本發(fā)明涉及真菌領(lǐng)域，特別涉及一株松色二胞菌以及生物菌降解劑及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
城市垃圾衛(wèi)生填埋是目前我國(guó)城市垃圾集中處置的主要方式，垃圾填埋場(chǎng)在使用期直至報(bào)廢以后都會(huì)產(chǎn)生大量的滲濾液。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，垃圾滲濾液產(chǎn)量越來(lái)越大，氨氮含量越來(lái)越高，已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注的環(huán)境問(wèn)題之一。氨氮含量是污水水質(zhì)的一項(xiàng)重要指標(biāo)，是水相環(huán)境中氮的主要形態(tài)，也是造成水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要因素之一，高濃度的氨氮會(huì)使水中溶解氧下降，魚(yú)類(lèi)大量死亡，甚至?xí)?dǎo)致湖泊的干涸滅亡，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)極大的損失，因此，如何有效地降解水體中氨氮的含量又不會(huì)造成二次污染成為人們研究的熱點(diǎn)。其中利用微生物進(jìn)行氨氮的降解是眾多方法之中比較成熟的一種，這種方法利用了“硝化-反硝化”的原理，及亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌相互作用完成。
傳統(tǒng)理論認(rèn)為，硝化反應(yīng)與反硝化反應(yīng)是兩個(gè)不同的生物反應(yīng)過(guò)程，硝化反應(yīng)是指在微生物作用下將nh4+-n氧化為no2--n(亞硝化作用)再進(jìn)一步氧化為no3--n(硝化作用)的過(guò)程，反硝化反應(yīng)是no3--n經(jīng)微生物作用還原為n2的過(guò)程，硝化作用在好氧條件下進(jìn)行，反硝化作用在厭氧下進(jìn)行。
污水處理技術(shù)一般采用物理處理法、化學(xué)處理法、生物化學(xué)或生物處理法，但自19世紀(jì)以來(lái)世界各國(guó)污水處理廠90％以上采用生物處理技術(shù)，因?yàn)槭褂梦⑸锝到馑w中過(guò)高的氨氮含量具有傳統(tǒng)方法所不可比擬的優(yōu)越性，其處理效率更高，并且不會(huì)產(chǎn)生二次污染，所需儀器簡(jiǎn)單易操作，該項(xiàng)技術(shù)有著非常大的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于培養(yǎng)一種能夠降解高氨氮的松色二胞菌，這種松色二胞菌可以降解高達(dá)1200mg/l濃度的氨氮，同時(shí)使氨氮降解效率達(dá)到90％以上。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，發(fā)明人經(jīng)過(guò)篩選，選育出一株真菌。經(jīng)過(guò)對(duì)比，該真菌的發(fā)育樹(shù)，與已登記松色二胞菌(diplodiapinea)的序列同源性最高，達(dá)到100％，因而可以確定其為一株松色二胞菌，命名為松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1，目前已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc)。保藏單位地址為中國(guó)·北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為cgmccno.13727，保藏日期為2017年3月7日。該松色二胞菌為可降解污水和滲濾液中氨氮以及臭氣中氨氣的菌劑，能有效降解濃度為0～1200mg/l的氨氮，并且能在好氧條件下同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化反應(yīng)降解氨氮。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種生物菌降解劑，其包含松色二胞菌bn-h1。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種生物菌降解劑的制備方法，包括以下步驟：
(1)將松色二胞菌bn-h1單菌落接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，制成生物菌降解劑母液。
(2)將母液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，制成生物菌降解劑。
其中，種子培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，檸檬酸鈉8.17g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02～57.06g/l，檸檬酸鈉8.17～24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～14.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
其中，步驟(1)包括：培養(yǎng)溫度為25～35℃，培養(yǎng)基的初始ph值為6.5～8.5，轉(zhuǎn)速為150～200rpm，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)。
步驟(2)包括：發(fā)酵溫度25℃～35℃，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始ph值為6.5～8.5，轉(zhuǎn)速150～200轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)36～60小時(shí)。
其中，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的c/n比均為9～11:1，在此比例下可達(dá)到高效率降解。
其中，硫酸銨為培養(yǎng)基的唯一氮源，紅糖和檸檬酸鈉均為培養(yǎng)基的碳源，紅糖和檸檬酸鈉的添加比例為3～5:1時(shí)，氨氮降解效果最佳。紅糖和檸檬酸鈉的結(jié)合在提供碳源的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基的酸堿度還起一個(gè)調(diào)節(jié)作用，使得富集培養(yǎng)基、分離培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的ph值均為7.0～8.0。
其中，制備方法還包括位于步驟(1)之前的松色二胞菌bn-h1的分離純化步驟，步驟中：
富集培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02～29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～6g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
分離培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02～29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～6g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，瓊脂20g/l，其余為水。
其中，微量元素的組成為：edta·2na5～57.1g/l，znso4·7h2o3.9g/l，cacl2·2h2o7g，mncl2·4h2o5.1g/l，feso4·7h2o5g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.1g/l，cuso4·5h2o1.6g/l，cocl2·6h2o1.6g/l，其余為水。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供松色二胞菌bn-h1或生物菌降解劑在治理污水、滲濾液和臭氣污染中的應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果在于：
松色二胞菌bn-h1在降解氨氮的過(guò)程中，沒(méi)有亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮積累，可以同步進(jìn)行硝化與反硝化，氨氮的降解速率高，最高達(dá)到90％以上。
附圖說(shuō)明
通過(guò)閱讀下文優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述，各種其他的優(yōu)點(diǎn)和益處對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優(yōu)選實(shí)施方式的目的，而并不認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。而且在整個(gè)附圖中，用相同的參考符號(hào)表示相同的部件。在附圖中：
圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的一株松色二胞菌bn-h1的培養(yǎng)形態(tài)特征圖片；
圖2示出了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方式的一株松色二胞菌bn-h1的發(fā)育樹(shù)圖片。
具體實(shí)施方式
下面將參照附圖更詳細(xì)地描述本公開(kāi)的示例性實(shí)施方式。雖然附圖中顯示了本公開(kāi)的示例性實(shí)施方式，然而應(yīng)當(dāng)理解，可以以各種形式實(shí)現(xiàn)本公開(kāi)而不應(yīng)被這里闡述的實(shí)施方式所限制。相反，提供這些實(shí)施方式是為了能夠更透徹地理解本公開(kāi)，并且能夠?qū)⒈竟_(kāi)的范圍完整的傳達(dá)給本領(lǐng)域的技術(shù)人員。
本發(fā)明經(jīng)篩選得到一株降解污水及滲濾液中高濃度氨氮以及臭氣中高含量氨氣的松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1，其氨氮降解能力達(dá)到90％以上，該菌株以及包含該菌株的生物菌降解劑對(duì)受污染的高氨氮含量的污水和滲濾液和臭氣的治理能力較好，能有效解決污水和滲濾液的惡臭以及臭氣污染，為環(huán)境治理做出貢獻(xiàn)。
本發(fā)明的松色二胞菌bn-h1菌株具有以下主要特征：
一、松色二胞菌bn-h1菌株的培養(yǎng)形態(tài)特征
如圖1所示，該松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1具有下述形態(tài)特征：乳白色偏黃，在平板上生長(zhǎng)速度較快，凸起生長(zhǎng)，邊緣整齊，菌體濕潤(rùn)光滑，正反顏色相同，較易挑出，在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)基混濁。
二、松色二胞菌bn-h1的發(fā)育樹(shù)
用mega5.0做其發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)bn-h1的基因序列與已登記松色二胞菌(diplodiapinea)的序列同源性可達(dá)100％，因此確定其為松色二胞菌，具體如圖2所示。
三、松色二胞菌bn-h1的its序列
挑取純化的bn-h1單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為30℃、搖床180轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，然后以其菌液為模版做pcr擴(kuò)增菌株的its序列，進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)。bn-h1的its序列具體見(jiàn)seqidno:1。
本發(fā)明還涉及含有松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1的生物菌降解劑的制備方法，具體包括松色二胞菌菌株(diplodiapinea)bn-h1的分離純化過(guò)程和培養(yǎng)發(fā)酵過(guò)程，其中分離純化過(guò)程方案如下：
取垃圾滲濾液10ml，接種于裝有100ml滅菌后的富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，充分搖勻，在溫度28℃、轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)，富集7天，每隔1天補(bǔ)充(nh4)2so4，以淘汰不能利用nh4+-n的微生物。將富集培養(yǎng)基中的菌液取1ml涂布在分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，得到一株單一菌株，命名為bn-h1。
將松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1的單菌菌落培養(yǎng)發(fā)酵制成生物菌降解劑的方案如下：
挑取純化后的bn-h1單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，控制溫度25～35℃，調(diào)節(jié)ph6.5～8.5，轉(zhuǎn)速150～200rpm，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)，制備成生物菌降解劑母液，將母液按照1％的比例加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度25～30℃，ph6.5～8.5，轉(zhuǎn)速150～200rpm，發(fā)酵時(shí)間36～60小時(shí)，制備成生物菌降解劑。
下面將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1(或含有松色二胞菌的生物降解劑)及其降解功能做進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1
松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1的分離純化方案1：
(1)取北京市南宮垃圾堆肥場(chǎng)垃圾滲濾液10ml，接種于裝有100ml滅菌后的富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，充分搖勻，在溫度28℃、轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)，富集7天，每隔1天補(bǔ)充(nh4)2so4，以淘汰不能利用nh4+-n的微生物。
(2)將富集培養(yǎng)基中的菌液取1ml涂布在分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，得到松色二胞菌(diplodiapinea)bn-h1的單菌菌落。
其中，富集培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
分離培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，瓊脂20g/l，其余為水。
降解功能檢測(cè)：
將北京市南宮生物除臭塔的大塔取回的樣品進(jìn)行氨氮指標(biāo)測(cè)定：大塔臭氣洗滌液氨氮含量為1184mg/l，ph值6.47，出氣口處氨氣含量為8.34mg/m3；將得到的bn-h1菌種與塔中臭氣洗滌液按1％的比例加入南宮大塔，32℃曝氣環(huán)境下培養(yǎng)10d，大塔臭氣洗滌液中的氨氮降解到133.23mg/l，ph值7.16，出氣口處氨氣含量為1.76mg/m3。
實(shí)施例2
生物降解劑1的培養(yǎng)方案：
(1)取北京南宮垃圾堆肥場(chǎng)垃圾滲濾液10ml，接種于裝有100ml滅菌后的富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，充分搖勻，在溫度28℃、轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)，富集7天，每隔1天補(bǔ)充(nh4)2so4，以淘汰不能利用nh4+-n的微生物。
(2)將富集培養(yǎng)基中的菌液取1ml涂布在分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，得到bn-h1的單菌菌落。
(3)挑取純化后的bn-h1單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，控制溫度25℃，調(diào)節(jié)ph6.5，轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)，制備成生物菌降解劑母液。
(4)將母液按照1％的比例加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度35℃，ph6.5，轉(zhuǎn)速200rpm，發(fā)酵時(shí)間60小時(shí)，制備成生物菌降解劑。
富集培養(yǎng)基的組成為：紅糖29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so46g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
分離培養(yǎng)基的組成為：紅糖29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so46g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，瓊脂20g/l，其余為水。
種子培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，檸檬酸鈉8.17g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，檸檬酸鈉8.17g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
降解功能檢測(cè)：
將北京市南宮生物除臭塔的小塔取回的樣品進(jìn)行氨氮指標(biāo)測(cè)定：小塔臭氣洗滌液氨氮含量為1471mg/l，ph值6.38，出氣口處氨氣含量為9.13mg/m3；將生物菌降解劑1以含有的bn-h1與塔中臭氣洗滌液的比例為1％的量加入南宮小塔，32℃曝氣環(huán)境下培養(yǎng)10d，小塔臭氣洗滌液氨氮降解效率達(dá)到90％以上，ph值7.23，出氣口處氨氣含量為2.25mg/m3。
實(shí)施例3
生物降解劑2的培養(yǎng)方案：
(1)取北京市阿蘇衛(wèi)垃圾堆肥場(chǎng)垃圾滲濾液10ml，接種于裝有100ml滅菌后的富集培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，充分搖勻，在溫度28℃、轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)，富集7天，每隔1天補(bǔ)充(nh4)2so4，以淘汰不能利用nh4+-n的微生物。
(2)將富集培養(yǎng)基中的菌液取1ml涂布在分離培養(yǎng)基平板上，于28℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行重復(fù)分離純化，得到bn-h1的單菌菌落。
(3)挑取純化后的bn-h1單菌落接種到種子培養(yǎng)基中，控制溫度35℃，調(diào)節(jié)ph6.5，轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵時(shí)間72小時(shí)，制備成生物菌降解劑母液。
(4)將母液按照1％的比例加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，控制溫度25℃，ph8.5，轉(zhuǎn)速150rpm，發(fā)酵時(shí)間36小時(shí)，制備成生物菌降解劑。
富集培養(yǎng)基的組成為：紅糖29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so46g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
分離培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so46g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，瓊脂20g/l，其余為水。
種子培養(yǎng)基的組成為：紅糖19.02g/l，檸檬酸鈉8.17g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：紅糖57.06g/l，檸檬酸鈉24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so414.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余為水。
降解功能檢測(cè)：
對(duì)北京市阿蘇衛(wèi)垃圾堆肥場(chǎng)生物除臭塔臭氣洗滌液取回的水樣以及生物除臭塔采集的進(jìn)氣口和出氣口處氨氣進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定：臭氣洗滌液氨氮含量為1500mg/l，ph值7.45，生物除臭塔的進(jìn)氣口處氨氣含量為23.27mg/m3，出氣口處氨氣含量為13.66mg/m3；將生物菌降解劑2以含有的bn-h1與塔中污水的比例為1％的量加入阿蘇衛(wèi)除臭塔臭氣洗滌液中，30℃曝氣環(huán)境下培養(yǎng)10d，氨氮降解到129mg/l，降解效率達(dá)到90％以上，ph值7.26，進(jìn)氣口處氨氣含量為21.28mg/m3，但出氣口處氨氣含量為1.21mg/m3。
結(jié)合上述實(shí)施例以及松色二胞菌bn-h1本身的特點(diǎn)，本發(fā)明的松色二胞菌bn-h1，其優(yōu)勢(shì)在于可降解高濃度氨氮，有效緩解因氨態(tài)氮引起的污水惡臭及臭氣的污染，生產(chǎn)上治理時(shí)間較短，應(yīng)用效果明顯。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
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<110>北京環(huán)氧環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司/北京農(nóng)學(xué)院
<120>一株松色二胞菌bn-h1以及生物菌降解劑及其制備方法和應(yīng)用
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<213>松色二胞菌（diplodiapinea）
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