本發(fā)明涉及一種海洋生物活性物質(zhì)，具體涉及一種青蛤抗腫瘤提取物。

背景技術(shù)：

前列腺癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居首位，好發(fā)于老年男性。在我國，前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，居泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅老年男性的健康。傳統(tǒng)治療方法如手術(shù)、放療和冷凍治療等效果并不理想，且復(fù)發(fā)率比較高，并且當(dāng)復(fù)發(fā)的前列腺癌轉(zhuǎn)化為非雄激素依賴性時，治療將更困難；而化療藥物產(chǎn)生耐藥性后，療效更差并毒副作用明顯。因此，尋找抗前列腺癌藥物成為學(xué)者們研究的熱點。海洋是發(fā)現(xiàn)新型抗癌藥物的一個豐富的資源寶庫，多種海洋寡肽、糖胺聚糖等都具有抗腫瘤、抗病毒、抗真菌等生理活性。從雙殼貝類中提取的文蛤寡肽mere15、菲律賓蛤仔寡肽對人慢性骨髓性白血病k562細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，并導(dǎo)致濃度依賴性細(xì)胞凋亡；從近江牡蠣提取的糖胺聚糖具有體內(nèi)外抗腫瘤活性，不僅可以抑制k562、cne-2z、hela細(xì)胞的生長，還對ctx損傷小鼠的免疫功能有一定的修復(fù)作用。青蛤（cyclinasinensis）屬于軟體動物門，鰓瓣綱，異齒亞綱，簾蛤目、簾蛤科，含高蛋白、低脂肪和高含量的不飽和脂肪酸，味道鮮美，具有很好的營養(yǎng)價值。青蛤在民間入藥具有悠久的歷史，是一種重要的海洋藥物，具有軟堅散結(jié)、清熱燥濕及鎮(zhèn)咳作用。changxingj等從青蛤中提取出的多糖具有抗氧化和保肝活性，對人胃癌bgc-823細(xì)胞的生長具有強烈的抑制作用。然而，目前關(guān)于青蛤寡肽的提取及活性的研究報道并不多，本實驗采用蛋白酶酶解青蛤內(nèi)臟，經(jīng)正交實驗獲得最佳酶解條件，經(jīng)分離純化，篩選出活性寡肽，研究其體外抗人前列腺癌du-145細(xì)胞的活性，以期為青蛤活性寡肽的制備及抗癌作用研究提供實驗依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有抗腫瘤功效的青蛤抗腫瘤提取物。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為：一種青蛤抗腫瘤提取物，該提取物的分子結(jié)構(gòu)為：

采用上述成分配制青蛤抗腫瘤提取物的應(yīng)用制劑，按重量份數(shù)含有青蛤抗腫瘤提取物1-5份、靈芝1-3份、黃芪1-5份、茯苓1-10份、丹參10-20份、半支蓮1-10份、白花舌蛇草2-10份、葛根3-20份?？深A(yù)期的能達(dá)到一定的抗腫瘤效果。

該青蛤抗腫瘤提取物肽采用如下方式制備：

1）取青蛤勻漿，以活性酶在最適酶解溫度及ph值條件下，加蛋白酶200~12000u/g、保溫4~10h進行酶解；然后后滅活，在0~4^oc、12000r/min的條件下離心，取上清；

2）取最佳酶種及最優(yōu)酶解條件下酶解的上清液，用截留分子量為3ku的超濾膜進行超濾；

3）取超濾組分進行瓊脂糖凝膠層析分離，濃度：0.01~0.5g/ml，離心后取上清過0.22μm濾膜，進行洗脫；收集洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥；

4）取組分過hplc進一步分離得到青蛤抗腫瘤提取物；

青蛤抗腫瘤提取物的分子結(jié)構(gòu)為：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的青蛤抗腫瘤提取物的優(yōu)點在于：本發(fā)明工藝科學(xué)合理，操作簡單，隨著青蛤抗腫瘤提取物濃度的增加，作用時間的延長，du-145細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升；倒置顯微鏡下觀察、ao/eb熒光染色、hoechst33258熒光染色及透射電鏡技術(shù)實驗表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，細(xì)胞早期凋亡率及線粒體膜電位下降所占百分率增加，且隨著青蛤抗腫瘤提取物濃度增加，早期凋亡率增加較為明顯，其膜電位下降更為顯著，即預(yù)示線粒體凋亡信號通路在青蛤抗腫瘤提取物誘導(dǎo)的du-145細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。同時，本發(fā)明所制備的青蛤抗腫瘤提取物是天然原料經(jīng)酶解制得，安全、無毒副作用，抗腫瘤活性顯著，青蛤抗腫瘤提取物可以作為抗癌藥品、食品添加劑、功能食品進行開發(fā)。

附圖說明

圖1本為發(fā)明實施例分子結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2本為發(fā)明實施例瓊脂糖凝膠柱洗脫峰示意圖；

圖3本為發(fā)明實施例峰3高效液相色譜圖；

圖4本為發(fā)明實施例峰3組分在280nm處高效液相色譜圖；

圖5為本發(fā)明實施例對du-145細(xì)胞的增殖抑制作用示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。

實施例：

一種青蛤抗腫瘤提取物，該提取物的分子結(jié)構(gòu)為：

隨著青蛤抗腫瘤提取物濃度的增加，作用時間的延長，du-145細(xì)胞的增殖抑制率明顯上升；倒置顯微鏡下觀察、ao/eb熒光染色、hoechst33258熒光染色及透射電鏡技術(shù)實驗表明細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，細(xì)胞早期凋亡率及線粒體膜電位下降所占百分率增加，且隨著青蛤抗腫瘤提取物濃度增加，早期凋亡率增加較為明顯，其膜電位下降更為顯著，即預(yù)示線粒體凋亡信號通路在青蛤抗腫瘤提取物誘導(dǎo)的du-145細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。同時，本發(fā)明所制備的青蛤抗腫瘤提取物是天然原料經(jīng)酶解制得，安全、無毒副作用，抗腫瘤活性顯著。

一種青蛤抗腫瘤提取物的應(yīng)用制劑按重量份數(shù)含有青蛤抗腫瘤提取物1-5份、靈芝1-3份、黃芪1-5份、茯苓1-10份、丹參10-20份、半支蓮1-10份、白花舌蛇草2-10份、葛根3-20份、0.01-0.1份胺氰基硼烷和0.01-0.1份胺羧基硼烷。采用上述組合的制劑尤其是胺氰基硼烷和胺羧基硼烷的使用能使實驗結(jié)果更好。

青蛤抗腫瘤提取物的制備方法如下：

1）取青蛤勻漿，以活性酶在最適酶解溫度及ph值條件下，加蛋白酶200~12000u/g、保溫4~10h進行酶解；然后后滅活，在0~4^oc、6000~12000r/min的條件下離心，取上清；

2）取上清液，用截留分子量為3ku的超濾膜進行超濾；

3）取超濾組分進行瓊脂糖凝膠層析分離，濃度：0.01~0.5g/ml，離心后取上清過0.22μm濾膜，進行洗脫；收集洗脫產(chǎn)物，冷凍干燥；

4）取組分過hplc進一步分離得到青蛤抗腫瘤提取物。

活性酶為堿性蛋白酶或胰蛋白酶或木瓜蛋白酶或中性蛋白酶或胃蛋白酶。

步驟3）洗脫的條件為：柱尺寸：10×300-310mm；柱料：瓊脂糖；柱料顆粒大?。?0±2μm；上樣量：500μl；流動相：超純水；洗脫液流速：0.5ml/min；檢測波長：280nm；自動收集體積：3.2ml/管。

步驟4)色譜條件為，色譜柱：填料粒徑為5μm4.6×250mm的zorbaxsb-c18分析型色譜柱；檢測波長：214nm，280nm；流速：0.8ml/min；流動相a為含0.05%tfa的乙腈，流動相b為含0.06%tfa的超純水，采用梯度洗脫方式，流動相a與流動相b的流動相體積比為20∶80；柱溫：25^oc；自動進樣，進樣量：500μl；

洗脫方式為：0%-0%b洗脫4min；0%-100%b洗脫25min；100%-100%b洗脫6min。

選取峰3的hplc保留時間約為15min的峰組分進行收集，峰面積38.47，峰高2829.00，即為青蛤提取物的產(chǎn)品，分子量301.34da，命名為目標(biāo)肽2；同樣收集的純品再次上hplc檢測純度，在280nm處約8min時出現(xiàn)主要單一峰，即純的青蛤提取物。

實驗中樣品與試劑

青蛤，購于舟山市菜市場（經(jīng)浙江海洋學(xué)院趙盛龍教授鑒定）。經(jīng)洗凈、去殼、取內(nèi)臟，并用0.1mol/l的naoh溶液浸泡去脂，于蒸餾水中輕輕攪拌去雜質(zhì)，加一倍體積的純水勻漿后備用。

青蛤寡肽：本實驗室自制，分子量為＜3ku；堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶，北京亞太恒信生物科技有限公司；f12培養(yǎng)基，gibco公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程公司；mtt、胰蛋白酶，sigma公司；ao/eb（吖啶橙/溴化乙錠），杭州昊天生物技術(shù)有限公司；jc-1細(xì)胞線粒體膜電位試劑盒，上海貝博生物；nm23h1單克隆抗體為santacruz公司產(chǎn)品，工作濃度為1：100，試劑盒為dako公司產(chǎn)品。其余試劑均為分析純。

細(xì)胞株采用人前列腺癌du-145細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞所，由本室傳代保存。

主要儀器與設(shè)備

cf16rxⅱ型高速低溫離心機，日本日立公司；forma3111co2培養(yǎng)箱，美國thermo公司；cogentuscale超濾系統(tǒng)，默克密理博；apurifierupc100快速蛋白液相色譜系統(tǒng)，gehealthcare；agilent-1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；超凈臺，上海智城分析儀器制造有限公司；ckx4倒置顯微鏡、bx2-flb3熒光顯微鏡和ccd-nc6051顯微攝像，日本olympus公司；酶標(biāo)儀，美國bio-rad公司；easycyte6ht-2l流式細(xì)胞儀，美國millipore公司；hitachih-7650透射電鏡，日立公司。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的一個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。