本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種應(yīng)用于防治鰻鱺病害的七星子新型單克隆抗體及其制備。

背景技術(shù)：

鰻鱺養(yǎng)殖在我國已有20多年的歷史，特別是近十多年來，發(fā)展更加迅速，現(xiàn)已成為世界第一養(yǎng)鰻大國，鰻鱺是中國輸出農(nóng)產(chǎn)品中賺取外匯最多的一項(xiàng)。

鰻鱺養(yǎng)殖發(fā)展迅速，與之相比，鰻鱺病害防治技術(shù)嚴(yán)重滯后，鰻鱺養(yǎng)殖密度大，單位養(yǎng)殖面積的產(chǎn)值高，受病害的威脅比目前其他水產(chǎn)養(yǎng)殖品種都嚴(yán)重得多，一旦發(fā)病，往往給養(yǎng)殖者造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。鰻鱺疾病按病原可分為細(xì)菌性、寄生蟲性、真菌性、病毒性及其他類型病原五大類，其中鰻鱺細(xì)菌性疾病為危害最嚴(yán)重的疾病。

為了促進(jìn)包括鰻鱺在內(nèi)的水產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，必須加快魚類基礎(chǔ)免疫學(xué)的研究，促進(jìn)魚類病原學(xué)、診斷技術(shù)和疫苗學(xué)的發(fā)展，將免疫預(yù)防手段引入到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上說現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，開展了鰻鱺新型單克隆抗體的制備研究，將免疫學(xué)運(yùn)用于鰻鱺病原診斷和流行病學(xué)研究。

本發(fā)明的目的是提供一種鰻鱺新型單克隆抗體。

本發(fā)明另一目的是提供上說鰻鱺新型單克隆抗體的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

首先，本發(fā)明提供了一種七星子可變淋巴細(xì)胞受體，即鼠抗vlr，以七星子血液淋巴細(xì)胞cdna為模板，利用引物f和引物r克隆出vlr目的基因片段，然后通過原核表達(dá)體系表達(dá)出目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，將免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞通過細(xì)胞融合，篩選得到針對(duì)vlr的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔得到單抗腹水，純化獲得七星子可變淋巴細(xì)胞受體；其中，引物f和引物r和序列分別如seqidno.1和2所示；。

具體地，是以七星子血液淋巴細(xì)胞cdna為模板，利用引物f和引物r，克隆出vlr目的基因片段，然后連接載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白vlr，表達(dá)菌破碎后純化目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，三次免疫后采血，提取純化，獲得七星子可變淋巴細(xì)胞受體，即鼠抗vlr。

本發(fā)明所制備的可變淋巴細(xì)胞受體(vlr)與igg相比有其更好的抗原識(shí)別靈敏性及更高的親和力，vlr理化性質(zhì)穩(wěn)定性優(yōu)于抗體分子，使其更容易保存。七星魚與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，vlr能夠突破因哺乳動(dòng)物免疫耐受而不能產(chǎn)生ig的限制，可以識(shí)別更廣泛的抗原表位，在免疫性疾病的治療上具有潛在的藥用價(jià)值。vlr在識(shí)別并特異性結(jié)合抗原方面比已有抗體具有更強(qiáng)的特異性及靈敏度。

因此，所述七星子可變淋巴細(xì)胞受體在制備用于防治鰻鱺病害的七星子vlr新型單克隆抗體中的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

具體地，所述鰻鱺病害是指鰻鱺愛德華氏菌病。

另外，本發(fā)明提供了一種用于防治鰻鱺病害的vlr新型單克隆抗體，是由鰻鱺igg抗體免疫七星子獲得獲得免疫七星子淋巴細(xì)胞，再將免疫七星子淋巴細(xì)胞與sp2/o骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，利用權(quán)利要求1所述七星子可變淋巴細(xì)胞受體篩選所得雜交瘤細(xì)胞腹腔接種balb/c小鼠制備得到。

具體地，所述鰻鱺單克隆抗體是由如下方法制備得到：

s1.制備七星子可變淋巴細(xì)胞受體：

以七星子血液淋巴細(xì)胞cdna為模板，利用引物f和引物r克隆出vlr目的基因片段，然后通過原核表達(dá)體系表達(dá)出目的蛋白vlr，然后免疫balb/c小鼠，將免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞通過細(xì)胞融合，間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(elisa)篩選得到針對(duì)vlr的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株；將雜交瘤細(xì)胞接種小鼠腹腔得到大量的單抗腹水，經(jīng)proteing親和純化后的單抗再進(jìn)行elisa與westernblotting檢測無誤后；最終獲得七星子可變淋巴細(xì)胞受體，即鼠抗vlr；其中，引物f和引物r和序列分別如seqidno.1和2所示；

引物f(seqidno.1)：gttcgtgctcagggacagaa；

引物r(seqidno.2)：tgctaagctgggtcaggttg；

s2.制備鰻鱺igg抗體；

s3.鰻鱺igg抗體免疫七星子獲得免疫七星子淋巴細(xì)胞；

s4.制備鰻鱺單克隆抗體：將免疫七星子淋巴細(xì)胞與sp2/o骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，利用鼠抗vlr篩選，再經(jīng)過有限稀釋法克隆制備單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞腹腔接種balb/c小鼠，收集腹水上清，制備獲得鰻鱺單克隆抗體。

更具體優(yōu)選地，所述鰻鱺單克隆抗體是由如下方法制備得到：

s1.制備鰻鱺igg抗體：

鰻鱺經(jīng)愛德華氏菌免疫后，分離血清，采用cnbr-activatedsepharose純化柱進(jìn)行純化獲得igg抗體；

s2.制備七星子可變淋巴細(xì)胞受體：

以七星子血液淋巴細(xì)胞cdna為模板，利用引物f：

gttcgtgctcgggacagaa和引物r：tgctaagctgggcaggttg，克隆出目基因片段，然后連接載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，表達(dá)菌破碎后純化目的蛋白，然后免疫balb/c小鼠，三次免疫后采血，提取純化，獲得七星子可變淋巴細(xì)胞受體；

s3.鰻鱺igg免疫七星子：

鰻鱺igg首次免疫劑量為100微克，與等量弗氏完全佐劑充分乳化后腹腔注射七星子，第二次以后抗原劑量減半與等量弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔注射七星子，3～4次免疫后采血，分離提取獲得免疫七星子淋巴細(xì)胞；

s4.制備鰻鱺單克隆抗體：

在無菌條件將免疫七星子淋巴細(xì)胞重懸于dmem，并與sp2/o骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合；檢測雜交瘤細(xì)胞上清，取抗體陽性細(xì)胞經(jīng)過有限稀釋法克隆，制備單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞腹腔接種6周齡balb/c小鼠，10d后采腹水，收集上清。

另外，上述鰻鱺單克隆抗體在作為或制備抗鰻鱺愛德華氏菌的藥物方面的應(yīng)用，以及在作為或制備鰻鱺愛德華氏菌病的防治藥物方面的應(yīng)用，均應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明提供了一種鰻鱺的新型七星子vlr單克隆抗體，該抗體對(duì)愛德華氏菌具有顯著的殺菌作用，能夠用于防治鰻鱺的愛德華氏菌病，且在識(shí)別和特異性結(jié)合抗原方面具有很高的特異性，靈敏性高。

而且，在本發(fā)明的方案中，可變淋巴細(xì)胞受體(vlr)與igg相比有其更好的抗原識(shí)別靈敏性及更高的親和力，vlr理化性質(zhì)穩(wěn)定性優(yōu)于抗體分子，使其更容易保存。七星魚與哺乳動(dòng)物親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，vlr能夠突破因哺乳動(dòng)物免疫耐受而不能產(chǎn)生ig的限制，可以識(shí)別更廣泛的抗原表位，在免疫性疾病的治療上具有潛在的藥用價(jià)值。vlr在識(shí)別并特異性結(jié)合抗原方面比已有抗體具有更強(qiáng)的特異性及靈敏度。

附圖說明

圖1為對(duì)克隆出的目的基因的檢測。

圖2為目的蛋白的檢測。

圖3為鰻鱺igg免疫七星子后的效價(jià)檢測。

圖4為western-blot分析抗體特性。

圖5為小鼠腹水中單克隆抗體效價(jià)檢測。

圖6為單克隆抗體活性檢測。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1制備鰻鱺單克隆抗體

1、七星子可變淋巴細(xì)胞受體的制備

七星子體內(nèi)不含ig類分子，但含有一種替代物質(zhì)——可變淋巴細(xì)胞受體，可以識(shí)別更廣泛的抗原表位，在識(shí)別和特異性結(jié)合抗原方面比抗體具有更強(qiáng)的特異性及靈敏度。

從ncbi數(shù)據(jù)庫中得到其mrna序列，設(shè)計(jì)合適的引物(f：gttcgtgctcgggacagaa；r：tgctaagctgggcaggttg)，以七星子血液淋巴細(xì)胞cdna為模板，克隆出目的基因片段，結(jié)果如圖1所示。

然后連接載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白，表達(dá)菌破碎后純化目的蛋白，結(jié)果如圖2所示，然后免疫多只balb/c小鼠，分別三次免疫后采血，提取純化，獲得鼠抗vlr(即七星子可變淋巴細(xì)胞受體)。

并對(duì)其免疫學(xué)特性進(jìn)行檢測，利用elisa對(duì)其進(jìn)行效價(jià)檢測，結(jié)果如圖3所示，并利用western-blot分析后最終選擇一株質(zhì)量比較高的抗體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。

2、鰻鱺igg抗體的獲得：

日本鰻鱺經(jīng)愛德華氏菌免疫后，分離血清，采用cnbr-activatedsepharose純化柱進(jìn)行純化，獲得igg抗體。

3、鰻鱺igg免疫七星子

純化的日本鰻鱺igg首次免疫劑量為100微克，與等量弗氏完全佐劑充分乳化后腹腔注射七星子，第二次以后抗原劑量減半與等量弗氏不完全佐劑充分乳化后腹腔注射七星子，3～4次免疫后斷尾采血，分離提取淋巴細(xì)胞。免疫效價(jià)如圖2所示。

4、單克隆抗體的制備

在無菌條件將免疫七星子淋巴細(xì)胞重懸于10mldmem，并與sp2/o骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。利用鼠抗vlr，以間接elisa檢測雜交瘤細(xì)胞上清，取抗體陽性孔細(xì)胞經(jīng)過有限稀釋法克隆，制備單克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞腹腔接種6周齡balb/c小鼠，10d后采腹水，收集上清，制備獲得鰻鱺單克隆抗體。

實(shí)施例2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(elisa)

1、篩選單克隆抗體

愛德華氏菌包被于96孔酶標(biāo)板，每板50μl，4℃過夜。次日每孔滴加100μl含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs，37℃封閉2h，pbst洗5次，每次2min，然后加入1∶150稀釋的鰻鱺免疫血清，37℃孵育1h；pbst洗滌后加入50μl雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃反應(yīng)1h，最后滴加羊抗鼠igg，室溫反應(yīng)1h，洗滌后加tmb，37℃顯色15min，用濃硫酸終止反應(yīng)。sp2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對(duì)照。

共篩選得到穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞8株，分別命名為3d12，6a10，5e2，9b8，3g11，12d7，10h1，8g2。

2、單抗腹水效價(jià)測定

日本鰻鱺igg包被96孔酶標(biāo)板，每孔50μl，4℃過夜，次日每孔滴加100μl含1％牛血清白蛋白(bsa)的pbs，37℃封閉2h，pbst洗5次，每次2min，加入梯度稀釋的腹水抗體，室溫反應(yīng)2h，最后滴加羊抗鼠igg，室溫反應(yīng)1h，洗滌后加tmb，37℃顯色15min，用濃硫酸終止反應(yīng)。

效價(jià)測定的結(jié)果如圖5所示。

3、單抗靈敏度測定

純化日本鰻鱺igg起始濃度為5μg/ml開始，倍比稀釋至50ng/ml，每孔50μl，4℃包被過夜，封閉后滴加腹水抗體，每孔50μl，其余步驟同上。

結(jié)果如表1所示，本發(fā)明制備的單抗具有很好的靈敏度。

表1

4、單抗特異性測定

收集羅非魚、白鯧、胡子鯰、鱖魚和歐洲鰻鱺血清，以及水產(chǎn)動(dòng)物常見病原菌:氣單胞菌、弧菌、愛德華氏菌、柱狀屈橈桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌。待檢魚血清1000倍稀釋后包被于酶標(biāo)板；待檢病原菌超聲波破碎后包被于酶標(biāo)板；50μl每孔，4℃包被過夜，封閉、洗滌后滴加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清。用酶標(biāo)儀記錄結(jié)果。

結(jié)果如表2和表3，結(jié)果表明本發(fā)明的單抗在識(shí)別和特異性結(jié)合抗原方面具有很高的特異性。

表2

表3

實(shí)施例3單克隆抗體活性檢測

將單克隆抗體，制備的愛德華氏菌特異性balb/c小鼠igg以及生理鹽水分別與愛德華氏菌涂布于瓊脂糖培養(yǎng)基中，37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜后觀察菌落生長情況并計(jì)算殺菌率。

其中，對(duì)照組為：生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組1為愛德華氏菌特異性balb/c小鼠igg，實(shí)驗(yàn)組2為vlr單克隆抗體。

結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明與常規(guī)的igg相比，七星子vlr單克隆抗體具有更強(qiáng)大的殺菌能力。