(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種新的大腸桿菌胞外多糖的生產(chǎn)及其調(diào)控分泌機(jī)制研究。產(chǎn)大腸桿菌胞外多糖rb突變菌株的的發(fā)現(xiàn)，多糖rb的單糖組成分析，多糖rb的調(diào)控分泌機(jī)制，及多糖rb對(duì)人體腸道菌群的調(diào)控應(yīng)用等。

(二)

背景技術(shù)：

腸道菌群已漸漸被形容為一個(gè)“萬能的功能器官”，通過腸肝軸和腸腦軸等與身體的其它器官發(fā)生相互作用，從而影響人體的健康狀況。已有很多疾病，包括肥胖、糖尿病、肝硬化、心血管類疾病和神經(jīng)類疾病等都報(bào)道與腸道菌群的變化相關(guān)。臨床上很多具有調(diào)控腸道菌群的植物源性多糖和寡糖已成為暢銷產(chǎn)品。

微生物胞外多糖具有植物多糖不具備的優(yōu)良性質(zhì)，它們安全無毒、理化性質(zhì)獨(dú)特、生產(chǎn)周期短、易與菌體分離、其生產(chǎn)不受季節(jié)、地域和病蟲害條件限制，具有較強(qiáng)的市場競爭力和廣闊的發(fā)展前景。許多微生物多糖已作為膠凝劑、成膜劑、保鮮劑、乳化劑等，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、石油、化工等多個(gè)領(lǐng)域。一些細(xì)菌胞外多糖如黃原膠、透明質(zhì)酸和右旋糖苷等細(xì)菌胞外多糖也已經(jīng)商業(yè)化用于食品和醫(yī)藥保健品領(lǐng)域。然而不同細(xì)菌來源的胞外多糖由于其單糖組成和糖鏈排布結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致其生理功能不同。而且不同細(xì)菌由于生長條件、多糖產(chǎn)量和多糖純化難易等條件的限制影響了其大規(guī)模生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用。大腸桿菌是一種非常常規(guī)的模式菌株，其生長條件要求不高，遺傳操作系統(tǒng)成熟，是理想的工程菌之一。然后到目前為止報(bào)道的大腸桿菌胞外多糖還主要為可拉酸，由于其生理功能研究還并不清楚，也未見大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)與應(yīng)用。因此，生產(chǎn)制備新的大腸桿菌胞外多糖并研究其生理功能，將為大腸桿菌胞外多糖的商業(yè)開發(fā)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種重組質(zhì)粒rbatcc3、工程菌及其產(chǎn)生的一種新的大腸桿菌胞外多糖。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒rbatcc3，所述重組質(zhì)粒rbatcc3是海洋轉(zhuǎn)座子himinimarrb部分序列與大腸桿菌基因組上的4個(gè)基因ycjd、fabi、yciw和rnb重組而成，核苷酸序列為seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供一種由所述重組質(zhì)粒rbatcc3構(gòu)建的重組基因工程菌，優(yōu)選所述的重組基因工程菌是以大腸桿菌為宿主菌獲得的。

本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒rbatcc3在制備胞外多糖中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：將含重組質(zhì)粒rbatcc3的基因工程菌(優(yōu)選重組大腸桿菌e.coliec100)接種至pia平板上，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，獲得含胞外多糖的培養(yǎng)物，將培養(yǎng)物分離純化，獲得胞外多糖；所述pia平板終濃度組成為：蛋白胨20g/l，氯化鎂1.4g/l，硫酸鉀10g/l，三氯生25mg/l，瓊脂粉13.6g/l，甘油20ml/l，溶劑為水，ph值自然。

進(jìn)一步，所述含重組質(zhì)粒rbatcc3的重組大腸桿菌在接種前先進(jìn)行種子培養(yǎng)，再將種子液接種至pia平板；所述種子培養(yǎng)為：將含重組質(zhì)粒rbatcc3的基因工程菌(優(yōu)選重組大腸桿菌e.coliec100)接種至種子培養(yǎng)基，在37℃搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，溶劑為水，ph值自然。

進(jìn)一步，所述培養(yǎng)物分離純化方法為：用刮板輕輕的將pia平板上的菌和多糖混合物刮下來，溶解在1×pbs緩沖液中，將溶解物分裝在50ml的離心管中，振蕩混勻后放入離心機(jī)，8000r/min離心3分鐘，取上清，將上清以體積比1:3的比例和無水乙醇混合，攪拌均勻后8000r/min離心3分鐘，析出的沉淀即為胞外多糖。

本發(fā)明所述重組質(zhì)粒rb是在海洋轉(zhuǎn)座子himinimarrb文庫篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)的一株含有重組質(zhì)粒rb的突變菌株。提取突變菌株基因組dna，通過使用細(xì)菌全基因組掃描測序發(fā)現(xiàn)大腸桿菌基因組上的4個(gè)基因ycjd、fabi、yciw和rnb與海洋轉(zhuǎn)座子himinimarrb質(zhì)粒上的部分序列重組形成的新質(zhì)?？赡苁且鸢舛嗵欠置诘脑?。重組質(zhì)粒終止突變和轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明新的重組質(zhì)粒與胞外多糖的分泌相關(guān)。使用pia平板培養(yǎng)和乙醇沉淀的方法制備生產(chǎn)胞外多糖。使用離子液相色譜對(duì)胞外多糖進(jìn)行單糖組成成分分析，結(jié)果表明胞外多糖主要由巖藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、阿拉伯糖、核糖和木糖組成。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明利用含重組質(zhì)粒rbatcc3的重組基因工程菌生產(chǎn)的胞外多糖從單糖組成成分上來看是一種新的細(xì)菌胞外多糖。大腸桿菌基因組上的4個(gè)基因ycjd、fabi、yciw和rnb調(diào)控細(xì)菌胞外多糖的分泌是一種新的發(fā)現(xiàn)，是對(duì)這4個(gè)基因功能新的注解。

(四)附圖說明

圖1是重組質(zhì)粒rbatcc3示意圖，及工程菌rbatcc3-ec100在pia平板上生產(chǎn)的胞外多糖形態(tài)圖；a為ycjd、fabl、yciw和rnb基因在大腸桿菌基因組上的相對(duì)位置示意圖；b為himinimarrb質(zhì)粒示意圖；c為重組質(zhì)粒rbatcc3示意圖；d為工程菌rbatcc3-ec100在pia平板上生產(chǎn)的胞外多糖形態(tài)圖。

圖2胞外多糖產(chǎn)量檢測圖，ec100lb表示原始菌株ec100在lb平板上的多糖產(chǎn)量，rbatcc3ec100lb表示突變菌株rbatcc3-ec100在lb平板上的多糖產(chǎn)量，rbatcc3ec100pia表示突變菌株rbatcc3-ec100在pia平板上的多糖產(chǎn)量。

圖3是胞外多糖單糖組成成分離子液相分析色譜圖。standard20表示不同標(biāo)準(zhǔn)品在相應(yīng)時(shí)間出現(xiàn)的色譜峰，rb600表示胞外多糖在相應(yīng)時(shí)間出現(xiàn)的色譜峰。1號(hào)峰代表l-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品；2號(hào)峰代表l-鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品；3號(hào)峰代表l-阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品；4號(hào)峰代表d-半乳糖/n-乙酰氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；5號(hào)峰代表d-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品；6號(hào)峰代表d-甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品；7號(hào)峰代表d-木糖標(biāo)準(zhǔn)品；8號(hào)峰代表d-果糖標(biāo)準(zhǔn)品；9號(hào)峰代表d-核糖標(biāo)準(zhǔn)品；10號(hào)峰代表d-葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品。

圖4是不同個(gè)體對(duì)胞外多糖的降解情況；r代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖不接種志愿者糞便細(xì)菌；h1、h2、h3、h4、h5和h6代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖且接種不同志愿者糞便細(xì)菌。

圖5是16srrna基因v3-v4區(qū)高通量測序檢測不同碳水化合物對(duì)腸道菌群的影響。cxx、lw、xhs、bsf、wqq、lj分別代表6名志愿者的原始糞便樣品；vi代表vi培養(yǎng)基；vis代表vi培養(yǎng)基添加8g/l淀粉；vir代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖。

圖6使用pcoa方法分析16srrna基因v3-v4區(qū)高通量測序結(jié)果。cxx、lw、xhs、bsf、wqq、lj分別代表6名志愿者的原始糞便樣品；vi代表vi培養(yǎng)基；vis代表vi培養(yǎng)基添加8g/l淀粉；vir代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖。

圖7使用lefse方法分析16srrna基因v3-v4區(qū)高通量測序結(jié)果。cxx、lw、xhs、bsf、wqq、lj分別代表6名志愿者的原始糞便樣品；vi代表vi培養(yǎng)基；vis代表vi培養(yǎng)基添加8g/l淀粉；vir代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖。

圖8是氣相色譜法檢測不同碳水化合物對(duì)短鏈脂肪酸產(chǎn)生的影響；a-f分別為乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異戊酸和異丁酸測定用標(biāo)準(zhǔn)曲線；g-j分別為乙酸、丙酸、丁酸和總短鏈脂肪酸測定結(jié)果；vi代表vi培養(yǎng)基；vis代表vi培養(yǎng)基添加8g/l淀粉；vir代表vi培養(yǎng)基添加8g/l胞外多糖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：產(chǎn)胞外多糖突變菌株的篩選和鑒定

1、轉(zhuǎn)座子文庫構(gòu)建與篩選

(1)e.colidh5α(prk2013)(購自北京樂博生物)，培養(yǎng)液制備方法為：取-80℃冰箱保存的e.colidh5α(prk2013)菌液，待室溫微溶后用移液槍將50μl菌液接種到含有5mllb培養(yǎng)基的試管中，同時(shí)加入5μl20mg/ml的卡那霉素水溶液，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，獲得e.colidh5α(prk2013)培養(yǎng)液。

e.coliec100(himinimarrb)(e.coliec100購自北京樂博生物，轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒himinimarrb由中科院水生所邱東茹研究員饋贈(zèng))，培養(yǎng)液制備方法為：取-80℃冰箱保存的e.coliec100(himinimarrb)菌液，待室溫微溶后用移液槍將50μl菌液接種到含有5mllb培養(yǎng)基的試管中，同時(shí)加入5μl20mg/ml的卡那霉素水溶液，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，獲得e.coliec100(himinimarrb)培養(yǎng)液。

銅綠假單胞菌pao1(購自u(píng)niversityofwashingtongenomecenter)，培養(yǎng)液制備方法為：取-80℃冰箱保存的pao1菌液，待室溫微溶后用移液槍將50μl菌液接種到含有5mllb培養(yǎng)基的試管中，37℃搖床200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，獲得銅綠假單胞菌pao1培養(yǎng)液。

lb液體培養(yǎng)基終濃度組成：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化鈉10g/l，溶劑為水，ph值自然。lb平板為向lb液體培養(yǎng)基添加1.2g/l瓊脂。

在無菌操作臺(tái)中向1.5ml離心管中加入400μle.colidh5α(prk2013)培養(yǎng)液、400μle.coliec100(himinimarrb)培養(yǎng)液、400μl銅綠假單胞菌pao1培養(yǎng)液。

(2)8000rpm離心3分鐘后，棄上清，加入100μllb培養(yǎng)液，混勻后將菌懸液點(diǎn)到lb平板上，無菌操作臺(tái)內(nèi)待液體風(fēng)干后，將平板放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6-8小時(shí)。

(3)將lb平板上的菌刮取到含1mllb液體培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，混勻后，分別取10μl、100μl、200μl涂布到含kan(卡那霉素終濃度200μg/ml)pia平板上。pia平板終濃度組成為：蛋白胨20g/l，氯化鎂1.4g/l，硫酸鉀10g/l，三氯生25mg/l，瓊脂粉13.6g/l，甘油20ml/l，溶劑為水，ph值自然。

(4)pia平板在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜后，根據(jù)菌落形態(tài)觀察生產(chǎn)胞外多糖的突變菌株。

(5)將產(chǎn)胞外多糖突變菌株在pia平板上劃線純化三代，獲得純化后的產(chǎn)胞外多糖突變菌株。

2、產(chǎn)胞外多糖突變菌株的全基因組掃描分析

(1)將純化后的產(chǎn)胞外多糖突變菌株挑選到含5mllb液體培養(yǎng)基的試管中，加入終濃度20μg/ml卡那霉素。

(2)37℃搖床200rpm培養(yǎng)過夜后收集菌液用于細(xì)菌基因組dna抽提。

(3)使用omega細(xì)菌基因組dna提取試劑盒抽提細(xì)菌基因組dna。

(4)將提取得到的基因組dna送測序公司進(jìn)行細(xì)菌全基因組掃描測序。

細(xì)菌全基因組掃描結(jié)果顯示，該突變菌為大腸桿菌，且大腸桿菌基因組上的4個(gè)基因ycjd、fabi、yciw和rnb與海洋轉(zhuǎn)座子himinimarrb質(zhì)?？赡苤亟M形成了一個(gè)新的質(zhì)粒(圖1)。新質(zhì)粒的形成可能與胞外多糖的分泌有關(guān)。

3、胞外多糖分泌機(jī)制研究

(1)將純化后的產(chǎn)胞外多糖突變菌株挑選到含5mllb液體培養(yǎng)基的試管中，加入終濃度20μg/ml卡那霉素。

(2)37℃搖床200rpm培養(yǎng)過夜后收集菌液用于細(xì)菌質(zhì)粒dna提取。

(3)使用omega細(xì)菌質(zhì)粒dna提取試劑盒抽提細(xì)菌質(zhì)粒dna，獲得重組質(zhì)粒rbatcc3，核苷酸序列為seqidno.1所示。

(4)使用點(diǎn)突變?cè)噭┖?購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)對(duì)重組質(zhì)粒rbatcc3上的ycjd、fabi、yciw和rnb分別進(jìn)行終止突變，分別獲得終止突變后的質(zhì)粒rbatcc3-mycjd、rbatcc3-mfabi、rbatcc3-myciw和rbatcc3-mrnb。

(5)將重組質(zhì)粒rbatcc3dna和終止突變后的質(zhì)粒(rbatcc3-mycjd、rbatcc3-mfabi、rbatcc3-myciw和rbatcc3-mrnb)dna分別使用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到epicentre的大腸桿菌ec100感受態(tài)細(xì)胞，分別獲得重組大腸桿菌rbatcc3-ec100、重組大腸桿菌rbatcc3-mycjd-ec100、重組大腸桿菌rbatcc3-mfabi-ec100、重組大腸桿菌rbatcc3-myciw-ec100和重組大腸桿菌rbatcc3-mrnb-ec100。

(6)分別將含表1中所述質(zhì)粒的重組大腸桿菌涂布到lb+kan(終濃度20μg/ml)平板和pia平板，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，觀察胞外多糖分泌情況。

表1含不同質(zhì)粒ec100菌株在lb平板和pia平板上的菌落形態(tài)

^*himinimarrb為原始海洋轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒，rbatcc3為轉(zhuǎn)座子文庫篩選時(shí)獲得的重組質(zhì)粒，rbatcc3-mycjd、rbatcc3-mfabi、rbatcc3-myciw和rbatcc3-mrnb分別為重組質(zhì)粒突變終止掉ycjd、fabi、yciw和rnb表達(dá)的突變質(zhì)粒。nm表示培養(yǎng)24小時(shí)后平板上沒有觀察到胞外多糖的分泌，m表示培養(yǎng)24小時(shí)后平板上可以明顯觀察到胞外多糖的分泌，ng表示培養(yǎng)24小時(shí)后平板上沒有觀察到細(xì)菌菌落的生長。

由表1可以看出，含原始質(zhì)粒himinimarrb的重組大腸桿菌菌株不能在pia平板上生長，在lb平板上雖然能生長但并沒有觀察到胞外多糖的分泌。含重組質(zhì)粒rbatcc3的重組大腸桿菌菌株不僅能在pia平板上生長，而且在lb平板和pia平板上均能觀察到胞外多糖的分泌。然而將重組質(zhì)粒上的任何一個(gè)大腸桿菌來源的基因ycjd、fabi、yciw和rnb終止突變后，含有這些突變質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株均不能在pia平板上生，且在lb平板上觀察不到胞外多糖的分泌。由些可知，胞外多糖的分泌確實(shí)是由這個(gè)重組質(zhì)粒rbatcc3引起的，而且重組質(zhì)粒上的4個(gè)大腸桿菌基因?qū)Π舛嗵堑姆置诙际潜匦璧摹?/p>

4、胞外多糖產(chǎn)量的測定

(1)溶液的配制

pbs緩沖液：使用無菌水將生工購買的20×pbs稀釋成1×pbs緩沖液；

0.1％carbazole(咔唑)：將0.1克咔唑溶解到100ml無水乙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用)；硼酸鹽存儲(chǔ)液：將10.099gkoh溶解在45ml水中，然后加入24.74g硼酸，最后用水定容到100ml；硫酸化硼酸：向2l玻璃瓶中緩慢加入1000ml質(zhì)量濃度98％濃硫酸，然后一滴一滴加入25ml硼酸鹽存儲(chǔ)液，邊加邊用玻璃吸管進(jìn)行緩慢攪拌。

(2)樣品吸光值測定

a、od600值：分別從步驟(6)培養(yǎng)24小時(shí)后的pia平板和lb+kan(終濃度20μg/ml)平板上將細(xì)菌和多糖刮取到15ml離心管中，用1×pbs將od600稀釋到0.5左右，并記錄具體od600值。

b、od530值：將15ml試管插入冰中，然后每管中依次加入6ml硫酸化硼酸、700μl步驟a獲得的稀釋液、200μl0.1％咔唑。55℃水浴30min，室溫靜置5min。分光光度計(jì)測度530nm處吸光值。

c、計(jì)算od530/od600值，推測待測樣品中多糖濃度。

如圖2所示，含重組質(zhì)粒rbatt3的重組大腸桿菌菌株比含原始質(zhì)粒himinimarrb質(zhì)粒的重組大腸桿菌菌株產(chǎn)糖量更高。且pia平板可能比lb平板更適合于含重組質(zhì)粒rbatt3ec100菌株胞外多糖的分泌，因?yàn)槠湓趐ia平板上的多糖產(chǎn)量明顯高于其在lb平板上的產(chǎn)量。

實(shí)施例2：大腸桿菌胞外多糖的生產(chǎn)

1、配制培養(yǎng)基

在燒杯中配制用于生產(chǎn)胞外多糖的pia培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為：1l去離子水中加入bd公司的pia培養(yǎng)基粉末45g(組成為：蛋白胨20g/l，氯化鎂1.4g/l，硫酸鉀10g/l，三氯生25mg/l，瓊脂粉13.6g/l)和甘油20ml，在磁力攪拌器上將其充分溶解后分裝到錐形瓶。121℃高壓滅菌20min后取出，冷卻至60℃，在超凈工作臺(tái)中向培養(yǎng)基中加入終濃度200μg/ml慶大霉素，混勻后倒入一次性無菌培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后備用。

2、接種

將實(shí)施例1獲得的重組大腸桿菌rbatcc3-ec100接種至種子培養(yǎng)基，在37℃搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化鈉10g/l，溶劑為水，ph值自然。

用接種棒蘸取種子液，在pia平板上劃線兩次，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。

3、胞外多糖的提取和保存

用刮板輕輕的將pia平板上的菌和多糖混合物刮下來，溶解在1×pbs緩沖液中，將溶解物分裝在50ml的離心管中，振蕩混勻后放入離心機(jī)，8000r/min離心3分鐘，取上清，將上清以體積比1:3的比例和無水乙醇混合，褐藻膠被析出。攪拌均勻后8000r/min離心3分鐘，析出的沉淀即為胞外多糖。將離心管用封口膜封口，做透氣處理，放入冷凍干燥機(jī)中，-30℃冷凍干燥24小時(shí)，獲得胞外多糖粉末50mg。之后取出放置在4℃冰箱中保存。

4、胞外多糖的組成分析

往10mg冷凍干燥后的胞外多糖粉末樣品中加入1ml3mol/l的三氟乙酸(tfa)水溶液。95℃水浴鍋加熱溶解6小時(shí)后，將樣品放入離心冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。待tfa揮發(fā)完后，用1ml甲醇對(duì)降解后的樣品進(jìn)行重懸洗滌，然后放入離心冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥。待甲醇揮發(fā)完全后，加入10ml水溶解多糖降解產(chǎn)物。經(jīng)0.22μm濾膜過濾后用離子液相色譜(ics5000)對(duì)胞外多糖的組成進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3所示，與單糖標(biāo)準(zhǔn)品(l-巖藻糖、l-鼠李糖、l-阿拉伯糖、d-半乳糖/n-乙酰氨基葡萄糖、d-葡萄糖、d-甘露糖、d-木糖、d-果糖、d-核糖、d-葡萄糖醛酸)相對(duì)照，大腸桿菌胞外多糖主要由巖藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、阿拉伯糖、核糖和木糖組成。

實(shí)施例3：胞外多糖與人體腸道菌群相互作用研究

1、培養(yǎng)基的配制

試驗(yàn)中一共用到的三種培養(yǎng)基，分別為vi培養(yǎng)基，vi加淀粉培養(yǎng)基，vi加胞外多糖培養(yǎng)基。

(1)配制vi培養(yǎng)基(不加碳源組)：1.44g蛋白胨，2.16g酵母提取物，0.2g3號(hào)膽鹽(bilesalt#3)，0.4gl-半胱氨酸鹽酸鹽，4.8ml血紅素(5mg/ml)，480μl吐溫80，2.16gnacl，1.2gkcl，2.16gmgcl2·6h2o，0.04gcacl2，0.2gkh2po4，96μl微量元素，溶劑為去離子水，ph值自然。微量元素配方(g/l)如下：mgso4·7h2o3.0，cacl2·2h2o0.1，mncl2·4h2o0.32，feso4·7h2o0.1，coso4·7h2o0.18，znso4·7h2o0.18，cuso4·5h2o0.01，nicl2·6h2o0.092，借助磁力攪拌器使之均勻溶于480ml去離子水中。

(2)配制vi加淀粉培養(yǎng)基(淀粉組)：用量筒量取120ml步驟(1)配制好的vi培養(yǎng)基，加入淀粉0.96克(終濃度8g/l)，借助磁力攪拌器使之均勻溶解。

(3)配制vi加胞外多糖培養(yǎng)基(胞外多糖組)：用量筒量取120ml步驟(1)配制好的vi培養(yǎng)基，加入實(shí)施例2步驟3獲得的胞外多糖rb0.96克(終濃度8g/l)，借助磁力攪拌器使之均勻溶解。

將充分溶解的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至錐形瓶中密封，置于高壓滅菌鍋中，121℃滅菌20min，待溫度降至70℃時(shí)從高壓滅菌鍋中拿出，置入?yún)捬豕ぷ髡局?，分別將四種培養(yǎng)基分裝入試管中，每種培養(yǎng)基分裝入13個(gè)試管，每個(gè)試管內(nèi)分裝10毫升。

2、接種

本實(shí)驗(yàn)共使用6名志愿者的腸道樣品，其中志愿者cxx和lw為普雷沃氏菌腸型，志愿者wqq、lj、xhs和bsf為擬桿菌腸型。志愿者在糞便樣品提供前3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素，未出現(xiàn)腹瀉等胃腸不適癥狀。稱取收集的糞便樣品4g溶解入40毫升的1×pbs溶液中(10％)，剩余糞便樣品-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將pbs溶解后的糞菌懸液用過濾網(wǎng)過濾后置入15毫升離心管中。將過濾所得的六組糞便pbs溶液置入?yún)捬豕ぷ髡局?，每組糞便溶液分別接入vi培養(yǎng)基，vi加淀粉培養(yǎng)基和vi加胞外多糖培養(yǎng)基試管中，每10ml培養(yǎng)基接種500μl(5％)糞菌懸液，以未接菌種的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，開始計(jì)時(shí)。

3、取樣

分別在接種后24h，48h和72h各取樣2ml，8000r/min離心3分鐘后，將沉淀保存到-30℃用于細(xì)菌基因組dna提取，上清用于tlc和短鏈脂肪酸檢測。

4、tlc分析胞外多糖rb降解情況

將8000rpm離心后的發(fā)酵液上清用移液槍吸取0.2μl點(diǎn)到tlc板上，吹干，樣品靠下側(cè)放置在展開劑(甲酸、正丁醇、水以體積比為6:4:1配制混勻)中，待展開劑將tlc板全部浸潤后，取出吹干，放入染色劑(orcinol顯色劑的配制：900mg地衣酚(3，5-二羥基甲苯)溶于25ml水中，加375ml乙醇，冰浴，緩慢加入50ml濃硫酸)中全部浸潤，取出吹干，置入烘箱中100℃顯色，觀察糖的降解情況。如圖4所示，來自6名志愿者的腸道菌群在培養(yǎng)24和48小時(shí)后對(duì)胞外多糖均沒有明顯的降解，但在培養(yǎng)72小時(shí)后6名志愿者的腸道菌群均能很好的降解胞外多糖。

5、細(xì)菌dna的提取和細(xì)菌多樣性變化

將糞便樣品和厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)和72小時(shí)的發(fā)酵樣品細(xì)菌基因組dna做16srdnav3-4區(qū)測序(美吉，上海)。測序引物是338f(5-actcctacgggaggcagca-3)和806r(5-ggactachvgggtwtctaat-3)，片段大小約500bp，每個(gè)樣品pcr擴(kuò)增3個(gè)重復(fù)。將pcr產(chǎn)物用quantifluor^tm-st藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(promega)進(jìn)行檢測定量，之后按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。miseq文庫構(gòu)建和測序，統(tǒng)計(jì)收集到的熒光信號(hào)結(jié)果，獲知模板dna片段的序列。得到序列后根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接，同時(shí)對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后，進(jìn)行otu聚類分析?；趏tu聚類分析結(jié)果，可以對(duì)otu進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，以及對(duì)測序深度的檢測；基于分類學(xué)信息，可以在各個(gè)分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析。

如圖5所示，是細(xì)菌在各個(gè)樣品中的組成情況。如圖6所示，無論是在培養(yǎng)后24小時(shí)還是72小時(shí)，淀粉組與原始糞便菌群均更接近，在培養(yǎng)24小時(shí)后，胞外多糖組與不加碳源組菌群結(jié)構(gòu)還比較近，不能很好的根據(jù)是否添加胞外多糖進(jìn)行聚類。但在培養(yǎng)72個(gè)小時(shí)后，加胞外多糖組可以很好的與加淀粉組和不加碳源組分開。如圖7所示，胞外多糖組無論是在培養(yǎng)后24小時(shí)還72小時(shí)，collinsella屬、butyricimonas屬和hafnia屬的含量均高于淀粉組和不加碳源組。

7、利用氣相色譜法(gc)測定發(fā)酵液scfa

(1)儀器：gcplus2010氣相色譜儀(島津)，ffap毛細(xì)管柱0.25mm×30m×0.25μm(intercap)。

(2)方法：柱溫升溫程序，柱溫80℃1min，5℃/min，升至170℃，維持1min；fid檢測器250℃；氣化室250℃。載氣為氮?dú)?，流?0ml/min，氫氣流速40ml/min，空氣流速400ml/min。

(3)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用面積外標(biāo)法，用0.02mol/l乙酸、0.02mol/l丙酸、0.02mol/l丁酸、0.02mol/l戊酸、0.02mol/l異丁酸、0.02mol/l異戊酸(gc級(jí)，sigma)樣品，測定各組分保留時(shí)間及所配濃度下的峰面積，并繪出各組分濃度關(guān)于峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖8中a-f所示。

(4)樣品的處理：發(fā)酵24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后的樣品于4℃14,000rpm離心5min，用0.22μm的濾膜過濾，取過濾后的上清0.6ml加入0.06ml的體積濃度50％硫酸水溶液酸化，震蕩混勻，加入0.6ml的氯仿萃取，取1μl萃取液進(jìn)樣檢測。糞便樣品按0.1g/ml加入pbs溶解，14,000rpm離心5min得到上清，后步驟同上。所有待測樣品在gc上連續(xù)進(jìn)樣三次。

如圖8所示，無論是乙酸、丙酸、丁酸還是總短鏈脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸、異戊酸總量)，在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，胞外多糖組均顯著高于淀粉組和不加碳源組。

總之，本發(fā)明在轉(zhuǎn)座子文庫篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)了一株可以產(chǎn)胞外多糖的大腸桿菌突變株，全基因組掃描測序發(fā)現(xiàn)這種胞外多糖rb的分泌可能是由于大腸桿菌基因組上的4個(gè)基因ycjd、fabi、yciw和rnb與海洋轉(zhuǎn)座子himinimarrb質(zhì)粒重組形成了一個(gè)新的質(zhì)粒引起的。質(zhì)粒突變和轉(zhuǎn)化進(jìn)一步驗(yàn)證重組質(zhì)粒rbatcc3可以誘導(dǎo)大腸桿菌胞外多糖的分泌。離子液相分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌胞外多糖主要由巖藻糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖、n-乙酰氨基葡萄糖、阿拉伯糖、核糖和木糖組成，是一種新的大腸桿菌胞外多糖。同時(shí)使用厭氧工作站對(duì)胞外多糖對(duì)志愿者腸道菌群的調(diào)控作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6名志愿者腸道菌群在體外培養(yǎng)72小時(shí)后，均能降解胞外多糖，且能顯著促進(jìn)腸道細(xì)菌短鏈脂肪酸的生產(chǎn)。從現(xiàn)有結(jié)果來看，胞外多糖在體外具有富集潛在功能菌和促進(jìn)短鏈脂肪酸生產(chǎn)的能力，具有開發(fā)成功能益生元和飼料添加劑的潛能。

sequencelisting

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種重組質(zhì)粒rbatcc3、工程菌及其產(chǎn)胞外多糖的應(yīng)用

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