本發(fā)明涉及一種促進(jìn)角蛋白水中溶解的方法，以及用該角蛋白溶液制備高強(qiáng)度的角蛋白水凝膠、膜、海綿和纖維等材料的方法。

背景技術(shù)：

角蛋白是一種不溶性的纖維狀蛋白質(zhì)，是外胚層細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛存在于動(dòng)物皮膚及皮膚附屬物中，如毛發(fā)、蹄、殼、爪、角、鱗片等。近幾年的大量研究表明，角蛋白是一種生物相容性好且不被機(jī)體免疫排斥的優(yōu)質(zhì)生物醫(yī)用材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。最為突出的是，經(jīng)過(guò)對(duì)羊毛等來(lái)源的角蛋白進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其含有Arg-Gly-Asp(RGD)三肽序列。此三肽序列被公認(rèn)為是細(xì)胞外基質(zhì)中實(shí)現(xiàn)細(xì)胞結(jié)合的有效結(jié)合位點(diǎn)，有促進(jìn)細(xì)胞吸附的功能。因此，國(guó)內(nèi)外已開(kāi)展大量關(guān)于角蛋白基生物材料的基礎(chǔ)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，并在創(chuàng)傷敷料、人造骨以及神經(jīng)修復(fù)等方面都取得了良好效果，已有部分產(chǎn)品應(yīng)用于臨床。

從一級(jí)結(jié)構(gòu)上看，角蛋白分子鏈由19種α-氨基酸構(gòu)成，并形成了大量的五肽環(huán)模式的重復(fù)單元，即(C-C-X-P-X)和(C-C-X-SPT-SPT)，這里C代表半胱氨酸(Cys)，P代表脯氨酸(Pro)，S代表絲氨酸(Ser)，T代表蘇氨酸(Thr)，X代表除這幾種之外的構(gòu)成蛋白質(zhì)的任何一種氨基酸。文獻(xiàn)報(bào)道，角蛋白富含半胱氨酸殘基和大量二硫鍵。以羊毛角蛋白為例，其半胱氨酸含量約占所有氨基酸總量的10-30%，并通過(guò)二硫鍵的形式構(gòu)成穩(wěn)定的空間立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使羊毛表現(xiàn)出宏觀上良好的拉伸和力學(xué)強(qiáng)度。然而，高比例二硫鍵的存在也使得角蛋白極難溶解于水和一般溶劑，并很難從羊毛組織中有效抽提出來(lái)。為此，當(dāng)前角蛋白提取方法都是以破壞二硫鍵的交聯(lián)為前提。例如，采用巰基乙醇、焦亞硫酸鈉等還原劑將二硫鍵還原為自由巰基。然而，上述再生角蛋白在后續(xù)的純化（如沉淀、過(guò)濾、透析）及干燥過(guò)程中，極易被空氣中的氧氣氧化，使得自由巰基再次被氧化生成二硫鍵交聯(lián)，導(dǎo)致其分子量增大，水溶性變差。這給后續(xù)材料的成型加工帶來(lái)困難。目前常用的方法是在一定還原環(huán)境中進(jìn)行角蛋白的提取、純化和干燥，或者在無(wú)氧氣的環(huán)境中進(jìn)行。但這樣操作對(duì)設(shè)備和條件控制要求較高。此外，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這種發(fā)生完全或部分二硫鍵交聯(lián)的再生角蛋白在材料成型后，如制備成凝膠、膜、海綿、纖維等，其蛋白之間多以氫鍵或非共價(jià)鍵的形式發(fā)生作用，因此材料的力學(xué)強(qiáng)度較低。對(duì)此，有研究者采用材料后處理的方法來(lái)提高角蛋白材料的濕強(qiáng)度。具體做法是，先將再生角蛋白制備成薄膜、纖維、泡沫以及粘合劑材料。材料形成后，用還原劑、酸或者蛋白交聯(lián)劑或者用具有還原形式的角蛋白處理上述材料，使蛋白之間發(fā)生新的二硫鍵交聯(lián)并形成蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)【由可溶性S-磺化的角蛋白衍生物制備生物高分子薄膜纖維泡沫劑粘合劑材料。專利申請(qǐng)?zhí)枺?2819589.2】。但這種方法的不足之處在于，材料形成后，后處理試劑往往不能充分滲透入材料中發(fā)揮作用，因此蛋白交聯(lián)不充分，且所需時(shí)間較長(zhǎng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種促進(jìn)角蛋白溶解及增強(qiáng)角蛋白材料強(qiáng)度的方法。針對(duì)再生角蛋白水中溶解性差，且角蛋白材料強(qiáng)度較低的問(wèn)題，本發(fā)明提出一種簡(jiǎn)單易行的方法。該方法巧妙地解決了促進(jìn)角蛋白溶解和提高角蛋白材料強(qiáng)度的雙重問(wèn)題，方法簡(jiǎn)單，效果明顯，并可廣泛應(yīng)用于所有來(lái)源角蛋白的溶解和材料成型的處理。

本發(fā)明的一種促進(jìn)角蛋白溶解及增強(qiáng)角蛋白材料強(qiáng)度的方法，所述的角蛋白是指水不溶的或水中溶解度低的角蛋白，其特征是角蛋白中的半胱氨酸殘基以二硫鍵形式發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。

本發(fā)明的一種促進(jìn)角蛋白溶解及增強(qiáng)角蛋白材料強(qiáng)度的方法，所述的角蛋白原料可以是人或動(dòng)物毛發(fā)，如羊毛、家禽羽毛；動(dòng)物角或蹄，如牛角、牛蹄；指甲等含有角蛋白的材料，并可以是從角蛋白原料中能夠提取得到的任何分子量形式的角蛋白。

本發(fā)明所述的促進(jìn)角蛋白溶解的方法在于將角蛋白加入水溶液中，同時(shí)加入一定量的還原劑使二硫鍵斷裂形成自由巰基，促進(jìn)角蛋白溶解。

本發(fā)明所述的促進(jìn)角蛋白溶解的方法，所述的還原劑包括半胱氨酸、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、硫醇、焦亞硫酸鈉或者具有還原性的角蛋白或肽，或者其它具有還原性的蛋白質(zhì)或肽等能夠引發(fā)角蛋白中的二硫鍵斷裂并形成自由巰基的物質(zhì)。

本發(fā)明所述的角蛋白材料包括角蛋白水凝膠、膜、海綿、纖維等。

本發(fā)明所述的角蛋白水凝膠的制備方法為將5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉質(zhì)量0.1%以上的還原劑加入到水中，攪拌使蛋白溶解，然后靜置形成凝膠。

本發(fā)明所述的角蛋白膜的制備方法為將5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉質(zhì)量0.1%以上的還原劑加入到水中，攪拌使蛋白溶解，然后經(jīng)溶液澆注、溶劑揮發(fā)形成角蛋白膜。

本發(fā)明所述的角蛋白海綿的制備方法為將5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉質(zhì)量0.1%以上的還原劑加入到水中，攪拌使蛋白溶解，靜置形成角蛋白凝膠。然后，冷凍干燥角蛋白凝膠形成角蛋白海綿。

本發(fā)明所述的角蛋白纖維的制備方法為將5-30%的角蛋白粉、相比于蛋白粉質(zhì)量0.1%以上的還原劑加入到水中，攪拌使蛋白溶解。將上述溶液擠出到凝固浴中，經(jīng)過(guò)機(jī)械牽拉得到角蛋白纖維。

本發(fā)明所述的一種促進(jìn)角蛋白溶解及增強(qiáng)角蛋白材料強(qiáng)度的方法，特征在于，在角蛋白溶解過(guò)程中加入所述還原劑，還原劑使角蛋白分子中的二硫鍵斷裂生成新的自由巰基，促進(jìn)蛋白溶解。然后，在材料成型加工過(guò)程中，新的自由巰基在空氣、雙氧水等氧化條件下再次發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，形成角蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，因此顯著提高角蛋白材料的力學(xué)強(qiáng)度。

本發(fā)明的有益說(shuō)明

本發(fā)明提供了一種促進(jìn)角蛋白溶解及增強(qiáng)角蛋白材料的方法，其優(yōu)勢(shì)在于：（1）一步法實(shí)現(xiàn)蛋白溶解和材料增強(qiáng)的雙重目的；（2）充分利用角蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中半胱氨酸殘基含量高的特點(diǎn)，通過(guò)加入二硫鍵還原劑，如半胱氨酸，谷胱甘肽等，實(shí)現(xiàn)角蛋白材料的力學(xué)強(qiáng)度的增強(qiáng)。與現(xiàn)有提高蛋白材料力學(xué)強(qiáng)度的方法相比，本發(fā)明方法避免使用戊二醛等有毒化學(xué)交聯(lián)劑，可顯著降低材料的細(xì)胞毒性，有望應(yīng)用于組織工程材料、藥物緩釋載體等生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1所得角蛋白凝膠的微觀形貌圖。

圖2為按照實(shí)施例1方法所得對(duì)照樣凝膠的微觀形貌圖。

圖3為實(shí)施例1所得角蛋白凝膠的流變測(cè)試圖。

圖4為按照實(shí)施例1方法所得對(duì)照樣凝膠的流變測(cè)試圖。

圖5為實(shí)施例1所得角蛋白凝膠的壓縮強(qiáng)度測(cè)試圖。

圖6為按照實(shí)施例1方法所得對(duì)照樣凝膠的壓縮強(qiáng)度測(cè)試圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

實(shí)施例1

稱取質(zhì)量為0.3g的角蛋白粉末加入到2ml的水或磷酸緩沖液（pH=7.4）中，然后加入占蛋白質(zhì)量1.5%的半胱氨酸，攪拌溶解后，室溫下靜置，形成角蛋白凝膠。

實(shí)施例2

稱取質(zhì)量為0.15g的角蛋白粉末加入到2ml的水或緩沖液（pH=7.0-12.0）中，然后加入占蛋白質(zhì)量5%的二硫蘇糖醇，攪拌溶解后，室溫下靜置，形成角蛋白凝膠。

實(shí)施例3

稱取質(zhì)量為0.6g的角蛋白粉末加入到2ml的水或緩沖液（pH=7.0-12.0）中，然后加入占蛋白質(zhì)量1.5%的谷胱甘肽，攪拌溶解后，倒入到模型中，待溶劑揮發(fā)后即形成角蛋白膜。

實(shí)施例4

稱取質(zhì)量為0.1g的角蛋白粉末加入到2ml的水或緩沖液（pH=7.0-12.0）中，然后加入占蛋白質(zhì)量0.1%的焦亞硫酸鈉，攪拌溶解后，室溫下靜置，形成角蛋白凝膠。然后，冷凍干燥角蛋白凝膠形成角蛋白海綿。

實(shí)施例5

稱取質(zhì)量為0.2g的角蛋白粉末加入到2ml的水或緩沖液（pH=7.0-12.0）中，然后加入占蛋白質(zhì)1.5%的半胱氨酸，攪拌溶解后，將上述溶液擠出到凝固浴中，經(jīng)過(guò)機(jī)械牽拉得到角蛋白纖維。

實(shí)施例6

稱取質(zhì)量為0.3g的角蛋白粉末加入到2ml的水或緩沖液（pH=7.0-12.0）中，然后加入占蛋白質(zhì)3%的半胱氨酸。攪拌溶解后，采用靜電紡絲的方法制備納米角蛋白纖維。

實(shí)施例7

按照實(shí)施例1中所述的制備方法制備角蛋白凝膠，并對(duì)其微觀結(jié)構(gòu)和材料強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)試。為了突出溶解過(guò)程中添加還原劑對(duì)提高材料力學(xué)強(qiáng)度的顯著作用，同時(shí)采用溶解過(guò)程中不添加還原劑的角蛋白凝膠作為對(duì)照。該凝膠稱為對(duì)照樣凝膠。

采用掃描電鏡觀察角蛋白凝膠和對(duì)照樣凝膠的微觀形貌，結(jié)果如圖1和圖2所示。很明顯，采用本發(fā)明提出的制備方法，所得凝膠的孔隙結(jié)構(gòu)明顯致密。這表明，在角蛋白溶解過(guò)程中加入還原劑后，溶解后的角蛋白生成新的自由巰基，可在空氣、雙氧水等氧化條件下再次發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，因此形成了更加致密的角蛋白交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。

分別對(duì)角蛋白凝膠和對(duì)照樣凝膠進(jìn)行流變學(xué)測(cè)試，結(jié)果如圖3和圖4所示。很明顯，采用本發(fā)明提出的制備方法，所得凝膠的G’值顯著高于對(duì)照樣品，說(shuō)明本發(fā)明提出的方法能夠顯著提高角蛋白材料的力學(xué)強(qiáng)度。分別測(cè)試角蛋白凝膠和對(duì)照樣凝膠的壓縮強(qiáng)度，結(jié)果如圖5和圖6所示。角蛋白凝膠的壓縮強(qiáng)度達(dá)到50kPa以上，而對(duì)照樣凝膠僅為35kPa。以上結(jié)果均表明，本發(fā)明方法能夠有效提高角蛋白材料的力學(xué)強(qiáng)度。