本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
基因的條件性表達是指在藥物或者其它基因的誘導(dǎo)下，實現(xiàn)目標基因在特定的時間或特定的空間表達，該技術(shù)在基因的功能研究以及基因治療中具有重要的意義。
目前常用的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)有teton、tetoff、cre-loxp、flp-frt等，然而，由于不同因素的影響，這些調(diào)控系統(tǒng)本底表達仍然較高。teton、tetoff系統(tǒng)依賴于藥物dox與tet結(jié)構(gòu)域結(jié)合后使得相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合或者脫離，從而實現(xiàn)誘導(dǎo)性表達，但由于藥物dox不與tet結(jié)合的情況下轉(zhuǎn)錄因子仍然與啟動子有一定程度的結(jié)合力，使得該系統(tǒng)本底較高。cre-loxp和flp-frt原理相似，在啟動子和目標基因之間插入轉(zhuǎn)錄終止信號，轉(zhuǎn)錄終止信號兩端加入loxp序列，在cre酶的作用下可以使啟動子和基因之間的轉(zhuǎn)錄終止信號去除，從而使目標基因啟動表達。該系統(tǒng)嚴謹性與teton、tetoff系統(tǒng)相比較好，但是由于轉(zhuǎn)錄終止信號并不能完全終止啟動子的啟動活性，因此該系統(tǒng)也存在一定的本底表達。
綜上，目前仍沒有一種足夠嚴謹?shù)臈l件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述基因表達調(diào)控嚴謹性不足存在的技術(shù)難題，本發(fā)明的目的在于，提供一種嚴謹性較高的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)。本發(fā)明將目標基因分為兩個段，將其中一段的方向跌倒，這樣破壞了目標基因的正常編碼順序，使得正常情況下目標基因完全不能表達，而在位點特異性重組酶的作用下跌倒的片段恢復(fù)為正常方向后，目標基因的讀碼框恢復(fù)正常，基因才能正常表達。
為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案：
一種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)，其特征在于，該系統(tǒng)由目標基因的表達載體和位點特異性重組酶的表達載體兩部分組成，目標基因的讀碼框中插入了內(nèi)含子序列，在內(nèi)含子序列中插入一個位點特異性重組酶的識別序列，在目標基因的5＇或者3＇端也插入一個位點特異性重組酶的識別序列，兩個識別序列的方向相反且兩者之間的dna片段反向放置。
所述目標基因的讀碼框中插入了內(nèi)含子序列是指目標基因起始密碼子和終止密碼子之間的任意兩個相鄰堿基之間插入了內(nèi)含子序列；所述在內(nèi)含子序列中是指在內(nèi)含子的剪切供體序列和剪切受體序列之間。
所述表達載體是真核表達載體。
所述位點特異性重組酶是cre、flp、φc31中的任意一種；所述位點特異性重組酶的識別序列是cre酶識別的loxp序列、flp酶識別的frt序列、φc31酶識別的attb/attp中的任意一種。
所述內(nèi)含子序列為seqidno.1的內(nèi)含子序列1，如下：
seqidno.1：內(nèi)含子序列1
gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctcgagtacagaattcatgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag。
所述內(nèi)含子序列為seqidno.11的內(nèi)含子序列2，如下：
seqidno.11：內(nèi)含子序列2
gtaagtatcaaggttacaagacagggaccaataggtgcctatcagaaacgcaagagtcttctctgtctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaattactgacatccactttgcctttctctccacag。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將目標基因分為兩個片段，將其中一個片段方向跌倒，破壞該基因的正常編碼順序，使得正常情況下該基因完全不能表達；在方向跌倒的片段兩端加入位點特異性重組酶的識別序列，兩個識別序列方向相反，這樣在位點特異性重組酶的作用下能夠使方向跌倒的片段反轉(zhuǎn)過來恢復(fù)正常的方向；為了去除兩個片段之間的位點特異性重組酶的識別序列，在兩個片段之間加入了內(nèi)含子序列，使特異性重組酶的識別序列位于內(nèi)含子序列的剪切供體和剪切受體之間，這樣目標基因在表達成mrna后，通過內(nèi)含子的自剪切將內(nèi)含子以及位于內(nèi)含子中的特異性重組酶的識別序列去除，獲得能夠正常編碼目標基因的mrna。通過該方案，可以最大限度的降低目標基因在非誘導(dǎo)的條件下的本底表達，而在誘導(dǎo)條件下能夠大量的表達，而且還可以通過與組織特異性啟動子、teton、tetoff等啟動子的組合使用，獲得組織特異的條件性基因表達或者藥物誘導(dǎo)的條件性基因表達。為基因的功能研究以及基因治療提供更好的技術(shù)手段。
附圖說明
圖1是位點特異性重組酶表達載體結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是目標基因表達載體結(jié)構(gòu)及作用原理示意圖；
圖3是本發(fā)明條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)嚴謹性檢測結(jié)果；
圖4是本發(fā)明條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)與傳統(tǒng)調(diào)控系統(tǒng)本底表達的比較結(jié)果。
以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，這些實施例是較優(yōu)的例子，本發(fā)明不限于這些實施例。
具體實施方式
為了解決目前條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)本底較高的問題，本發(fā)明提供了一種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)由目標基因的表達載體和位點特異性重組酶的表達載體兩部分組成，目標基因的讀碼框中插入了內(nèi)含子序列，在內(nèi)含子序列中插入一個位點特異性重組酶的識別序列，在目標基因的5＇或者3＇端也插入一個位點特異性重組酶的識別序列，兩個識別序列的方向相反且兩者之間的dna片段反向放置。在該條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)中，由于目標基因被分為兩段，且其中一個片段方向發(fā)生了跌倒，使得正常情況下目標基因完全不能表達，在位點特異性重組酶的作用下，兩個位點特異性重組酶的識別序列發(fā)生重組使得兩者之間的dna片段方向發(fā)生顛倒，從而使目標基因的兩個片段方向一致，而目標基因的兩個片段之間的內(nèi)含子序列和位于內(nèi)含子序列之間的位點特異性重組酶的識別序列在目標基因轉(zhuǎn)錄為mrna后，通過mrna內(nèi)含子的自剪切被去除，因此目標基因恢復(fù)正常表達。
實施例1
一種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)由目標基因的表達載體和位點特異性重組酶的表達載體兩部分組成，目標基因的讀碼框中插入了內(nèi)含子序列，在內(nèi)含子序列中插入一個位點特異性重組酶的識別序列，在目標基因的5＇或者3＇端也插入一個位點特異性重組酶的識別序列，兩個識別序列的方向相反且兩者之間的dna片段反向放置。
所述目標基因的讀碼框中插入了內(nèi)含子序列是指目標基因起始密碼子和終止密碼子之間的任意兩個相鄰堿基之間插入了內(nèi)含子序列；所述在內(nèi)含子序列中是指在內(nèi)含子的剪切供體序列和剪切受體序列之間。
所述表達載體是真核表達載體。所述位點特異性重組酶是cre、flp、φc31中的任意一種；所述位點特異性重組酶的識別序列是cre酶識別的loxp序列、flp酶識別的frt序列、φc31酶識別的attb/attp中的任意一種。
所述內(nèi)含子序列為seqidno.1的內(nèi)含子序列1，如下：
seqidno.1：內(nèi)含子序列1
gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctcgagtacagaattcatgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag。
實施例2
以下是以熒光素酶報告基因luciferase的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)為例的具體實例。
1、熒光素酶報告基因luciferase的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)
該系統(tǒng)由位點特異性重組酶cre的表達載體和目標基因luciferase的表達載體兩部分組成，位點特異性重組酶cre的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了cre基因，其結(jié)構(gòu)見附圖1。目標基因luciferase的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了luciferase基因，但是luciferase基因讀碼框的第970個堿基和第971個堿基之間插入內(nèi)含子序列，將目標基因luciferase分為lucin和lucic兩個片段，內(nèi)含子序列為seqidno.1的內(nèi)含子序列1。
seqidno.1：內(nèi)含子序列1
gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctcgagtacagaattcatgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag。
在該seqidno.1的內(nèi)含子序列1的第85個堿基和第86個堿基之間插入一個特異性重組酶cre的識別序列l(wèi)oxp，將內(nèi)含子分為int和ron兩個片段，在luciferase基因的5＇端插入一個loxp序列，兩個loxp序列方向相反，將兩個loxp序列之間的lucin-int片段反向放置，目標基因luciferase的完整序列為seqidno.2。
seqidno.2：目標基因luciferase的完整序列
ataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcgagaaacgcaagagtcttctctgtctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaacctgtcttgtaaccttgatacttacctacctccttgctgagcggcgccccgccgctggcgatctcgtgcaagttgcttaggtcgtacttgtcgatgagagtgctcttagcgaagaagctaaatagtgtgggcaccagcagggcagattgaatcttatagtcttgcaagctgcgcaagaatagctcctcctcgaagcggtacatgagcacgacccgaaagccgcagatcaagtagcccagcgtggtgaacatgccgaagccgtggtgaaatggcaccacgctgaggatagcggtgtcggggatgatctggttgccgaagatggggtcgcgggcatgactgaatcggacacaagcggtgcggtgcggtagggctacgcccttgggcaatccggtactgccactactgttcatgatcagggcgatggttttgtcccggtcgaagctctcgggcacgaagtcgtactcgttgaagccgggtggcaaatgggaagtcacgaaggtgtacatgctttggaagccctggtagtcggtcttgctatccatgatgatgatcttttgtatgatcggtagcttcttttgcacgttgaggatcttttgcagccctttcttgctcacgaatacgacggtgggctggctgatgcccatgctgttcagcagctcgcgctcgttgtagatgtcgttagctggggccacagccacaccgatgaacagggcacccaacacgggcatgaagaactgcaagctattctcgctgcacaccacgatccgatggtttgtattcagcccatagcgcttcatagcttctgccagccgaacgctcatctcgaagtactcggcgtaggtaatgtccacctcgatatgtgcgtcggtaaaggcgatggtgccgggcaccagggcgtagcgcttcatggctttgtgcagctgctcgccggcggtcccgtcttcgagtgggtagaatggcgctgggcccttcttaatgtttttggcatcttccatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctcgaggtacagaattcatgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgtaa。
目標基因luciferase的表達載體結(jié)構(gòu)及作用原理見附圖2。圖中可見，目標基因luciferase由lucin-int和ron-lucic兩個片段組成，luciferase由lucin-int的兩端分別有一個loxp序列，兩個loxp序列的方向相反，且兩個loxp序列之間的lucin-int片段反向放置，正常情況下目標基因luciferase是不能表達的，在位點特異性重組酶cre的作用下，兩個loxp序列發(fā)生重組，兩個loxp序列之間反向放置的lucin-int片段方向發(fā)生顛倒，使得lucin-int和ron-lucic方向一致，而位于lucin和lucic之間序列int-loxp-ron在luciferase基因被轉(zhuǎn)錄為mrna后通過內(nèi)含子的自剪切被去除，目標基因luciferase得以正常表達。
在該系統(tǒng)中所用的位點特異性重組酶也可以是flp、φc31中的任意一種，而位點特異性重組酶的識別序列也可以是frt(flp的識別序列)、attb/attp(φc31的識別序列)中的任意一種。
2、熒光素酶報告基因luciferase的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)構(gòu)建過程
(1)位點特異性重組酶cre的表達載體構(gòu)建
pcr擴增獲得cre基因，將cre基因通過kpni和noti位點克隆到pcdna3.1(+)載體中，獲得位點特異性重組酶cre的表達載體pcdna3.1/cre。
(2)目標基因luciferase的表達載體構(gòu)建
在華大基因公司合成內(nèi)含子全長片段，序列見seqidno.1的內(nèi)含子序列1，同時合成以下引物：
seqidno.3：loxp-lucinxhoifor
actcgagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatatggaagatgccaaaaacattaaga
seqidno.4：lucin-intfor
gccgctcagcaaggaggtaggtaagtatcaaggttacaa
seqidno.5：lucin-intreverse
ttgtaaccttgatacttacctacctccttgctgagcggc
seqidno.6：loxp-intkpnireverse
aggtaccataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcgagaaacgcaagagtctt
seqidno.7：ronxhoifor
actcgaggtacagaattcatgataggcac
seqidno.8：ron-lucicfor
actttgcctttctctccacaggtgaggccgtggccaaacg
seqidno.9：ron-lucicreverse
cgtttggccacggcctcacctgtggagagaaaggcaaagt
seqidno.10：lucicnotireverse
agcggccgcttacacggcgatcttgccgccctt
以seqidno.3/seqidno.4/seqidno.5/seqidno.6為引物，luciferase基因和內(nèi)含子片段為模板進行重疊pcr，獲得loxp-lucin-int-loxp片段，以seqidno.7/seqidno.8/seqidno.9/seqidno.10為引物，luciferase基因和內(nèi)含子片段為模板進行重疊pcr獲得ron-lucic片段。用kpni和xhoi酶切并回收loxp-lucin-int-loxp片段，用xhoi和noti酶切并回收ron-lucic片段，將loxp-lucin-int-loxp片段和ron-lucic片段同時連接到kpni和noti酶切處理的pcdna3.1(+)載體，獲得目標基因luciferase的表達載體pcdna3.1/loxp-lucin-int-loxp-ron-lucic。
3、熒光素酶報告基因luciferase的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)的使用方法
將8μg目標基因luciferase的表達載體pcdna3.1/loxp-lucin-int-loxp-ron-lucic轉(zhuǎn)染到60mm培養(yǎng)皿中的hek293，加g418篩選10-20天，待細胞不再死亡獲得穩(wěn)定細胞系loxp-luci-hek293。
將6μg位點特異性重組酶cre的表達載體pcdna3.1/cre轉(zhuǎn)染loxp-luci-hek293，轉(zhuǎn)染72小時后收集細胞，提取蛋白通過熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶活力。同時收集未轉(zhuǎn)染pcdna3.1/cre的loxp-luci-hek293細胞，提取蛋白測熒光素酶活力作為對照。附圖3顯示了熒光素酶活力檢測結(jié)果。圖中可見細胞轉(zhuǎn)入cre表達載體后，目標基因luciferase得到大量表達，而在未轉(zhuǎn)染cre時，目標基因幾乎不表達。同時還將這種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)與目前常用的基因表達調(diào)控系統(tǒng)目標基因的本底表達水平做了對照，結(jié)果見附圖4，圖中可見，本發(fā)明的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)luciferase基因的本底表達更低。
實施例3
以下是以熒光素酶報告基因luciferase的dox誘導(dǎo)性基因表達調(diào)控系統(tǒng)為例的具體實例。
將位點特異性重組酶cre的表達載體中cre基因的啟動子替換為teton啟動子，將該載體中的篩選基因替換為puromycin基因，獲得的載體命名為pcdna3.1/teton-cre。其它結(jié)構(gòu)與實施例2相同。
該系統(tǒng)使用方法如下：
將8μg位點特異性重組酶cre的表達載體pcdna3.1/teton-cre轉(zhuǎn)染loxp-luci-hek293，用puromycin篩選8-10天，待細胞不再死亡獲得穩(wěn)定細胞系teton-cre-loxp-luci-hek293。
將teton-cre-loxp-luci-hek293傳至兩個60mm細胞培養(yǎng)皿，一個平皿加入強力霉素誘導(dǎo)，另一個平皿不做處理，72小時后收集細胞提取蛋白檢測熒光素酶活力。其它步驟與實施例2相同。
實施例4
以下是以綠色熒光蛋白報告基因egfp的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)為例的具體實例。
綠色熒光蛋白報告基因egfp的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)組成如下：
該系統(tǒng)由位點特異性重組酶flp的表達載體和目標基因egfp的表達載體兩部分組成，位點特異性重組酶flp的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了flp基因。目標基因egfp的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了egfp基因，但是egfp基因編碼區(qū)的第4個堿基和第5個堿基之間插入內(nèi)含子序列，內(nèi)含子序列與實施例1相同，在該內(nèi)含子序列的第66個堿基和第67個堿基之間插入位點特異性重組酶flp的識別序列frt，在egfp基因的3＇端插入frt序列，兩個frt序列方向相反，將兩個frt序列之間的dna片段反向放置。
在該系統(tǒng)中所用的位點特異性重組酶也可以是cre、φc31中的任意一種，而位點特異性重組酶的識別序列也可以是loxp(cre的識別序列)、attb/attp(φc31的識別序列)中的任意一種。
實施例5
以下是以干細胞相關(guān)因子oct4的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)為例的具體實例。
干細胞相關(guān)因子oct4的條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)組成如下：
該系統(tǒng)由位點特異性重組酶φc31的表達載體和目標基因oct4的表達載體兩部分組成，位點特異性重組酶φc31的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了φc31基因。目標基因oct4的表達載體結(jié)構(gòu)為在pcdna3.1(+)載體中插入了oct4基因，但是oct4基因編碼區(qū)的第1079個堿基和第1080個堿基之間插入內(nèi)含子序列，內(nèi)含子序列為seqidno.11的內(nèi)含子序列2。
seqidno.11：內(nèi)含子序列2
gtaagtatcaaggttacaagacagggaccaataggtgcctatcagaaacgcaagagtcttctctgtctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaattactgacatccactttgcctttctctccacag。
在該內(nèi)含子序列的第45個堿基和第46個堿基之間插入attb序列，在oct4基因的3＇端插入attp序列，attb與attp序列方向相反，將attb和attp序列之間的dna片段反向放置。
在該系統(tǒng)中所用的位點特異性重組酶也可以是cre、flp中的任意一種，而位點特異性重組酶的識別序列也可以是loxp(cre)、frt(flp識別序列)中的任意一種。
本實施例沒有詳細敘述的部分和英文縮寫屬本行業(yè)的公知常識，在網(wǎng)上可以搜索到，這里不一一敘述。
核苷酸或氨基酸序列表
sequencelisting
<110>中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
<120>一種條件性基因表達調(diào)控系統(tǒng)
<160>11
<210>1
<211>149
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400>1
gtaagtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgaga60
cagagaagactcttgcgtttctcgagtacagaattcatgataggcacctattggtcttac120
tgacatccactttgcctttctctccacag149
<210>2
<211>1876
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400>2
ataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcgagaaacgcaagagtcttctctgt60
ctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaacctgtcttgtaaccttgatacttacc120
tacctccttgctgagcggcgccccgccgctggcgatctcgtgcaagttgcttaggtcgta180
cttgtcgatgagagtgctcttagcgaagaagctaaatagtgtgggcaccagcagggcaga240
ttgaatcttatagtcttgcaagctgcgcaagaatagctcctcctcgaagcggtacatgag300
cacgacccgaaagccgcagatcaagtagcccagcgtggtgaacatgccgaagccgtggtg360
aaatggcaccacgctgaggatagcggtgtcggggatgatctggttgccgaagatggggtc420
gcgggcatgactgaatcggacacaagcggtgcggtgcggtagggctacgcccttgggcaa480
tccggtactgccactactgttcatgatcagggcgatggttttgtcccggtcgaagctctc540
gggcacgaagtcgtactcgttgaagccgggtggcaaatgggaagtcacgaaggtgtacat600
gctttggaagccctggtagtcggtcttgctatccatgatgatgatcttttgtatgatcgg660
tagcttcttttgcacgttgaggatcttttgcagccctttcttgctcacgaatacgacggt720
gggctggctgatgcccatgctgttcagcagctcgcgctcgttgtagatgtcgttagctgg780
ggccacagccacaccgatgaacagggcacccaacacgggcatgaagaactgcaagctatt840
ctcgctgcacaccacgatccgatggtttgtattcagcccatagcgcttcatagcttctgc900
cagccgaacgctcatctcgaagtactcggcgtaggtaatgtccacctcgatatgtgcgtc960
ggtaaaggcgatggtgccgggcaccagggcgtagcgcttcatggctttgtgcagctgctc1020
gccggcggtcccgtcttcgagtgggtagaatggcgctgggcccttcttaatgtttttggc1080
15
atcttccatataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatctcgaggtacagaattc1140
atgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacaggtgaggc1200
cgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaac1260
cagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggt1320
gcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaacca1380
gcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccga1440
ggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactg1500
ggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaaggg1560
ctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcga1620
cgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgt1680
gctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggt1740
tacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggact1800
gaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcgg1860
caagatcgccgtgtaa1876
<210>3
<211>66
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>3
actcgagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatatggaagatgccaaaaaca60
ttaaga66
<210>4
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>4
gccgctcagcaaggaggtaggtaagtatcaaggttacaa39
<210>5
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>5
ttgtaaccttgatacttacctacctccttgctgagcggc39
16
<210>6
<211>61
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>6
aggtaccataacttcgtatagcatacattatacgaagttattcgagaaacgcaagagtct60
t61
<210>7
<211>29
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>7
actcgaggtacagaattcatgataggcac29
<210>8
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>8
actttgcctttctctccacaggtgaggccgtggccaaacg40
<210>9
<211>40
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>9
cgtttggccacggcctcacctgtggagagaaaggcaaagt40
<210>10
<211>33
<212>dna
17
<213>人工序列
<220>
<223>單鏈dna寡聚核苷酸
<400>10
agcggccgcttacacggcgatcttgccgccctt33
<210>11
<211>133
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>misc_feature
<400>11
gtaagtatcaaggttacaagacagggaccaataggtgcctatcagaaacgcaagagtctt60
ctctgtctcgacaagcccagtttctattggtctccttaaattactgacatccactttgcc120
tttctctccacag133