專利名稱：一種基于牛血清白蛋白的手性傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米技術(shù)，生物技術(shù)以及電化學(xué)研究領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明提供了一種基于牛血清白蛋白(BSA)的手性傳感器以及其制備方法。
背景技術(shù)：
手性化合物與生命過程息息相關(guān)，不同的手性異構(gòu)體在生物體內(nèi)的生物活性，藥理作用，代謝過程等有著明顯的差別，因此發(fā)展簡單，準(zhǔn)確，快速的手性識別方法成為近年來手性分析的主要方向。最近幾年，手性傳感器的研究已經(jīng)取得了一定的發(fā)展，其中的手性選擇劑大部分是借鑒色譜上的手性固定相(A.Tsourkas，O.Hofstetter，H.Hofstetter，R.Weissleder，L.Josephson，Angew.Chem.Int.Edit.2004，43，2395)。蛋白由于具有復(fù)雜而且可轉(zhuǎn)變的構(gòu)象，在色譜上能夠很好地分離手性異構(gòu)體，而且國內(nèi)已有專利(專利申請?zhí)?9113091.X，公開號CN 1280986A)報道利用蛋白作色譜手性固定相。例如BSA通常在色譜上被用來分離手性氨基酸和手性藥物，分離效果很好，并且實驗及結(jié)構(gòu)分析證明，BSA的手性選擇性主要來源于它于手性化合物(主-客體)之間的立體選擇性，氫鍵作用和親水疏水性(M.Kato，K.Sakai-Kato，N.Matsumoto，T.Toyo’oka，Anal.Chem.2002，74，1915；C.V.Kumar，A.Buranaprapuk，H.C.Sze，Chem.Comm.2001，3，297)，然而到目前為止，BSA還沒有用在手性傳感器上進(jìn)行手性識別。因此，以BSA良好的手性選擇性與傳感器能夠簡單、快速和精確測定被分析物的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合為切入點(diǎn)，對手性傳感器的發(fā)展將具有重要的理論和實際研究意義。
另一方面，納米材料被認(rèn)為是跨世紀(jì)材料研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。納米材料本身的量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)等，使得它具有許多特有的性質(zhì)，因此在催化、生物醫(yī)藥以及新材料等方面得到廣泛的應(yīng)用。其中文獻(xiàn)報道的水相金屬納米顆粒的合成(P.Selvakannan，S.Mandal，S.Phadtare，A.Gole，R.Pasricha，S.D.Adyanthaya，M.Sastry，J.Colloid.Interf.Sci.2004，269，97)，為納米材料在生物領(lǐng)域的應(yīng)用(例如生物標(biāo)記和藥物輸送)開拓了廣闊的前景。對于蛋白作為手性選擇劑的手性傳感器，金屬納米顆粒將可以用來標(biāo)記手性氨基酸異構(gòu)體，從而通過電化學(xué)檢測金屬納米顆粒來檢測手性識別結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于BSA的手性傳感器，使手性識別操作簡便，檢測靈敏度高。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述傳感器的制備方法。
本發(fā)明提供了一種基于牛血清白蛋白手性傳感器，該傳感器中電極表面覆蓋含有牛血清白蛋白的氧化鋁溶膠-凝膠膜，膜的厚度范圍為20～40nm。
實驗結(jié)果表明，該傳感器不僅能夠有效地手性識別，而且能夠靈敏地檢測氨基酸異構(gòu)體和藥物異構(gòu)體。
本發(fā)明的傳感器中，電極可以是絲網(wǎng)印刷電極或者玻碳電極等。
本發(fā)明還提供了上述傳感器的制備方法，即將濃度為0.05-0.2mg mL-1的牛血清白蛋白和氧化鋁溶膠-凝膠混合，牛血清白蛋白和氧化鋁溶膠-凝膠的體積比為0.5∶1-1.2∶1；將混合溶液覆蓋在電極上，0-4℃靜置固化60-80小時，得到的膜厚度范圍為20～40nm；最后將上述制得的電極與電化學(xué)裝置連接，制成傳感器。
本發(fā)明的傳感器制備過程中，混合溶液通過浸漬、涂布或者滴加方法覆蓋在電極上。覆蓋一個電極所用的混合溶液總體積可以是2-20μL。
本發(fā)明的傳感器制備過程中，所用牛血清白蛋白的濃度為0.09-0.15mg mL-1時，結(jié)果更優(yōu)化。
本發(fā)明的傳感器制備過程中，所用的電極可以是絲網(wǎng)印刷電極或者玻碳電極等。
本發(fā)明的傳感器在制備過程中，所用傳感器玻碳電極為桿狀，其直徑可以是2-4毫米。
該傳感器主要是通過氧化鋁溶膠-凝膠在低溫條件下固定BSA來制備傳感器，制備方法簡單，蛋白活性保持良好。手性識別時，只需將該傳感器與金屬納米顆粒標(biāo)記的氨基酸異構(gòu)體溶液分別孵化8-12分鐘，接著通過電化學(xué)檢測得到手性識別結(jié)果，操作簡單，省時，而且具有較高的檢測靈敏度。
本發(fā)明的傳感器應(yīng)用時，可取上述得到的傳感器兩個，分別置于含有金屬納米顆粒標(biāo)記的手性異構(gòu)體待測樣品的磷酸緩沖溶液中孵化8-12分鐘，磷酸緩沖溶液的pH范圍為6-9；孵化后，用蒸餾水充分沖洗電極然后進(jìn)行電化學(xué)測定即可。
本發(fā)明的傳感器應(yīng)用過程中，采用金屬納米顆?？梢允墙痤w粒、銀膠顆?；蛘吡蚧~納米顆粒等。
本發(fā)明的傳感器應(yīng)用過程中，采用待測樣品異構(gòu)體是色氨酸異構(gòu)體、苯并氨酸異構(gòu)體或者酪氨酸異構(gòu)體，也可以是手性藥物等。
上述金屬納米顆?？梢允墙鹉z，通過金標(biāo)銀染后，來電化學(xué)檢測銀的氧化信號；也可以是銀膠和Ag@Au或者Cu@Au合金納米顆粒等，直接檢測金屬納米顆粒。手性識別的對象可以是色氨酸異構(gòu)體，也可以是苯并氨酸，酪氨酸和一些手性藥物。
本發(fā)明的傳感器應(yīng)用過程中，采用三電極系統(tǒng)進(jìn)行電化學(xué)測定，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，手性識別后的傳感器電極或者碳纖維電極為工作電極，在0.08-0.12mol L-1的醋酸類緩沖溶液(pH4.8-5.5)或者0.08-0.12mol L-1硝酸底液中，記錄差分脈沖伏安曲線。
本發(fā)明提供了一種基于牛血清白蛋白的手性傳感器。該手性傳感器制備簡單，能夠穩(wěn)定地固定蛋白，且保持蛋白的活性，而且檢測靈敏度比較高。本發(fā)明的手性傳感器能高效地應(yīng)用于檢測和分離手性氨基酸和手性藥物，實驗表明，該手性傳感器能檢測到0.1皮摩爾濃度的氨基酸異構(gòu)體。


圖1為手性識別過程示意圖。
圖2為手性色氨酸識別的結(jié)果圖。曲線a和b分別代表該傳感器對L-和D-色氨酸進(jìn)行手性識別的結(jié)果。定義異構(gòu)選擇性系數(shù)α為該傳感器對L-和D-型氨基酸進(jìn)行識別所得銀的氧化峰電流之比。則該傳感器對色氨酸的異構(gòu)選擇性系數(shù)為2.3。實驗結(jié)果表明，該傳感器對色氨酸異構(gòu)體的檢測限達(dá)到0.1皮摩爾濃度。
圖3為該傳感器的峰電流和異構(gòu)選擇性系數(shù)隨色氨酸異構(gòu)體濃度變化結(jié)果圖。
具體實施例方式
實施例1下面通過該傳感器識別金膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
(1)金膠的制備將500mL 1mM的HAuCl4溶液，加熱至沸，再加入50mL 38.8mM的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱沸騰10min，再停止加熱攪拌15分鐘，即制得直徑約為13-15nm的金膠，用0.22μm濾膜過濾后放在棕色瓶子0-4℃保存。
(2)金膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體的制備分別將1mL0.01mM濃度的色氨酸異構(gòu)體溶液加入到9mL上面新制備的金膠溶液中，室溫20-30℃組裝48小時。
(3)傳感器制備將0.1mg mL-1的BSA和氧化鋁溶膠-凝膠混合溶液5μL(1∶1v/v)滴加在玻碳電極(Φ＝4)上，在0-4℃靜置固化72小時，形成的氧化鋁溶膠-凝膠膜厚度為25±3nm。
(4)手性識別分別將10L步驟(2)制備的金膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體溶液加入到10mL磷酸緩沖溶液(pH7)中，然后將兩個傳感器分別在其中孵化10分鐘后，用蒸餾水充分沖洗。
(5)金標(biāo)銀染將手性識別后的兩個傳感器分別置于銀染溶液(150μL 0.22％的硝酸銀溶液和150μL 1％對苯二酚的檸檬酸鹽緩沖溶液溶液(pH＝3.8)的混合溶液)中避光反應(yīng)8分鐘，用蒸餾水充分沖洗后，然后在2.5％Na2S2O3的水溶液放置3分鐘，最后再用蒸餾水充分沖洗。
(6)電化學(xué)測定采用三電極系統(tǒng)，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，銀染后的玻碳電極為工作電極，0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH 5.2)為底液，記錄差分脈沖伏安(DPV)曲線。掃描范圍0.1V-0.8V(vs SCE)。其中參比電極用雙鹽橋?qū)⑵渑c底液隔離，避免不斷釋放的Cl-與銀形成AgCl沉淀干擾測定。
該手性傳感器按照上述實施方式進(jìn)行手性識別色氨酸，手性識別過程圖1所示，得到的手性識別結(jié)果如圖2和圖3所示。在圖2中，曲線a和b分別代表該傳感器對L-和D-色氨酸進(jìn)行手性識別的結(jié)果。定義異構(gòu)選擇性系數(shù)α為該傳感器對L-和D-型氨基酸進(jìn)行識別所得銀的氧化峰電流之比。則該傳感器對色氨酸的異構(gòu)選擇性系數(shù)為2.3。實驗結(jié)果表明，該傳感器對色氨酸異構(gòu)體的檢測限達(dá)到0.1皮摩爾濃度。圖3表示該傳感器隨色氨酸異構(gòu)體濃度變化，其檢測的峰電流和異構(gòu)選擇性系數(shù)的變化情況。
實施例2下面通過該傳感器識別金膠標(biāo)記的苯并氨酸異構(gòu)體來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
(1)金膠的制備和金膠標(biāo)記的苯丙氨酸的制備同實施例1(2)傳感器制備將0.1mg mL-1的BSA和氧化鋁溶膠-凝膠混合溶液10μL(1∶1v/v)滴加在玻碳電極(Φ＝2mm)上，在0-4℃靜置固化72小時，形成的氧化鋁溶膠-凝膠膜厚度為31±2nm。
(3)手性識別分別將10L步驟(2)制備的金膠標(biāo)記的苯丙氨酸異構(gòu)體溶液加入到10mL磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，然后將兩個傳感器分別在其中孵化11分鐘后，用蒸餾水充分沖洗。
(4)金標(biāo)銀染將手性識別后的兩個傳感器分別置于銀染溶液(150μL 0.22％的硝酸銀溶液和150μL 1％對苯二酚的檸檬酸鹽緩沖溶液溶液(pH＝3.8)的混合溶液)中避光反應(yīng)8.5分鐘，用蒸餾水充分沖洗后，然后在2.5％Na2S2O3的水溶液放置3分鐘，最后再用蒸餾水充分沖洗。
(5)電化學(xué)測定方法同實施例1該手性傳感器以上述實施方式對苯丙氨酸異構(gòu)體進(jìn)行手性識別，得到的異構(gòu)選擇性系數(shù)為1.3。
實施例3下面通過該傳感器識別金膠標(biāo)記的酪氨酸異構(gòu)體來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
(1)金膠的制備金膠的制備和金膠標(biāo)記的苯丙氨酸的制備同實施例1(2)傳感器制備將0.1mg mL-1的BSA和氧化鋁溶膠-凝膠混合溶液15μL(1∶1v/v)滴加在玻碳電極(Φ＝4)上，在0-4℃靜置固化72小時，形成的氧化鋁溶膠-凝膠膜厚度為36±2nm。
(3)手性識別分別將10L步驟(2)制備的金膠標(biāo)記的酪氨酸異構(gòu)體溶液加入到10mL磷酸緩沖溶液(pH8)中，然后將兩個傳感器分別在其中孵化12分鐘后，用蒸餾水充分沖洗。
(4)金標(biāo)銀染將手性識別后的兩個傳感器分別置于銀染溶液(150μL 0.22％的硝酸銀溶液和150μL1％對苯二酚的檸檬酸鹽緩沖溶液溶液(pH＝3.8)的混合溶液)中避光反應(yīng)9分鐘，用蒸餾水充分沖洗后，然后在2.5％Na2S2O3的水溶液放置3分鐘，最后再用蒸餾水充分沖洗。
(5)電化學(xué)測定方法同實施例1該手性傳感器按照上述實施方式進(jìn)行手性識別酪氨酸，得到的異構(gòu)選擇性系數(shù)為1.36。
實施例4
下面通過該傳感器識別銀膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
(1)銀膠的制備在10mL 10-3mol L-1AgNO3溶液中，緩慢滴加10mL 3×10-3mol L-1NaBH4反應(yīng)在冰浴中攪拌進(jìn)行，滴加完后，離開冰浴，不停的攪拌直至溶液溫度逐漸升高至室溫，得到的澄清透明淺黃色膠體，然后將該膠體在半透膜中滲析純化24h，得到的棕黃色銀膠，即所要制備的納米銀膠，其徑粒分布在20-25nm范圍之內(nèi)。
(2)銀膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體的制備分別將1mL0.01mM濃度的色氨酸異構(gòu)體溶液加入到9mL上面新制備的銀膠溶液中，室溫20-30℃組裝48小時。
(3)傳感器制備將0.1mg mL-1的BSA和氧化鋁溶膠-凝膠混合溶液5μL(1∶1v/v)滴加在玻碳電極(Φ＝4)上，在0-4℃靜置固化72小時。
(4)手性識別分別將10μL步驟(2)制備的銀膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體溶液加入到10mL0.01M磷酸緩沖溶液(pH7)中，然后將兩個傳感器分別在其中孵化8分鐘后，用蒸餾水充分沖洗。
(5)銀的氧化溶解將完成手性識別反應(yīng)的兩個傳感器分別浸入150μL 50％的HNO3溶液中，振蕩使銀氧化溶解，5min后取出傳感器，并加入0.8mL 10mM HNO3-KNO3溶液作為支持電解質(zhì)在此溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測
(6)電化學(xué)測定采用三電極系統(tǒng)，鉑絲為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，5μm碳纖維微電極為工作電極，在上述溶液中，采用陽極溶出伏安法測定Ag+。電極在-0.5V下預(yù)富集150s后，在0.0～+0.6V范圍內(nèi)反向溶出，記錄溶出DPV信號。其中參比電極用雙鹽橋?qū)⑵渑c底液隔離，避免不斷釋放的Cl-與銀形成AgCl沉淀干擾測定。
實施例5下面通過該傳感器識別銀膠標(biāo)記的苯并氨酸異構(gòu)體來對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。
(1)銀膠的制備和銀膠標(biāo)記的苯丙氨酸異構(gòu)體的制備同實施例1(2)傳感器制備將0.1mg mL-1的BSA和氧化鋁溶膠-凝膠混合溶液10μL(1∶1v/v)滴加在玻碳電極(Φ＝3)上，在0-4℃靜置固化72小時。
(4)手性識別分別將15μL步驟(2)制備的金膠標(biāo)記的色氨酸異構(gòu)體溶液加入到10mL0.02M磷酸緩沖溶液(pH8)中，然后將兩個傳感器分別在其中孵化10分鐘后，用蒸餾水充分沖洗。
(5)銀的氧化溶解將完成手性識別反應(yīng)的兩個傳感器分別浸入200μL 50％的HN03溶液中，振蕩使銀氧化溶解，5min后取出玻碳電極，并加入1mL 10mMHNO3-KNO3溶液作為支持電解質(zhì)在此溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測(6)電化學(xué)測定方法同實施例權(quán)利要求
1.一種基于牛血清白蛋白的手性傳感器，其特征在于，該傳感器中電極表面覆蓋含有牛血清白蛋白的氧化鋁溶膠-凝膠膜，膜的厚度范圍為20～40nm。
2.如權(quán)利要求1所述傳感器，其特征在于，該傳感器中電極是絲網(wǎng)印刷電極或者玻碳電極。
3.如權(quán)利要求1所述傳感器的制備方法，其特征在于，將濃度為0.05-0.2mg mL-1的牛血清白蛋白和氧化鋁溶膠-凝膠混合，牛血清白蛋白和氧化鋁溶膠-凝膠的體積比為0.5∶1-1.2∶1；將混合溶液覆蓋在電極上，0-4℃靜置固化60-80小時，得到的膜厚度范圍為20～40nm；最后將上述制得的電極與電化學(xué)裝置連接，制成傳感器。
4.如權(quán)利要求3所述的傳感器制備方法，其特征在于，混合溶液通過浸漬、涂布或者滴加方法覆蓋在電極上。
5.如權(quán)利要求3所述的傳感器制備方法，其特征在于，牛血清白蛋白的濃度為0.09～0.15mg mL-1。
6.如權(quán)利要求3所述傳感器的制備方法，其特征在于，該傳感器中電極是絲網(wǎng)印刷電極或者玻碳電極。
7.如權(quán)利要求3所述傳感器的制備方法，其特征在于，該傳感器中玻碳電極為桿狀，直徑為2-4毫米。
全文摘要
本發(fā)明涉及納米技術(shù)，生物技術(shù)以及電化學(xué)研究領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明提供了一種基于牛血清白蛋白的手性傳感器以及其制備方法。不同的手性異構(gòu)體在生物體內(nèi)的生物活性，藥理作用，代謝過程等有著明顯的差別，因此發(fā)展簡單，準(zhǔn)確，快速的手性識別方法成為近年來手性分析的主要方向。本發(fā)明提供了一種基于牛血清白蛋白手性傳感器，該手性傳感器利用牛血清白蛋白(BSA)為手性選擇劑來識別金屬納米顆粒標(biāo)記的異構(gòu)體樣品，并通過電化學(xué)檢測手段來實現(xiàn)手性識別。本發(fā)明的手性傳感器能高效地應(yīng)用于檢測手性氨基酸和手性藥物。實驗表明，該手性傳感器能檢測到0.1皮摩爾濃度的氨基酸異構(gòu)體。
文檔編號G01N27/403GK1825106SQ200610025488
公開日2006年8月30日 申請日期2006年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月6日
發(fā)明者孔繼烈, 王云俠 申請人:復(fù)旦大學(xué)