本發(fā)明涉及海帶多糖及其提取方法，具體說，是一種海帶多糖的復合酶提取方法及得到的海帶多糖。

背景技術：

我國的海帶產量位居世界首位。目前，海帶加工業(yè)以粗加工為主；褐藻工業(yè)以生產褐藻酸鈉、甘露醇及碘為主。褐藻工業(yè)及海帶粗加工時產生大量殘渣廢液及下腳料等，褐藻糖膠和海藻蛋白以及膳食纖維等存在于其中，不但污染環(huán)境浪費資源而且也是一種巨大的浪費。大量研究發(fā)現(xiàn)海帶多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血壓等多種生理活性，提高機體的免疫力。要找出一種能夠用于工業(yè)化生產的高效提取海帶中的海帶多糖的方法,為褐藻資源的高效利用開辟一種新的途徑，為褐藻工業(yè)的高值化開發(fā)利用建立一個完善的技術平臺，更好地開發(fā)海洋資源，進一步深入發(fā)展海洋經濟。

目前提取海帶多糖的方法很多，其中主要包括熱水浸提法、酸提取法、堿提法、超聲波提取法、微波提取法和酶提取法等。但這些方法提取的海帶多糖由于降解問題產率普遍較低。

熱水浸提法是提取海帶多糖較為傳統(tǒng)和重要的方法。具體的做法是先洗凈海帶，然后放到烘箱里烘烤至干，再研磨成粉末，最后將海帶粉倒入熱水中，進行提取。提取溫度70-90℃、提取時間6-8h、料液比為1：40-60。該法成本低廉，操作簡單，但是多糖的提取率較低，同時如果溫度太高，將會破壞多糖的活性，耗能較高。

酸提法比水提法的多糖得率高，但會引起多糖分子的降解，因此與水提法一樣，都存在提取率低、純度不高的不足。

堿提法與酸提法類似，在堿性條件下，海帶多糖的存在是其鹽類狀態(tài)，因此其溶解度變大，所以可采用堿提法提取海帶多糖。同樣，堿提取法同樣存在著提取率不高，堿環(huán)境可能會引起多糖分子的降解問題。

超聲波提取法比酸提法能顯著地提高海帶多糖的含量，可以節(jié)省時間和能源，但粗多糖得率增幅較小，且對提取設備要求較高，不適合大批量生產。周軍明等對超聲波法提取褐藻糖膠的工藝進行了優(yōu)化,確定了最佳的提取工藝：超聲波時間60min、超聲波功率800W。所得海帶多糖得率是8.64％。

張海艷，崔海萍等采用微波法提取海帶多糖，以時間、功率、料液比等建立正交試驗，確定最佳工藝條件為：時間為3min，微波功率為480W，料液比為l:20，在此條件下提取率為17.5％。

目前，世界范圍內提取海帶多糖方法大部分屬于純化學方法，此法提取海帶多糖由于降解問題不僅產率普遍較低(一般在20％左右)，而且大量的使用酸性或堿性的化學藥品對環(huán)境的污染是比較大的。酶在水果汁、酒、紡織、飼料、皮革、生產等行業(yè)的中的運用比較廣，并以其高效、無毒、專一性的等特點而備受青睞。目前酶解提取法提取海帶多糖還不夠成熟，僅有少量的文獻報道使用單一酶進行水解的方法。組成海帶細胞壁的很多種成分，它們之間的連接方法多種多樣，用單一種酶很難分解細胞壁，不能使細胞內的物質全部釋放出來。也有科研工作者采用復合酶法提取，但是大都是采用2種或3種酶復合，沒有除蛋白或者除蛋白不徹底，提取的多糖純度不夠高。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對目前海帶多糖現(xiàn)有提取工藝提取率、純度、活性低，或者污染環(huán)境,耗時長等缺點，提供一種海帶多糖的復合酶提取方法，采用復合酶法提取海帶中的多糖，旨在溫和條件下提高多糖得率和純度，完整保留多糖結構和生物活性。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案是：一種海帶多糖的復合酶提取方法，包括以下步驟：

(1)以海帶加工下腳料為原料，先烘干、粉碎，取海帶粉,加入全自動水解反應器，按料液比1g：35-45ml加入0.1mol/L,pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶，復合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶組成，按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.004-0.006g、半纖維素酶0.006-0.008g、果膠酶0.004-0.006g和蛋白酶0.01-0.014g；

(2)調節(jié)pH值為5.5-6.5，45-55℃，酶解3-4h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物；

(3)向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為65％-75％，于4℃冰箱冷藏，過夜，3000g-4000g/min離心20min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖；

(4)將粗多糖配成質量比濃度為25％-35％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為60％-80％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

具體地說，包括以下步驟：

(1)以海帶加工下腳料為原料，先烘干、粉碎，取海帶粉,加入全自動水解反應器，按料液比1g：40ml加入0.1mol/L，pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶，復合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶組成，按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.005g、半纖維素酶0.007g、果膠酶0.005g和蛋白酶0.012g；

(2)調節(jié)pH值為6.0，50℃，酶解3.5h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物；

(3)向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為65％，于4℃冰箱冷藏，過夜，3500g/min離心25min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖；

(4)將粗多糖配成質量比濃度為30％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為70％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

所述纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶為帝斯曼公司生產的纖維素酶Validase TRL，半纖維素酶Bakezyme HSP6000BG、果膠酶Klzrzyme150、蛋白酶ValidaseFP Concentrate。

上述的海帶多糖的復合酶提取方法制得的海帶多糖。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明采用復合酶法提取海帶中的多糖能在溫和條件下有效地提高了多糖得率，純度，完整保留多糖結構和生物活性，過程中不會產生有毒物質及對環(huán)境產生污染。粗多糖含量為45.0％，純度為43.7％。

具體實施方式

下面結合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明：

本發(fā)明的海帶多糖的復合酶提取方法，包括以下步驟：

(1)以海帶加工下腳料為原料，先烘干、粉碎，取海帶粉,加入全自動水解反應器，按料液比1g：35-45ml加入0.1mol/L,pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶，復合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶組成，按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.004-0.006g、半纖維素酶0.006-0.008g、果膠酶0.004-0.006g和蛋白酶0.01-0.014g；

(2)調節(jié)pH值為5.5-6.5，45-55℃，酶解3-4h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物；

(3)向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為65％-75％，于4℃冰箱冷藏，過夜，3000g-4000g/min離心20min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖；

(4)將粗多糖配成質量比濃度為25％-35％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為60％-80％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

具體地說，包括以下步驟：

(1)以海帶加工下腳料為原料，先烘干、粉碎，取海帶粉,加入全自動水解反應器，按料液比1g：40ml加入0.1mol/L，pH6.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶，復合酶由纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶組成，按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.005g、半纖維素酶0.007g、果膠酶0.005g和蛋白酶0.012g；

(2)調節(jié)pH值為6.0，50℃，酶解3.5h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物；

(3)向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為65％，于4℃冰箱冷藏，過夜，3500g/min離心25min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖；

(4)將粗多糖配成質量比濃度為30％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為70％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

所述纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶為帝斯曼公司生產的纖維素酶Validase TRL，半纖維素酶Bakezyme HSP6000BG、果膠酶Klzrzyme150、蛋白酶ValidaseFP Concentrate。

上述的海帶多糖的復合酶提取方法制得的海帶多糖。

纖維素酶和半纖維素酶的功能是分解細胞壁，使細胞壁破裂；果膠酶，可以分解果膠質，海帶的細胞間膠質含量較多，讓多糖可以釋放出來；而復合蛋白酶能夠使細胞膜和細胞內蛋白降解成小分子的寡肽片段或者氨基酸而除去，能提高多糖純度。最常用的除蛋白方法是三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法等。除此之外，蛋白酶法以其高效、安全的特點，現(xiàn)在也成為一種去除蛋白質的新方式。

下述實施例中，復合酶選用

粗多糖含量的測定:采用干質量法計算海帶粗多糖的質量，多糖的含量以苯酚-硫酸法檢測，確定多糖純度。

實施例1

海帶加工下腳料為原料，先烘干粉碎，取適量海帶粉,加入全自動水解反應器，加入一定體積(料液比1g：35ml)的0.1mol/L，pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.004g、半纖維素酶0.006g、果膠酶0.004g和蛋白酶0.01g；

調節(jié)pH值為5.5，45℃，酶解3h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物，向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為60％，于4℃冰箱冷藏，過夜。3000g/min離心20min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖。將粗多糖配成25％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為60％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

實施例2

海帶加工下腳料為原料，先烘干粉碎，取適量海帶粉,加入全自動水解反應器，加入一定體積(料液比1g：40ml)的0.1mol/L，pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.005g、半纖維素酶0.007g、果膠酶0.005g和蛋白酶0.012g；

調節(jié)pH值為6.0，50℃，酶解3.5h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物，向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為65％，于4℃冰箱冷藏，過夜。3500g/min離心20min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖。將粗多糖配成30％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為70％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

實施例3

海帶加工下腳料為原料，先烘干粉碎，取適量海帶粉,加入全自動水解反應器，加入一定體積(料液比1g：45ml)的0.1mol/L，pH6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液,攪勻后加入復合酶按海帶粉質量為1g計，纖維素酶的加入量為0.006g、半纖維素酶0.008g、果膠酶0.006g和蛋白酶0.014g；

調節(jié)pH值為6.5，55℃，酶解4h,升溫滅酶，取出水解液，抽濾除去沉淀及不溶物，向上清液加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為70％，于4℃冰箱冷藏，過夜。4000g/min離心20min,將沉淀物經冷凍干燥，即得海帶粗多糖。將粗多糖配成35％的水溶液，加入乙醇至體系乙醇體積分數(shù)為80％,重復沉淀三次得精制海帶多糖。

實施例4數(shù)據(jù)測試比較

采用本發(fā)明的方法制得的海帶多糖，與熱水浸提法和超聲波等提取法海帶多糖的得率，比較如下表：

幾種提取方法對海帶多糖得率的比較

以上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術思想及特點，其目的在于使本領域內的技術人員能夠理解本發(fā)明的內容并據(jù)以實施，不能僅以本實施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內。