本發(fā)明涉及一種鈣（ca）螯合肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著海洋源活性肽研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起，裂殖壺菌除了高含量的油脂外，仍含有相當(dāng)豐富的蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)富含能提供配位鍵的谷氨酸和天冬氨酸，可以有效的作為鈣離子配體與鈣元素形成螯合物，既起到了補充微量元素的作用，又能充分利用高營養(yǎng)價值的裂殖壺菌蛋白。
當(dāng)今，鈣缺失是影響人類健康的全球性問題，缺鈣造成機體的各種疾病，使人處于亞健康狀態(tài)。隨著國民生活水平的逐漸提高，同時市面上的各式各樣的補鈣制劑也在不斷的沖擊著人們的眼球，使得國民補鈣意識也在不斷增加。雖然這些補鈣劑能在一定程度上緩解鈣缺失的壓力，但卻也沒有從根本上改善國民缺鈣的狀況，并且也具有一定的副作用。近年來，隨著鈣補充制劑的發(fā)展，以及經(jīng)水解得到小肽易與鈣離子形成可溶性配合物，維持鈣在小腸內(nèi)的溶解狀態(tài)，促進(jìn)小腸對鈣的吸收，使得鈣螯合肽的開發(fā)將成為一個全球研究性熱點。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收、安全無毒、價格低、可同時補充氨基酸和鈣，而成為補鈣首選。
因此，如何獲得具有鈣螯合活性的肽，就成為制備新型鈣元素補充劑迫切的研究方向。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供了一種利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，使鈣螯合活性得以高效地實現(xiàn)。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種鈣螯合肽，所述肽的氨基酸序列為：fy。所述鈣為ca。
一種鈣螯合肽的制備方法，以裂殖壺菌粕蛋白為原料，采用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對其進(jìn)行分步酶解，分離純化、冷凍干燥得到鈣螯合肽。
第一步酶解條件為：最適酶為堿性蛋白酶，時間為8h，ph為9，酶底比為10wt.%，底物濃度為1wt.%。第二步酶解條件為：最適酶為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶底比為10wt.%，溫度為40℃，ph為6，時間為3h50min。
所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用sephadexg-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3ml/min，洗脫峰在214nm下進(jìn)行測定；收集具有最高鈣螯合活性的峰，利用rp-hplc-c18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，反相hplc的分離條件是用體積分?jǐn)?shù)為0-40%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為2ml/min，收集洗脫峰，冷凍干燥得到所述的鈣螯合肽。
本發(fā)明立足于多肽具備與鈣離子螯合的作用位點，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-鈣螯合物具有獨特的螯合體制和轉(zhuǎn)運機制，易被吸收、可同時補充氨基酸和鈣的理論基礎(chǔ)，以來自于海洋源的裂殖壺菌粕蛋白為原材料，通過堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解的切割條件控制，切割制備具有高鈣螯合活性的肽，而使鈣螯合活性得以高效地實現(xiàn)。本發(fā)明為裂殖壺菌粕蛋白的應(yīng)用提供了一條嶄新的思路。
附圖說明
圖1純化裂殖壺菌粕蛋白源鈣螯合肽的rp-hplc-c18色譜圖；其中sph-1b為該特異性鈣螯合肽的色譜峰。
具體實施方式
實施例1
采用的儀器、檢測手段如下：
本技術(shù)所采用的裂殖壺菌粕，由福建省水產(chǎn)研究所提供，酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司（中國·天津）。首先進(jìn)行裂殖壺菌粕蛋白的提取，使用中藥粉碎機處理裂殖壺菌粕，過60目篩，獲得實驗用原料。采用堿提酸沉的方法提取裂殖壺菌粕中的蛋白質(zhì)。配制濃度為0.39mol/l的naoh溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。將所獲得的樣液在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清棄沉淀。再用6mol/lhcl調(diào)節(jié)上清液中的ph值，調(diào)節(jié)ph值至3.0，對蛋白質(zhì)進(jìn)行酸沉。靜置30min后，在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。最終取沉淀棄上清，冷凍干燥，然后再進(jìn)一步對其酶解。
酶解工藝采用單因素實驗，第一步酶解實驗分別對五個酶解因素進(jìn)行考察，分別為最適酶（中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0.0h、0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h、3.5h、4.0h、6.0h、8.0h、10.0h、12.0h），ph（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，酶底比（2%、4%、6%、8%、10%、12%，w/w），底物濃度（1%、3%、5%、7%、9%，w/v）。在第一步酶解的基礎(chǔ)上，第二步酶解實驗分別對五個酶解因素進(jìn)行考察，最適酶（復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶），時間（0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h），酶底比（4%、6%、8%、10%、12%，w/w），ph（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0），溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）。稱取一定質(zhì)量裂殖壺菌蛋白溶解于蒸餾水中，然后用2mol/lnaoh將其ph調(diào)節(jié)至最適ph。先將該溶液水浴加熱到需要溫度，接著再按不同的酶底比加入相應(yīng)量的酶，按照預(yù)定的反應(yīng)時間開始反應(yīng)。接著再在沸水浴中滅酶10分鐘，冷卻后再10000rpm離心10分鐘。上清液收集后，分別對鈣鈣螯合活性進(jìn)行測定，以確定最佳酶解條件。得到第二步酶解中具有最大鈣螯合活性的酶解液的酶解條件是：酶底比10%、溫度40℃、ph6、時間3h50min。
本發(fā)明的制備鈣螯合肽的鈣螯合活性測定方法，采用鄰-甲酚酞比色法，測定鈣螯合肽對鈣離子的螯合作用。將1ml5mmol/l的cacl2和2ml0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液（ph8.0）加入具塞試管中，再加入1ml清蛋白肽溶液，置于恒溫加熱水浴搖床中37℃溫育2h，取出后10000r/min常溫離心10min。取1ml上清液，加入鄰-甲酚酞顯色液5ml，搖勻。放置10min后于分光光度計570nm處測定吸光值，將數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算出可溶性鈣結(jié)合量。
標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別取標(biāo)準(zhǔn)ca工作液（10ug/ml）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml于10ml試管中，分別加去離子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0ml，加入鄰-甲酚酞顯色液5ml，搖勻，放置10min后于分光光度計570nm處測定吸光值。以可溶性鈣含量（ug/ml）為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)做圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：y=0.0992x-0.0887，r2=0.9988。
應(yīng)用sephadexg-25分子篩、rp-hplc反相高效液相色譜等分離純化手段，實現(xiàn)顯著活性的裂殖壺菌粕蛋白鈣螯合肽的高效分離純化。
稱取1.0克裂殖壺菌粕蛋白溶解于100ml蒸餾水中，用2mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至9.0，加堿性蛋白酶，立即置于50℃的水浴搖床中反應(yīng)8h，沸水浴滅酶10min，立即冷卻，10000r/min離心10min，取上清得粗酶解液，用2mol/lnaoh調(diào)節(jié)ph至6.0，加復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，立即置于40℃的水浴搖床中反應(yīng)3h50min，沸水浴滅酶10min，立即冷卻，10000r/min離心10min，取上清備用。
將上清液用sepadexg-25凝膠過濾色譜（長100cm，外徑2.0cm）進(jìn)行分離，獲得最好的鈣鈣螯合活性的樣品利用rp-hplc-c18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。洗脫液自含100%去離子水（v/v）的混合液開始，至40%乙腈和60%水（v/v）的混合液結(jié)束，流速為2ml/min進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫峰，冷凍干燥得到本發(fā)明的高純度的特異性鈣鈣螯合肽，如圖1所示。sph-1b峰為該特異性鈣螯合肽的色譜峰。
純化得到的特異性鈣螯合肽具有很高的鈣鈣螯合活性，由表1可以看出，與酶解液相比，sph-1b的鈣螯合力有了很大提高。
表1純化的特異性鈣螯合肽的鈣螯合力
對純化的特異性鈣螯合肽利用esi質(zhì)譜儀((watersmaldisynaptq-tofms,watersco.,u.s.a)測定特異性鈣螯合肽的氨基酸序列。所述鈣螯合肽的氨基酸序列為：fy。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
sequencelisting
<110>福州大學(xué)
<120>雙酶法制備鈣螯合肽的方法
<130>1
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2
<212>prt
<213>鈣螯合肽
<400>1
phetyr
1