本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法。
背景技術(shù)：
：青霉素?；甘侵苽洇?內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵酶，工業(yè)生產(chǎn)中已成功將該酶應(yīng)用于制備6-氨基青霉烷酸，多采用固定化酶形式。為制備出滿足生產(chǎn)要求的固定化酶，首先將青霉素酰化酶從發(fā)酵液中分離純化出來(lái)，然后進(jìn)行酶的固定化。青霉素酰化酶的表達(dá)載體主要包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和畢赤酵母等。盡管表達(dá)載體不一樣，但從發(fā)酵液中分離純化青霉素?；付济媾R一些共性問(wèn)題：(1)去除發(fā)酵液中未消耗的培養(yǎng)基成分；(2)青霉素酰化酶內(nèi)源表達(dá)，需要對(duì)菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎將酶釋放出來(lái)；(3)去除細(xì)胞破碎后料液中的油脂、多糖、色素、氨基酸和細(xì)胞碎片等雜質(zhì)；(4)去除細(xì)胞破碎后料液中的雜蛋白，提高青霉素酰化酶的純度。為制備得到高純度的青霉素酰化酶需要進(jìn)行固液分離、濃縮、除雜和分離純化等多步操作。作為工業(yè)酶，受成本所限無(wú)法采用層析技術(shù)等精細(xì)的分離技術(shù)，通常采用板框過(guò)濾、離心、硫酸銨沉淀、等電點(diǎn)沉淀和超濾等分離手段，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行組合形成相應(yīng)的工藝。將本領(lǐng)域已知的青霉素?；阜蛛x純化與固定化工藝總結(jié)如下：(1)發(fā)酵液預(yù)處理：首先用高壓勻漿或珠磨等機(jī)械法、有機(jī)溶劑或表面活性劑等化學(xué)法、溶菌酶等生物法對(duì)菌體進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后加入絮凝劑、助濾劑等，用離心或板框過(guò)濾進(jìn)行固液分離得到不含菌體的粗酶液；(2)青霉素酰化酶的初分離：首先用酸或堿調(diào)至等電點(diǎn)沉淀的方法將部分雜蛋白去除，然后用離心或板框過(guò)濾得到青霉素?；复置敢?，最后用膜過(guò)濾將青霉素酰化酶粗酶液濃縮到合適濃度；(3)青霉素酰化酶的精分離：首先對(duì)青霉素?；复置敢哼M(jìn)行硫酸銨鹽析，離心或板框過(guò)濾得到沉淀；然后用緩沖鹽溶液溶解沉淀，離心或板框過(guò)濾去除不溶性固體；最后用膜過(guò)濾去除小分子雜蛋白、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽等雜質(zhì)；(4)青霉素?；傅墓潭ɑ菏紫认蚓蛛x得到的青霉素?；敢褐醒a(bǔ)加緩沖鹽至合適濃度，離心或板框過(guò)濾去除固體雜質(zhì)，然后加入環(huán)氧基載體或活化的氨基載體進(jìn)行固定化。上述工藝存在的主要問(wèn)題如下：(1)工藝步驟過(guò)于繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，導(dǎo)致生產(chǎn)效率低；(2)步驟多加上部分酶會(huì)因操作時(shí)間長(zhǎng)而損失，導(dǎo)致酶的總收率低；(3)主要除雜方法為絮凝沉淀、硫酸銨沉淀、超濾和板框過(guò)濾(或離心)，分離手段比較傳統(tǒng)，除雜效果不顯著；(4)未從過(guò)程集成角度考慮固液分離、濃縮、除雜等分離純化以及固定化操作之間的相互聯(lián)系，導(dǎo)致步驟過(guò)多。因此，提供一種能夠有效簡(jiǎn)化操作步驟、縮短操作時(shí)間，并能夠有效提高酶分離純化的總收率的新的青霉素酰化酶的分離純化方法是十分必要的。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問(wèn)題，提供一種用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便、所得青霉素酰化酶的活性和收率較高。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過(guò)采用有機(jī)溶劑-無(wú)機(jī)鹽的體系，通過(guò)嚴(yán)格控制無(wú)機(jī)鹽的濃度，可以形成三相分配體系，并能夠?qū)⑶嗝顾仵；父患较孪嗳芤褐?如果進(jìn)入上相溶液中，一方面容易使酶失活，另一方面無(wú)法直接進(jìn)行固定化；如果富集到中相(固體相)，無(wú)法直接進(jìn)行固定化，需要額外增加操作步驟)；從而，可以在該下相溶液中直接進(jìn)行青霉素酰化酶的固定化；由此，本發(fā)明的方法可以將傳統(tǒng)方法的各個(gè)步驟在一個(gè)單元操作完成，極大地簡(jiǎn)化了工藝，從而成為一種極具前景的過(guò)程集成技術(shù)。本發(fā)明的發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，相比現(xiàn)有技術(shù)使用的其他種類的醇，叔丁醇能夠最大限度地保持青霉素?；傅幕钚?。本發(fā)明提供了一種用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法，其中，該方法包括以下步驟：(1)制備含有青霉素?；复置敢汉蜔o(wú)機(jī)鹽的無(wú)機(jī)鹽混合溶液，該含鹽混合溶液中所述無(wú)機(jī)鹽的濃度為0.05-0.35g/ml；(2)將步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇混合，然后進(jìn)行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素酰化酶的下相溶液組成的三相分配體系；(3)向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進(jìn)行青霉素?；傅墓潭ɑ１景l(fā)明的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比所存在的優(yōu)勢(shì)至少在于：(1)本發(fā)明的方法將青霉素?；傅姆蛛x純化涉及的固液分離、初分離和精分離中的多個(gè)操作單元在一個(gè)操作單元中完成，并將酶的分離純化與固定化耦合，大大簡(jiǎn)化了操作步驟、縮短了操作時(shí)間、提高了酶提取的總收率；(2)本發(fā)明的方法省去了多步板框過(guò)濾或離心、1-2步膜過(guò)濾操作，減少了污水排放，降低了生產(chǎn)成本，提高了生產(chǎn)效率；(3)本發(fā)明的方法分離純化青霉素?；傅目偸章曙@著高于現(xiàn)有技術(shù)；(4)本發(fā)明的方法制備得到的固定化酶的酶活顯著提高；(5)本發(fā)明所用的叔丁醇可回收后重復(fù)使用，進(jìn)一步降低了生產(chǎn)成本；(6)本發(fā)明的方法的放大效應(yīng)小，很有工業(yè)化應(yīng)用前景。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式部分予以詳細(xì)說(shuō)明。具體實(shí)施方式在本文中所披露的范圍的端點(diǎn)和任何值都不限于該精確的范圍或值，這些范圍或值應(yīng)當(dāng)理解為包含接近這些范圍或值的值。對(duì)于數(shù)值范圍來(lái)說(shuō)，各個(gè)范圍的端點(diǎn)值之間、各個(gè)范圍的端點(diǎn)值和單獨(dú)的點(diǎn)值之間，以及單獨(dú)的點(diǎn)值之間可以彼此組合而得到一個(gè)或多個(gè)新的數(shù)值范圍，這些數(shù)值范圍應(yīng)被視為在本文中具體公開(kāi)。本發(fā)明提供了一種用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化耦合方法，其中，該方法包括以下步驟：(1)制備含有青霉素酰化酶粗酶液和無(wú)機(jī)鹽的無(wú)機(jī)鹽混合溶液，該含鹽混合溶液中所述無(wú)機(jī)鹽的濃度為0.05-0.35g/ml；(2)將步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇混合，然后進(jìn)行分相，得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系；(3)向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進(jìn)行青霉素?；傅墓潭ɑ?。本發(fā)明進(jìn)行分離純化與固定化的對(duì)象為用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；?，該酶屬于青霉素?；傅囊环N，并且是特定地用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；?，即術(shù)語(yǔ)“用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素酰化酶”在本發(fā)明中指的是這種特定的青霉素?；?。在本發(fā)明中為了描述方便，將“用于制備6-氨基青霉烷酸的青霉素?；浮焙?jiǎn)稱為“青霉素酰化酶”，即在本文本中所述“青霉素?；浮本傅氖恰坝糜谥苽?-氨基青霉烷酸的青霉素?；浮薄１景l(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在步驟(1)中所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液中無(wú)機(jī)鹽的濃度能夠顯著地影響到是否能夠在第(2)步中得到三相分配體系，一般來(lái)說(shuō)，所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液中所述無(wú)機(jī)鹽的濃度達(dá)到上述的0.05-0.35g/ml即可以使得在步驟(2)中得到三相分配體系，在優(yōu)選的情況下，所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液中所述無(wú)機(jī)鹽的濃度為0.15-0.3g/ml，更優(yōu)選為0.2-0.25g/ml。在步驟(1)中，所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph為5-9，有利于維持青霉素?；傅拿富畈皇軗p失。為了能夠更好地形成三相分配體系并且使青霉素酰化酶盡可能地全部進(jìn)入下相溶液中，所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph優(yōu)選為5-8，最優(yōu)選為6-8，進(jìn)一步優(yōu)選為7-8。在步驟(1)中，所述無(wú)機(jī)鹽可以為水溶性磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽和鹵化物中的一種或多種。其中，所述水溶性磷酸鹽例如為磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸鉀、磷酸氫二納、磷酸二氫納、磷酸納；所述硫酸鹽例如為硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀；所述碳酸鹽例如為碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀；所述檸檬酸鹽例如為檸檬酸鈉、檸檬酸鉀；所述鹵化物例如為氯化鈉、氯化鉀，當(dāng)所述無(wú)機(jī)鹽為鹵化物時(shí)優(yōu)選與水溶性磷酸鹽配合使用。在步驟(1)中，在優(yōu)選的情況下，所述無(wú)機(jī)鹽為水溶性磷酸鹽和/或硫酸鹽，即優(yōu)選選自磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二納、磷酸二氫納、硫酸銨、硫酸鈉和硫酸鉀中的一種或多種；更優(yōu)選地，所述無(wú)機(jī)鹽為水溶性磷酸鹽，即最優(yōu)選選自磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉中的一種或多種。在步驟(1)中，為了將所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph控制在上述范圍內(nèi)，可以通過(guò)將所述無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行組合，并根據(jù)酸堿性逐步加入到混合溶液中。例如，根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選情況，當(dāng)所述無(wú)機(jī)鹽為磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的混合物時(shí)，為了將ph調(diào)節(jié)至7.5-8.5，可以先加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)ph至6-7，再加磷酸氫二鉀調(diào)節(jié)ph至8-9，最后加入磷酸二氫鉀調(diào)節(jié)ph至7.5-8.5。在步驟(1)中，術(shù)語(yǔ)“青霉素酰化酶粗酶液”符合本領(lǐng)域的常規(guī)定義。所述青霉素酰化酶粗酶液可以通過(guò)使用表達(dá)載體進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)然后經(jīng)預(yù)處理得到；青霉素酰化酶的表達(dá)載體可以是大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或畢赤酵母；所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件可以采用本領(lǐng)域已知的發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行。所述預(yù)處理的目的在于將發(fā)酵所得含有菌體的粗酶液進(jìn)行細(xì)胞破碎，或者將發(fā)酵所得含有菌體的粗酶液進(jìn)行細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)，以得到釋放出青霉素酰化酶的粗酶液。具體的預(yù)處理方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，在此不再贅述。在預(yù)處理的過(guò)程中可能會(huì)用到磷酸鹽等無(wú)機(jī)鹽，這些無(wú)機(jī)鹽的用量很少，或者會(huì)在預(yù)處理的過(guò)程中發(fā)生反應(yīng)除去，因此并不會(huì)對(duì)步驟(1)中所述含鹽混合物的無(wú)機(jī)鹽濃度產(chǎn)生明顯影響。在步驟(1)中，所述青霉素酰化酶粗酶液可以為經(jīng)細(xì)胞破碎后未處理的青霉素?；复置敢?，也可以為經(jīng)細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)后的青霉素?；复置敢?；所述去除菌體等固體雜質(zhì)的方法可以為板框過(guò)濾或離心。在步驟(1)中，所述制備含有青霉素酰化酶粗酶液和無(wú)機(jī)鹽的無(wú)機(jī)鹽混合溶液的方法可以包括：將無(wú)機(jī)鹽溶解于所述青霉素?；复置敢褐?。在步驟(1)中，所述青霉素酰化酶粗酶液中青霉素?；傅拿富顬?0-300iu/ml，優(yōu)選為70-300iu/ml。優(yōu)選地，所述粗酶液為經(jīng)細(xì)胞破碎后去除菌體等固體雜質(zhì)后的青霉素?；复置敢?，當(dāng)使用這種粗酶液時(shí)，所述青霉素?；复置敢褐星嗝顾仵；傅拿富顑?yōu)選為150-300iu/ml。在步驟(2)中，所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液與叔丁醇的體積比可以為1：0.1-2，優(yōu)選為1：0.2-1.5，更優(yōu)選為1：0.25-0.6。在步驟(2)中，所述叔丁醇可以為商購(gòu)得到的叔丁醇液體，也可以以叔丁醇與水的混合液的形式與所述無(wú)機(jī)鹽混合溶液相混合。為了使本發(fā)明的方法更具有經(jīng)濟(jì)性，優(yōu)選地，該步驟(2)的過(guò)程還包括：從所述上相溶液中回收叔丁醇并循環(huán)用于與無(wú)機(jī)鹽混合溶液相混合的過(guò)程中。所述回收的方法例如為蒸餾法，所得的叔丁醇通常為叔丁醇與水的混合液，該所述叔丁醇和水的混合液中叔丁醇的含量可以為70-100重量％，優(yōu)選為80-100重量％，更優(yōu)選為85-95重量％。在步驟(2)中，所述混合的方式?jīng)]有特別的限定，例如為振蕩或攪拌。在步驟(2)中，所述分相的方式?jīng)]有特別的限定，例如為離心或靜置。在步驟(2)中，當(dāng)所述分相的方式為離心分相時(shí)，該分相溫度可以為0-40℃，優(yōu)選為4-37℃，更優(yōu)選為15-30℃；離心力可以為500-5000g，優(yōu)選為1000-4000g，更優(yōu)選為2000-3500g；時(shí)間可以為2-60min,優(yōu)先為2-40min，更優(yōu)選為5-20min。在步驟(2)中，當(dāng)所述分相的方式為靜置分相時(shí)，該分相溫度可以為4-30℃，優(yōu)選為10-25℃，更優(yōu)選為12-17℃；時(shí)間為0.1-4h，優(yōu)選為0.3-3h，更優(yōu)選為0.5-2h。通過(guò)本發(fā)明的方法能夠得到富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系，在該三相分配體系中，青霉素?；副桓患M(jìn)入下相的無(wú)機(jī)鹽溶液中，酶的活性可以得到很好的保持，并且可以直接將下相溶液用于青霉素酰化酶的固定化，實(shí)現(xiàn)了集成化的操作，有效簡(jiǎn)化了操作步驟、縮短了操作時(shí)間，從而降低了工業(yè)成本。所述上相溶液主要含有叔丁醇和水。在所述上相溶液和下相溶液之間會(huì)緊密地夾有一層固體層，即為所述中相固體，該中相固體中的固體主要包括雜質(zhì)蛋白、多糖以及可能存在的菌體碎片等。在步驟(3)中，向步驟(2)所得下相溶液中加入載體進(jìn)行酶的固定化，該過(guò)程可以包括：所述下相溶液的酶活為50-150iu/ml，優(yōu)選為100-150iu/ml，若酶活高于150iu/ml時(shí)用水稀釋至上述范圍，然后補(bǔ)加磷酸鹽至無(wú)機(jī)鹽占總體系的濃度為0.2-0.45g/ml(優(yōu)選為0.3-0.4g/ml)，再加入載體進(jìn)行酶的固定化；所述補(bǔ)加磷酸鹽的過(guò)程可以參照步驟(1)進(jìn)行，在補(bǔ)加的過(guò)程中優(yōu)選控制ph值在步驟(1)所要求的ph值的范圍內(nèi)。所述載體的加入量可以按照本領(lǐng)域常規(guī)的加入量，例如為總酶活與載體重量之比可以為500-1000iu/g，優(yōu)選為700-900iu/g。在步驟(3)中，所述載體可以為本領(lǐng)域已知的各種商業(yè)化載體，如氨基載體、環(huán)氧基載體等。當(dāng)所述載體為環(huán)氧基載體時(shí)可以不進(jìn)行活化直接使用。當(dāng)所述載體為氨基載體時(shí)優(yōu)選先進(jìn)行活化，氨基載體的活化方法按照本領(lǐng)域常規(guī)的方式進(jìn)行即可，在此不再贅述。在步驟(3)中，所述酶的固定化的條件可以為本領(lǐng)域常規(guī)的操作條件，例如可以包括：溫度為10-40℃，優(yōu)選為20-30℃；ph為5-9，優(yōu)選為7-9；轉(zhuǎn)速為50-300rpm，優(yōu)選為100-200rpm；時(shí)間為4-48h，優(yōu)選為16-40h。本發(fā)明步驟(3)的酶的固定化的方法還可以包括固定化酶后處理的過(guò)程，經(jīng)后處理可以得到可直接用于工業(yè)制備6-氨基青霉烷酸的固定化青霉素?；赋善罚龊筇幚淼姆椒梢詾楸绢I(lǐng)域常規(guī)的后處理方法，例如包括：酶的固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入2-6倍體積(ml/g)純化水清洗2-4次，抽干溶液，收集固定化酶放置2-6℃庫(kù)房中保存。本發(fā)明的方法制備得到的固定化青霉素?；笐?yīng)用于制備6-氨基青霉烷酸中的具體方法按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)行即可，在此不再贅述。以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。首先，對(duì)以下實(shí)施例和對(duì)比例中所使用的物質(zhì)、試驗(yàn)方法和計(jì)算方法進(jìn)行如下介紹：1、固定化所使用的載體固定化所使用的載體為滄州遠(yuǎn)成化工有限公司提供的環(huán)氧基載體(l-11)。2、酶活的測(cè)定酶活測(cè)定采用堿滴定方法。酶活的定義為：在28℃、ph8.0條件下，單位的青霉素酰化酶1min消耗1μmol青霉素g鉀鹽的酶活為一個(gè)單位(iu)。原理為：在28℃、ph8.0條件下，青霉素?；杆馇嗝顾豨鉀鹽生成等摩爾的6-apa和苯乙酸，用0.1mol/l的naoh標(biāo)定液精確滴定苯乙酸即可計(jì)算青霉素g鉀鹽的消耗量。具體步驟如下：1)緩沖液的配制：稱取4.76g磷酸氫二鉀和0.55g磷酸二氫鉀溶解于900ml蒸餾水中，用磷酸二氫鉀調(diào)ph至7.8，然后定容到1l。2)0.1mol/lnaoh溶液配制：先配制飽和naoh溶液，待澄清后取上清液5ml加入到1000ml無(wú)二氧化碳的水中，搖勻。再使用鄰苯二甲酸氫鉀為基準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)定，計(jì)算其濃度。3)3mol/lnaoh溶液配制：快速用干凈的小燒杯稱取30gnaoh后，用純化水溶解后倒入250ml的容量瓶中，用純化水沖洗燒杯3次并倒入容量瓶中，定容搖勻后即為3mol/lnaoh溶液。4)底物的配制：稱取2g青霉素g鉀鹽，溶于40ml酶活緩沖液中，用3mol/lnaoh將ph調(diào)至8.0，現(xiàn)配現(xiàn)用。5)酶活測(cè)定：精確量取一定體積的液體酶或稱取一定質(zhì)量的固定化酶至提前預(yù)熱到28℃的40ml底物溶液中，保持溫度并快速攪拌，用0.1或3mol/lnaoh溶液調(diào)ph至8.0開(kāi)始計(jì)時(shí)，間斷滴加0.1mol/l的naoh標(biāo)定液維持ph為8.0，反應(yīng)5min左右，記錄加naoh滴定液量和反應(yīng)時(shí)間。6)液體酶活計(jì)算：酶活力＝v1*c*1000/t*v2。其中，酶活力單位為iu/ml；v1表示測(cè)定時(shí)間內(nèi)消耗的naoh滴定液體積(ml)；c表示naoh滴定液(0.1mol/l)濃度(mol/l)；1000表示毫摩爾和微摩爾的換算比例；t表示反應(yīng)時(shí)間(min)；v2表示液體酶體積(ml)。7)固定化酶活計(jì)算：酶活力＝v1*c*1000/t*w。其中，酶活力單位為iu/g；v1表示測(cè)定時(shí)間內(nèi)消耗的naoh滴定液體積(ml)；c表示naoh滴定液(0.1mol/l)濃度(mol/l)；1000表示毫摩爾和微摩爾的換算比例；t表示反應(yīng)時(shí)間(min)；w表示固定化酶重量(g)。3、固定化青霉素?；赣糜谥苽?-氨基青霉烷酸(1)制備方法稱取固定化青霉素?；?0g放置到反應(yīng)器中，將濃縮后的青霉素g鉀鹽溶液用0.25％硼酸溶液配置成青霉素g鉀鹽效價(jià)為130000u/ml反應(yīng)溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。反應(yīng)過(guò)程中用3mol氨水將ph值控制在8.0，溫度控制為30℃，反應(yīng)時(shí)間為40min。每5分鐘記錄一次反應(yīng)時(shí)間、溫度、ph值和氨水使用量，取樣用液相色譜法測(cè)定青霉素g鉀鹽和6-apa的含量，計(jì)算青霉素g鉀鹽的殘留效價(jià)和6-apa的轉(zhuǎn)化率。(2)青霉素g鉀鹽的測(cè)定青霉素g鉀鹽用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。具體如下：1)流動(dòng)相配制：稱取磷酸二氫鉀14.85g于2000ml燒杯中，加水1400ml，攪拌溶解，用1mol/lkoh溶液調(diào)節(jié)ph值至4.5，然后與600ml色譜純乙腈混合，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾后，超聲脫氣20min；2)對(duì)照品配置：稱取青霉素g鉀鹽對(duì)照品0.0315g于50ml容量瓶中，加水稀釋定容，從上述溶液中取5ml至50ml容量瓶中，用水再次定容；3)樣品處理：量取2ml反應(yīng)液用水稀釋至50ml；4)液相條件：柱子為c18(150mm*4.6mm)，進(jìn)樣量為20μl，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為215nm。(3)6-apa的測(cè)定6-apa用液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。具體如下：1)流動(dòng)相配制：稱取磷酸氫二鈉5.0g和磷酸二氫鉀2.7g，溶解于2000ml燒杯中，加水1900ml，攪拌溶解，用1mol/lkoh溶液調(diào)ph值至7.0，然后與100ml乙腈混合，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，超聲脫氣20min；2)對(duì)照品配置：稱取6-apa對(duì)照品0.1000g，苯乙酸鈉0.0750g于同一500ml容量瓶中，加ph7.0的緩沖液定容至刻度；3)樣品處理：樣品使用與對(duì)照品相同的緩沖液稀釋250倍；4)液相條件：柱子為c18(150mm*4.6mm)，進(jìn)樣量為20μl，流速為1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。4、青霉素?；副然畹挠?jì)算青霉素?；副然畹挠?jì)算公式為：比活(iu/mg)＝酶活(iu/ml)/蛋白質(zhì)濃度(mg/ml)，其中蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。5、酶收率的計(jì)算(1)每步處理青霉素?；甘章?y，％)的計(jì)算公式為：y＝c*v/(c0*v0)*100％，其中，c表示處理后料液中青霉素?；傅臐舛?iu/ml)；v表示處理后料液體積(ml)；c0表示處理前料液中青霉素?；傅臐舛?iu/ml)；v0表示處理前料液體積(ml)；(2)酶提取總收率(％)＝發(fā)酵液預(yù)處理步驟收率(％)×酶的分離純化步驟收率(％)。制備例(1)青霉素?；傅陌l(fā)酵培養(yǎng)使用重組表達(dá)的畢赤酵母菌株，采用現(xiàn)有文獻(xiàn)(羅倩，重組畢赤酵母產(chǎn)pga高密度發(fā)酵及其固定化[d]，中南林業(yè)科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2013)中所述的方法進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)試所得發(fā)酵液中青霉素?；傅拿富顬?3.2iu/ml。(2)發(fā)酵液預(yù)處理：(i)發(fā)酵結(jié)束后，按料液體積加0.01g/ml的硫酸銨，攪拌溶解，然后按料液體積加0.008g/ml的十六烷基三甲基溴化銨，攪拌25min；將料液升溫至45℃，同時(shí)用2mol/lnaoh溶液調(diào)ph至7.6；溫度和ph調(diào)到位后，維持溫度為45℃，間斷補(bǔ)加3mol/lnaoh溶液維持ph在7.6±0.1，浸泡80min，間隔取樣測(cè)定酶活至細(xì)胞破碎基本完全，得到青霉素?；复置敢篿，經(jīng)測(cè)定該青霉素?；复置敢篿的酶活為79.8iu/ml，蛋白濃度為11.9mg/ml，比活為6.7iu/mg；(ii)細(xì)胞破碎結(jié)束后，將溫度降至40℃以下，按料液體積加0.06g/ml，磷酸鹽(根據(jù)ph調(diào)整磷酸氫二鉀和磷酸氫二鉀的比例)，調(diào)節(jié)ph至8.0，攪拌使鹽完全溶解，然后緩慢加入0.4g/ml氯化鈣溶液調(diào)節(jié)ph至5.1；按料液體積加0.09g/ml硅藻土，攪拌混合混勻后板框過(guò)濾，收集濾液。(iii)濾液用2mol/lnaoh溶液調(diào)ph至8.0，加少量硅藻土，攪拌混合混勻后板框過(guò)濾，收集濾液；然后用中空纖維膜將濾液濃縮，收集濃縮液，即為青霉素?；复置敢篿i，經(jīng)測(cè)定該青霉素酰化酶粗酶液ii的酶活為210.2iu/ml，蛋白濃度為12.0mg/ml，比活為17.5iu/mg。分別按照以下實(shí)施例和對(duì)比例所述的方法對(duì)制備例所得的青霉素酰化酶粗酶液i或ii進(jìn)行青霉素?；傅姆蛛x純化與固定化。實(shí)施例1(1)在14℃的條件下，按照濃度為0.2g/ml的用量將磷酸鹽(由k2hpo4.3h2o和kh2po4組成)在90min內(nèi)溶解于制備例得到的青霉素?；复置敢篿i中并在加入的過(guò)程中調(diào)節(jié)溶液的ph值為8.0(先加kh2po4調(diào)節(jié)ph至6.5，再加k2hpo4.3h2o調(diào)節(jié)ph至8.3，最后加入kh2po4調(diào)節(jié)ph至8.0)，得到無(wú)機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.6的體積比相混合，漩渦振蕩2min至充分混合，然后3500g離心10min，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素酰化酶的下相溶液組成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為85重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至酶活為100iu/ml，補(bǔ)加磷酸鹽至磷酸鹽濃度為0.4g/ml，并在補(bǔ)加的過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)k2hpo4.3h2o和kh2po4的配比使ph值調(diào)節(jié)為8.0，再按總酶活與載體重量之比為900iu/g加入環(huán)氧基載體進(jìn)行固定化，操作條件為：溫度為27℃，ph為8，轉(zhuǎn)速為150rpm，時(shí)間為30h；(5)固定化酶后處理：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(ml/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫(kù)房中保存。計(jì)算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測(cè)定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。實(shí)施例2(1)在12℃的條件下，按照濃度為0.3g/ml的用量在90min內(nèi)將磷酸鹽(由k2hpo4.3h2o和kh2po4組成)溶解于制備例得到的青霉素?；复置敢篿中并在加入的過(guò)程中調(diào)節(jié)溶液的ph值為6(先加kh2po4調(diào)節(jié)ph至5，再加k2hpo4.3h2o調(diào)節(jié)ph至7，最后加入kh2po4調(diào)節(jié)ph至6)，加鹽的同時(shí)攪拌(攪拌轉(zhuǎn)速為250rpm)使鹽充分溶解，得到無(wú)機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.25的體積比相混合，漩渦振蕩2min至充分混合，然后2000g離心20min，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為95重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至酶活為50iu/ml，按總酶活與載體重量之比為700iu/g加入環(huán)氧基載體進(jìn)行固定化，操作條件為：溫度為20℃，ph為9，轉(zhuǎn)速為100rpm，時(shí)間為40h；(5)固定化酶后處理：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(ml/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫(kù)房中保存。計(jì)算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測(cè)定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。實(shí)施例3(1)取制備例得到的青霉素?；复置敢篿i，加入罐體中，控制罐體溫度13℃，攪拌速度270rpm，然后在90min內(nèi)按照濃度為0.25g/ml的用量加入磷酸鹽并在加入過(guò)程中控制溶液的ph值約為7.8(先加kh2po4調(diào)節(jié)ph至6.5，再加k2hpo4.3h2o調(diào)節(jié)ph至8.0，最后加入kh2po4調(diào)節(jié)ph至7.8)，即得到無(wú)機(jī)鹽混合溶液；(2)將步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液按照1：0.5的體積比相混合，350rpm攪拌30min充分混合，然后控制罐體溫度在15℃，停止攪拌，靜置分相1小時(shí)，形成富含叔丁醇的上相溶液、中相固體以及富含鹽和青霉素?；傅南孪嗳芤航M成的三相分配體系，將三相溶液進(jìn)行分離；(3)取步驟(2)所得的上相溶液，蒸餾得到叔丁醇的濃度為88重量％的叔丁醇和水的混合液，并將其循環(huán)用于步驟(2)中；(4)步驟(2)所得的下相溶液用水稀釋至青霉素?；傅臐舛葹?00iu/ml，補(bǔ)加磷酸鹽至磷酸鹽濃度為0.35g/ml，并在補(bǔ)加的過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)k2hpo4.3h2o和kh2po4的配比使ph值調(diào)節(jié)為7.8，按總酶活與載體重量之比為800iu/g加入環(huán)氧基載體進(jìn)行固定化，操作條件為：溫度為26.5℃，ph為8，轉(zhuǎn)速為150rpm，時(shí)間為32h，最后靜置8h；(5)固定化酶后處理：酶固定化操作結(jié)束后，抽干溶液，然后按照固定化酶重量加入4倍體積(ml/g)純化水清洗三次，抽干溶液，收集固定化酶放置4℃庫(kù)房中保存。計(jì)算發(fā)酵液預(yù)處理收率記于表1中。取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表1中。取樣測(cè)定步驟(5)所得固定化酶的酶活和水含量，將所得結(jié)果記于表1中。表1實(shí)施例1實(shí)施例2實(shí)施例3發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)719271分離純化收率(％)936895酶提取總收率(％)666367分離酶比活(iu/mg)31.318.226.1固定化酶活(iu/g)404313353固化酶水含量(％)555555實(shí)施例4和對(duì)比例1實(shí)施例4(包括實(shí)施例4-1～4-4)和對(duì)比例1(包括對(duì)比例1-1～1-2)用于說(shuō)明不同的萃取體系對(duì)青霉素?；阜蛛x純化的影響。實(shí)施例4按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，將步驟(1)中的磷酸鹽替換為相同質(zhì)量的其他無(wú)機(jī)鹽，具體如表2所示。對(duì)比例1按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，將步驟(2)中的叔丁醇替換為相同質(zhì)量的其他有機(jī)溶劑，具體如表2所示。分別取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表2中。表2從表2可以看出，通過(guò)采用本發(fā)明的萃取體系可以使得萃取得到的酶的比活達(dá)到22.8iu/mg以上，收率達(dá)到78％以上，尤其當(dāng)采用實(shí)施例1的叔丁醇-磷酸鹽體系時(shí)萃取得到的酶的比活可以達(dá)到31.3iu/mg，收率可以達(dá)到93％。而當(dāng)對(duì)比例將叔丁醇替換為乙醇或異丙醇時(shí)，青霉素酰化酶發(fā)生了失活。實(shí)施例5和對(duì)比例2實(shí)施例5(包括實(shí)施例5-1～5-3)和對(duì)比例2(包括對(duì)比例2-1～2-2)用于說(shuō)明步驟(1)中無(wú)機(jī)鹽混合溶液中無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)青霉素酰化酶分離純化的影響。實(shí)施例5按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變磷酸鹽的重量使得磷酸鹽的濃度改變，但是保持溶液的ph值不變，具體如表3所示。對(duì)比例2按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變磷酸鹽的重量使得磷酸鹽的濃度改變，但是保持溶液的ph值不變，具體如表3所示。分別取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表3中。表3從表3可以看出，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽的濃度在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)，萃取得到的酶的比活達(dá)到24.6iu/mg以上，收率可以達(dá)到81％以上；當(dāng)無(wú)機(jī)鹽的濃度在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)，萃取得到的酶的比活達(dá)到28。4iu/mg以上，收率可以達(dá)到90％以上。而當(dāng)無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)低(對(duì)比例2-1)時(shí)無(wú)法形成三相分配體系。當(dāng)無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高過(guò)高(對(duì)比例2-2)時(shí)，大部分青霉素?；阜峙涞街邢?，下相萃取得到的酶的比活和收率均有顯著的下降。實(shí)施例6實(shí)施例6(包括實(shí)施例6-1～6-5)用于說(shuō)明步驟(1)中無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph值對(duì)青霉素?；阜蛛x純化的影響。按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，在保持磷酸鹽重量不變的基礎(chǔ)上，改變磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀的配比使所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph值達(dá)到如表4所示，在需要的情況下可以用磷酸或3mol/l的naoh進(jìn)行微調(diào)。分別取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表4中。表4從表4可以看出，當(dāng)無(wú)機(jī)鹽混合溶液的ph值在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)，萃取得到的酶的比活可以達(dá)到27.0iu/mg以上，收率可以達(dá)到73％以上；在本發(fā)明最優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)萃取得到的酶的比活可以達(dá)到27.0iu/mg以上，收率顯著提高到89％以上。實(shí)施例7實(shí)施例7(包括實(shí)施例7-1～7-5)用于說(shuō)明步驟(2)中叔丁醇的用量對(duì)青霉素?；阜蛛x純化的影響。按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行，所不同的是，改變步驟(2)中步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液的體積比，具體如表5所示。分別取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表5中。表5從表5可以看出，當(dāng)步驟(1)所得無(wú)機(jī)鹽混合溶液與步驟(3)回收所得的叔丁醇和水的混合液的體積比在本發(fā)明的優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)，萃取得到的酶的比活達(dá)到22.4iu/mg以上，收率可以達(dá)到83％以上；當(dāng)在本發(fā)明的最優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)萃取得到的酶的比活達(dá)到28.8iu/mg以上，收率可以達(dá)到93％以上。實(shí)施例8實(shí)施例8(包括實(shí)施例8-1～8-2)用于說(shuō)明步驟(2)中采用靜置分相時(shí)的靜置時(shí)間對(duì)青霉素?；阜蛛x純化的影響。按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行，所不同的是，在步驟(2)中靜置分相的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行取樣，測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表6中，具體的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置如表6所示。分別取樣測(cè)定上述步驟(2)所得的下相溶液的酶活和蛋白濃度，計(jì)算酶的比活和收率，將結(jié)果記于表6中。表6從表6可以看出，隨著靜置時(shí)間的增長(zhǎng)，萃取得到的酶的比活和收率均有所增長(zhǎng)，但當(dāng)靜置時(shí)間超過(guò)2小時(shí)時(shí)，萃取得到的酶的比活和收率出現(xiàn)輕微的下降，生產(chǎn)效率有所降低。實(shí)施例9實(shí)施例9(包括實(shí)施例9-1～9-4)用于說(shuō)明步驟(3)中稀釋后的青霉素?；傅拿笣舛葘?duì)青霉素?；腹潭ɑ挠绊憽０凑諏?shí)施例3的方法進(jìn)行，所不同的是，在步驟(3)中，分別將步驟(2)所得下相溶液稀釋至不同的酶活，具體如表7所示。分別取樣測(cè)定最終所得固定化酶的酶活和水含量，將結(jié)果記于表7中。表7從表7可以看出，當(dāng)步驟(3)中稀釋后的青霉素酰化酶的酶濃度在本發(fā)明的較大范圍內(nèi)時(shí)，所得固定化酶的酶活可以達(dá)到332iu/g以上，水含量可以在53-56％的范圍內(nèi)；當(dāng)在本發(fā)明的最優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)所得固定化酶的酶活可以達(dá)到351u/mg以上，水含量可以在53-55％的范圍內(nèi)。實(shí)施例10實(shí)施例10(包括實(shí)施例10-1～10-4)用于說(shuō)明步驟(3)中補(bǔ)加無(wú)機(jī)鹽后所得溶液的無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)青霉素?；腹潭ɑ挠绊憽０凑諏?shí)施例3的方法進(jìn)行，所不同的是，在步驟(3)中，補(bǔ)加磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀(控制ph值不變)至無(wú)機(jī)鹽占總體系的質(zhì)量體積比分別如表8所示。分別取樣測(cè)定最終所得固定化酶的酶活和水含量，將結(jié)果記于表8中。表8從表8可以看出，當(dāng)步驟(3)中補(bǔ)加無(wú)機(jī)鹽后所得溶液的無(wú)機(jī)鹽濃度在本發(fā)明的較大范圍內(nèi)時(shí)，所得固定化酶的酶活可以達(dá)到302iu/g以上，水含量可以在54-56％的范圍內(nèi)；當(dāng)在本發(fā)明的最優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)所得固定化酶的酶活可以達(dá)到332iu/g以上，水含量可以在54-56％的范圍內(nèi)。實(shí)施例11實(shí)施例11(包括實(shí)施例11-1～11-4)用于說(shuō)明步驟(3)中青霉素酰化酶與載體的用量比對(duì)青霉素?；腹潭ɑ挠绊憽０凑諏?shí)施例3的方法進(jìn)行，所不同的是，在步驟(3)中，改變載體的加入量，使得青霉素酰化酶與載體的用量比如表9所示。分別取樣測(cè)定固定化收率、最終所得固定化酶的酶活和水含量，將結(jié)果記于表9中。表9從表9可以看出，當(dāng)步驟(3)中青霉素?；概c載體的用量比在本發(fā)明的較大范圍內(nèi)時(shí)，固定化收率可以達(dá)到39.3％以上，所得固定化酶的酶活可以達(dá)到311iu/g以上，水含量可以在54-56％的范圍內(nèi)；當(dāng)在本發(fā)明的最優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)固定化收率可以達(dá)到42.4％以上，所得固定化酶的酶活可以達(dá)到352iu/g以上，水含量可以在55-56％的范圍內(nèi)。實(shí)施例12該實(shí)施例12(包括實(shí)施例12-1～12-5)用于說(shuō)明在步驟(2)中對(duì)叔丁醇進(jìn)行多次循環(huán)利用對(duì)青霉素酰化酶的分離純化與固定化的影響。按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行多次試驗(yàn)，所不同的是，在步驟(2)中所使用的叔丁醇和水的混合物為上一次試驗(yàn)回收得到的叔丁醇，也就是說(shuō)，每進(jìn)行一次試驗(yàn)所使用的叔丁醇的循環(huán)次數(shù)增加一次，具體如表10所示。測(cè)定并計(jì)算所得的發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)、酶的分離純化收率(％)、酶提取總收率(％)(即發(fā)酵液預(yù)處理和酶的分離純化兩步的總收率)、固定化酶活(iu/g)和固定化酶水含量(％)記錄于表10中。表10從表10中可以看出，使用5次回收所得叔丁醇分別進(jìn)行試驗(yàn)的數(shù)據(jù)重復(fù)性好，發(fā)酵液預(yù)處理收率、酶的分離純化收率、酶提取總收率、固定化酶活和固定化酶水含量的數(shù)據(jù)基本保持在誤差范圍內(nèi)；分離純化步驟平均收率為96±1％，酶提取平均總收率為68±1％，得到的固定化酶成品平均酶活為353±8iu/g，平均水含量為55±1％。另外，分別取實(shí)施例12-1、實(shí)施例12-2和實(shí)施例12-4所得的固定化酶成品制備6-氨基青霉烷酸重復(fù)反應(yīng)15批次，平均青霉素g鉀鹽殘留效價(jià)分別為2737、2652和2807u/ml，證明所得固定化酶的催化性能良好。對(duì)比例3本對(duì)比例用于說(shuō)明當(dāng)采用本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)分離純化與固定化青霉素?；敢约肮潭ɑ钢苽?-氨基青霉烷酸的情況。使用制備例所得的青霉素酰化酶粗酶液ii，按如下步驟分離純化與固定化青霉素酰化酶：(1)青霉素?；复置敢篿i中緩慢加入36-40％硫酸銨，邊加鹽邊攪拌，加鹽結(jié)束后再攪拌30min，然后加少量硅藻土板框過(guò)濾，收集沉淀；(2)用跟粗酶液ii體積接近的0.05mol/lph8.0磷酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后加少量硅藻土板框過(guò)濾，收集濾液；(3)濾液用中空纖維素膜加純化水反復(fù)沖洗，去除色素、無(wú)機(jī)鹽和小分子蛋白，使電導(dǎo)小于1000μs/ml，最后將酶液濃縮至青霉素酰化酶的酶活為150-250iu/ml，收集濃縮液；(4)加0.4-0.45％的苯甲酸，調(diào)ph6.5-6.7，升溫到50-52℃，維持10-15min，然后快速降溫到30℃以下，加少量硅藻土，板框過(guò)濾，收集濾液；(5)酶的固定化和后處理：與實(shí)施例1的固定化和后處理的操作方式相同，得到固定化酶。測(cè)試?yán)龑?shí)施例3和對(duì)比例3所得的固定化酶產(chǎn)品分別用于制備6-氨基青霉烷酸，重復(fù)反應(yīng)15批次，將結(jié)果取平均值，如表11所示。表11編號(hào)實(shí)施例3對(duì)比例3發(fā)酵液預(yù)處理收率(％)7171酶的分離純化收率(％)9570酶提取總收率(％)6750固定化酶活(iu/g)353305固定化酶水含量(％)5555反應(yīng)時(shí)間(min)3539青霉素g鉀鹽殘留效價(jià)(u/ml)28053025從表11可以看出，本發(fā)明的方法與對(duì)比例的方法相比，酶的分離純化的收率有顯著的增加，從而酶提取總收率有顯著增加。并且本發(fā)明所得的固定化酶的酶活明顯高于對(duì)比例，從而使合成阿莫西林的反應(yīng)時(shí)間比對(duì)比例有所縮短。此外，本發(fā)明的青霉素g鉀鹽殘留效價(jià)比對(duì)比例明顯較少，這說(shuō)明本發(fā)明所得的固定化酶比對(duì)比例催化性能更好。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于此。在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，包括各個(gè)技術(shù)特征以任何其它的合適方式進(jìn)行組合，這些簡(jiǎn)單變型和組合同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12