液孔填充入0.1％的牛血清蛋白(bsa)溶液備用。以流速10ml/hr手動(dòng)推入樣品，收集病原菌收集孔收集(分離的細(xì)菌部分)與廢液收集孔部分，利用bdfacsaria流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)菌比率(圖5)。根據(jù)流式結(jié)果，分析不同濃度細(xì)菌條件下細(xì)胞去除效率與細(xì)菌回收率。通過表1定量的分析結(jié)果可以看出，測(cè)試樣品中的細(xì)胞濾除率應(yīng)在99％以上。表1：不同細(xì)菌密度樣品純化前后對(duì)比初始細(xì)菌/細(xì)胞密度比1011/10純化后細(xì)菌/細(xì)胞密度比2000916162實(shí)施例3：痰液樣本的分離效率檢測(cè)痰液樣本經(jīng)saccomanno-dtt法液化后，加入細(xì)菌bw25113(gfp+)后通入痰液樣品中病原菌快速提純的裝置進(jìn)行分離。操作方法同實(shí)施例2。液化痰液分離后加入hoechst33342(100×)染色10min,3000rpm離心3min，pbs洗一次，1/50體積pbs懸起，取1μl滴于載玻片，蓋玻片封片后，激光掃描共聚焦顯微鏡分析芯片分離液化痰液中細(xì)胞與細(xì)菌的效果，參見圖6。同時(shí)以gfp基因代表細(xì)菌，人btf基因代表細(xì)胞，對(duì)原樣與純化收集樣進(jìn)行rt-pcr，檢測(cè)分析痰液樣本中細(xì)胞與細(xì)菌的分離效率。gfp引物(pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度168bp)：引物gfpf：5’tgttccatggccaacacttg3’引物gfpr：5’gcacgtgtcttgtagttccc3’taqman探針：5’fam-cgcgtatggtcttcaatgct-bhq-13’btf引物(pcr產(chǎn)物長(zhǎng)度148bp)：引物btff：5’atgagacgaccttatgggtac3’引物btfr：5’ttggactcctggaacgtgaa3’rt-pcr反應(yīng)條件結(jié)果見表2，rt-pcr的結(jié)果顯示動(dòng)物細(xì)胞的信號(hào)去除率達(dá)到99％以上，而細(xì)菌的rt-pcr信號(hào)的回收信號(hào)大致都能保持在30％以上。表2不同細(xì)菌密度的痰液樣本的rtpcr結(jié)果細(xì)菌濃度個(gè)/ml細(xì)菌回收率，％細(xì)胞去除率，％10751.1599.9810639.0599.9910544.0399.9610433.5699.99以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。sequencelisting<110>中國科學(xué)院北京基因組研究所<120>痰液樣品中病原菌的快速提純裝置及快速提純方法<130>khp171111763.8tq<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1tgttccatggccaacacttg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gcacgtgtcttgtagttccc20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3cgcgtatggtcttcaatgct20<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4atgagacgaccttatgggtac21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5ttggactcctggaacgtgaa20當(dāng)前第1頁12