本發(fā)明涉及基因工程與腫瘤生物治療
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說涉及一種與長春新堿耐藥性相關(guān)的microRNA分子miR-663a及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，結(jié)直腸癌的發(fā)病率正逐年升高，其發(fā)病率僅次于食管癌、胃癌和肺癌等惡性腫瘤。長春新堿(vincristine,VCR)是目前具有廣泛使用的抗腫瘤的化療藥物。然而，長期治療可以使腫瘤細(xì)胞的對(duì)VCR產(chǎn)生耐藥性，這是導(dǎo)致化學(xué)治療失敗的主要原因之一。數(shù)據(jù)顯示，90％的癌癥患者死亡與腫瘤的耐藥性有關(guān)。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、高度保守、具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，長約20～25個(gè)核苷酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與許多生命現(xiàn)象有關(guān)，如發(fā)育、分化和凋亡等，腫瘤發(fā)生也牽涉到miRNA表達(dá)水平的異常。此外，也有研究表明miRNA與腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感程度相關(guān)。miRNA可廣泛參與發(fā)育周期、細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡、新陳代謝、神經(jīng)調(diào)控、腫瘤發(fā)生以及病毒和宿主的相互作用等各種生理和病理的調(diào)控過程。細(xì)胞中基因片段拷貝數(shù)變異、插入、缺失及染色體數(shù)目異常等基因組穩(wěn)定性異?，F(xiàn)象均可引起一些miRNA的異常表達(dá)或調(diào)控。miRNA的突變、表達(dá)異?；蚣庸ば揎棶惓⒂绊憁iRNA的正常功能，導(dǎo)致目標(biāo)基因的表達(dá)發(fā)生改變，影響腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性。長春新堿在結(jié)腸癌的治療過程中發(fā)揮著重要作用，但出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象是限制其臨床療效的主要原因。明確新的micoRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞長春新堿耐藥中的生物學(xué)功能和機(jī)制為有效提高結(jié)腸癌的臨床療效提供新的生物靶標(biāo)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種與長春新堿耐藥性相關(guān)的microRNA分子miR-663a及其應(yīng)用。本發(fā)明利用新一代高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)分析方法與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過建立結(jié)腸癌長春新堿耐藥細(xì)胞株，采用全基因組篩選的研究策略，運(yùn)用HiSeq2500測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的方法，檢測(cè)和分析耐藥細(xì)胞株的和非耐藥的細(xì)胞株差異性表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-663a在長春新堿耐藥細(xì)胞中高表達(dá)。本發(fā)明提供的一種與長春新堿耐藥相關(guān)的microRNA分子，其為miR-663a，其核苷酸序列含有SEQIDNO.1所示的序列。本發(fā)明提供了含有miR-663a的生物材料，所述生物材料為載體、宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、工程菌。本發(fā)明提供了miR-663a分子或含有其的生物材料在作為結(jié)腸癌長春新堿耐藥標(biāo)志物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了miR-663a分子或含有其的生物材料在制備結(jié)腸癌長春新堿耐藥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述microRNA分子在長春新堿耐藥細(xì)胞中高表達(dá)。本發(fā)明提供了miR-663a分子在篩選新的結(jié)腸癌治療藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了miR-663a分子的抑制劑在制備拮抗長春新堿耐藥的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種用于治療結(jié)腸癌的藥物，含有miR-663a分子抑制劑。用于PCR檢測(cè)miR-663a分子的特異性引物對(duì)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明的實(shí)施例中，用于檢測(cè)miR-663a分子的特異性引物對(duì)為SEQIDNO.2-4所示。本發(fā)明提供了上述特異性引物對(duì)在制備結(jié)腸癌長春新堿耐藥輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明miR-663a的核苷酸序列含有如SEQIDNO.1所示的序列，其具有在長春新堿耐藥細(xì)胞中高表達(dá)、在長春新堿敏感細(xì)胞株低表達(dá)的特性，可作為長春新堿耐藥標(biāo)志物，用于制備針對(duì)結(jié)腸癌長春新堿耐藥輔助診斷試劑盒，可以特異地檢測(cè)組織中miR-663a的表達(dá)量，有效地用于臨床結(jié)腸癌長春新堿耐藥的輔助診斷；本發(fā)明還為設(shè)計(jì)結(jié)腸癌長春新堿耐藥藥物提供了新的靶點(diǎn)，并以此為依據(jù)，用以設(shè)計(jì)和開發(fā)miR-663a的抑制劑在制備降低對(duì)長春新堿耐藥性藥物中的應(yīng)用或以其為靶點(diǎn)在篩選新的結(jié)腸癌治療藥物中的應(yīng)用，以便進(jìn)行精準(zhǔn)治療、提高療效、降低副作用。本發(fā)明提供了該miRNA標(biāo)志物在制備用于治療結(jié)腸癌的長春新堿耐藥性輔助診斷試劑盒以及篩選新的結(jié)腸癌治療藥物方面的應(yīng)用，具有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VCR敏感細(xì)胞HCT-8及耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR對(duì)長春新堿的耐藥能力效果圖。圖2為VCR敏感細(xì)胞株HCT-8及耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR細(xì)胞中miR-663a的表達(dá)水平。圖3為細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-663a模擬物轉(zhuǎn)染VCR對(duì)VCR的耐藥能力效果圖。圖4為細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT-8/VCR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-663a抑制劑對(duì)長春新堿的耐藥能力效果圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例及試驗(yàn)例中所用細(xì)胞系、試劑等均為市售商品。HCT-8細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。實(shí)施例1構(gòu)建長春新堿耐藥細(xì)胞系HCT-8/VCR采用逐步增加長春新堿(VCR)濃度的方法建立結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株HCT-8/VCR。將敏感細(xì)胞HCT-8培養(yǎng)于含VCR的培養(yǎng)液中，初始濃度5ng/mL，以后逐漸增加藥物濃度，分別為10、100、1000和2000ng/mL。在每個(gè)濃度獲得耐藥性后，以極限稀釋法克隆生長良好的細(xì)胞，然后進(jìn)入下一個(gè)濃度的培養(yǎng)和篩選。最后HCT-8細(xì)胞在2000ng/mL的VCR中持續(xù)培養(yǎng)20代以上，構(gòu)建耐藥細(xì)胞系HCT-8/VCR，實(shí)驗(yàn)前1周停用VCR。實(shí)施例2細(xì)胞對(duì)VCR的藥敏性測(cè)試(MTT法)分別取對(duì)數(shù)生長期的耐藥株HCT-8/VCR和敏感株細(xì)胞HCT-8，通過無血清培養(yǎng)基稀釋法用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，并以1×104個(gè)/孔的細(xì)胞溶液接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中?？瞻讓?duì)照組加入不含VCR的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入含10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml、3000ng/ml、4000ng/ml的長春新堿培養(yǎng)液，100μl/孔。各組細(xì)胞于37℃溫育培養(yǎng)48h；取出培養(yǎng)板，加入MTT(5mg/mL)溶液20μl/孔，繼續(xù)放入37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育4h；然后用移液器吸棄培養(yǎng)上清液，加入DMSO150μl/孔，充分振蕩后，將培養(yǎng)板放入酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，設(shè)定檢測(cè)波長為570nm，讀取各孔的吸光度(OD)值。計(jì)算背景組平均值，并以此平均值作為零點(diǎn)進(jìn)行調(diào)零，并計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)組平均OD值-背景組平均OD值)/空白對(duì)照組平均OD值—背景組平均OD值)×100％，然后計(jì)算50％細(xì)胞存活時(shí)的藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度IC50。使用不同濃度的VCR處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8及HCT-8/VCR，對(duì)細(xì)胞的抑制率見圖1。HCT-8細(xì)胞及HCT-8/VCR的半抑制濃度IC50分別為140.265和2350.469。實(shí)施例3利用生物信息技術(shù)篩選出與長春新堿耐藥相關(guān)的miRNA1、細(xì)胞總RNA提取收集細(xì)胞，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1mLTrizol分離試劑，吹打細(xì)胞數(shù)次使細(xì)胞裂解。室溫下孵育5min。加入0.2mL氯仿試劑，蓋好管蓋，振蕩15s，4℃室溫下孵育15min，15000rpm離心10min，溶液分離成三相。將無色液相的上層溶液轉(zhuǎn)入一新的離心管中。加入0.5mL異丙醇，蓋好管蓋，上下顛倒數(shù)次使液體充分混勻，室溫下孵育10min，4℃12000rpm離心l5min，棄上清，加入75％乙醇，振蕩洗滌，4℃，7500rpm離心5min，棄上清，干燥5～l0min，除去乙醇。加入20μLDEPC處理過的ddH2O，移液器吹打數(shù)次。取RNA溶液在分光光度計(jì)上分別測(cè)定A260,A260/280，計(jì)算RNA的含量及純度。用0.2μLDEPC處理的1×TAE，1％瓊脂糖凝膠，100V恒壓電泳30min，觀察。2、cDNA文庫構(gòu)建及測(cè)序提取細(xì)胞總RNA后，回收片段長度在18-30nt范圍的RNA，采用T4RNA連接酶，在片段的5′端加上5′測(cè)序接頭，3′端加上3′測(cè)序接頭，然后以此帶有接頭的片段為模板，采用隨機(jī)引物合成cDNA，加入5′端接頭引物和3′接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立PCR完整測(cè)序文庫。運(yùn)用高通量、高靈敏度的Illumina公司開發(fā)的HiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行HCT-8及HCT-8/V的miRNA測(cè)序。測(cè)序由上海晶能生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法miRNA表達(dá)量計(jì)算采用TPM計(jì)算度量指標(biāo)(transcriptpermillion)，TPM公式＝(每條miRNA比對(duì)到的read數(shù)目)/(樣本總比對(duì)上的read數(shù)目)×106，TPM含義是以每百萬比配成對(duì)序列做miRNA表達(dá)量指標(biāo)，其中總比配成對(duì)read數(shù)目用于歸一化表達(dá)量數(shù)值。利用DESeq軟件對(duì)樣本比對(duì)組篩選差異表達(dá)的miRNA，利用TPM分別計(jì)算樣本表達(dá)量取log2，滿足p≥0.05和大于等于2倍差異表達(dá)范圍篩選兩組之間的差異miRNA。4、結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞相比，共篩選出48條差異表達(dá)的miRNA,其中has-miR-663a在HCT-8/VCR細(xì)胞中上調(diào)7.32倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)施例4檢測(cè)HCT-8及HCT-8/VCR細(xì)胞中miR-663a的表達(dá)量1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)miRBaSe數(shù)據(jù)庫中獲得hsa-miR-663a成熟序列(http://www.mirbase.org,No：MI0003672)：5′-AGGCGGGGCGCCGCGGGACCGC-3′設(shè)計(jì)如下引物：逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGCGGTCCC-3′(SEQIDNO.2)定量PCR引物：正向引物：5′-ACACTCCAGCTGGGAGGCGGGGCGCCGCGG-3′(SEQIDNO.3)反向引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′(SEQIDNO.4)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中U6snRNA管家基因(Genbank:NR_004394.1)設(shè)計(jì)如下引物：U6snRNA的逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；(SEQIDNO.5)U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；(SEQIDNO.6)U6反向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；(SEQIDNO.7)2、細(xì)胞總RNA提取全程佩戴一次性手套。用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150℃的烘箱中烘烤4h。塑料器皿可以在0.5MNaOH中浸泡10min，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。整個(gè)過程在冰上操作，防止RNA降解。取5-10×106的HCT-8及HCT-8/VCR細(xì)胞，離心，棄上清，用移液管加1ml提前預(yù)冷的Trizol試劑反復(fù)吹打來裂解細(xì)胞至均一通亮的液態(tài)后，將勻漿樣品在冰上放置5min，保證細(xì)胞充分的裂解。加入200μl氯仿，劇烈渦旋30秒，室溫靜置5min。4℃，12000×g離心15min。小心轉(zhuǎn)移上清至一RNase-free1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇混勻。4℃，12000×g離心15min，棄上清。加入750μl75％乙醇，4度，12000×g離心5min，棄上清。乙醇風(fēng)干后，加45μlDEPC處理水，室溫靜置2min溶解RNA。變性電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定，即可使用或-80度保存。3、DNaseI處理配置下列體系：RNA1μg10×ReactionBufferwithMgCl21μlDNaseI，RNase-free1μlDEPC處理水至10μl總體積10μl37℃水浴30min。65℃水浴10min滅活DNaseI。4、反轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(20μL)：5×primerbuffer4μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，逆轉(zhuǎn)錄引物(10μM)0.5μL，U6snRNA逆轉(zhuǎn)錄引物(10μM)0.5μL，RNA1μg，加無RNA酶水補(bǔ)至20μL體系?；靹?，離心。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃溫育15min，85℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶5s，4℃保存。5、Real-timePCR熒光定量RT-PCR的反應(yīng)體系20(μL)：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，模板DNA1μL，上下游引物(10μM)各0.5μL，雙蒸水定容至20μL.實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)時(shí)，正向引物分別與通用反向引物PCR擴(kuò)增。模板cDNA分別為逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。反應(yīng)條件為：95℃變性5min，40個(gè)循環(huán)(95℃15s，60℃15s，72℃20s)，95℃15s，60℃30s,95℃15s。取熒光值繪制溶解曲線，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。。6、has-miR-663a表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析以U6snRNA管家基因作為內(nèi)參，采用相對(duì)定量法，計(jì)算基因的表達(dá)量?；虻谋磉_(dá)量F＝2—△△ctF值越大表達(dá)量越高。其中，△△ct＝(待測(cè)樣品的目的基因的ct的平均值—待測(cè)樣本的管家基因的ct的平均值)—(對(duì)照樣品的目的基因的ct的平均值—對(duì)照樣本的管家基因的ct的平均值)。結(jié)果顯示，與HCT-8細(xì)胞相比，has-miR-663a在HCT-8/VCR細(xì)胞中上調(diào)，分析結(jié)果顯示在has-miR-663a表達(dá)量在HCT-8/VCR細(xì)胞中比HCT-8細(xì)胞上調(diào)6.735倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。實(shí)施例5細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT-8細(xì)胞轉(zhuǎn)染has-miR-663aminics后的耐藥特性當(dāng)HCT-8細(xì)胞處于生長活躍狀態(tài)時(shí)，于轉(zhuǎn)染前一天接種到12孔板，在12孔板中接種HCT-8細(xì)胞懸液。第二天，轉(zhuǎn)染miRNA模擬物(25nM)，轉(zhuǎn)染8h后，消化細(xì)胞并分盤到96孔板中，加入長春新堿(終濃度10ng/ml、20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、1000ng/ml、2000ng/ml)。48h后，取出96孔板，向每孔加入10μLCCK8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù))。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL1％w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24h內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染has-miR-663a模擬物組的HCT-8的細(xì)胞長春新堿的耐藥能力顯著高于未轉(zhuǎn)染組(圖3)，進(jìn)一步說明has-miR-663a能提高結(jié)腸癌細(xì)胞的長春新堿的耐藥能力。實(shí)施例6細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCT-8/VCR細(xì)胞轉(zhuǎn)染has-miR-663ainhibitor后的耐藥特性將化學(xué)合成的has-miR-663a抑制物(購自吉滿生物科技(上海)有限公司)轉(zhuǎn)染到HCT-8/VCR細(xì)胞中，使has-miR-663a在HCT-8/VCR細(xì)胞中表達(dá)降低。結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染has-miR-663a抑制物的能降低HCT-8/VCR細(xì)胞對(duì)長春新堿的耐藥能力見圖4。實(shí)施例7miRNA試劑盒miRNA試劑盒包括miR-663a引物(如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示、聚合酶鏈反應(yīng)試劑(包括熱啟動(dòng)TaqDNA聚合酶(2.5U/μL)及其反應(yīng)緩沖液、dNTP(10mM))、U6snRNA內(nèi)參引物(SEQIDNO.5-7)和熒光染料SYBR-Green1。利用本發(fā)明的試劑盒，結(jié)合常用的RNA提取試劑和通用的miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑，可以特異地檢測(cè)組織中miR-663a的表達(dá)量，有效地用于臨床結(jié)腸癌長春新堿耐藥的輔助診斷，以便進(jìn)行精準(zhǔn)治療、提高療效、降低副作用。miRNA試劑盒的效果檢測(cè)：選取河南省腫瘤醫(yī)院2013-2015年50例結(jié)腸癌病例，對(duì)其石蠟標(biāo)本進(jìn)行了miRNA提取，利用本發(fā)明miRNA試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本發(fā)明miRNA試劑盒能夠特異、有效地?cái)U(kuò)增出miR-663a序列，對(duì)其表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示有27例病例標(biāo)本miR-663a表達(dá)量平均為18.231±4.121，16例標(biāo)本中miR-663a表達(dá)量平均為3.213±2.134，表達(dá)量相差5.67倍(P<0.01)。結(jié)合臨床治療效果分析，miR-663a表達(dá)量較高的樣本采用長春新堿的治療結(jié)腸癌的效果較差，而表達(dá)量較低的樣本采用長春新堿的治療結(jié)腸癌的效果較好。進(jìn)一步證實(shí)了miR-663a的表達(dá)與結(jié)腸癌長春新堿的耐藥性有關(guān)。其試劑盒可以用于臨床檢測(cè)結(jié)腸癌長春新堿的耐藥性，進(jìn)一步用于指導(dǎo)臨床用藥及精準(zhǔn)治療、提高療效、降低副作用。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。SEQUENCELISTING<110>鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院河南省腫瘤醫(yī)院<120>與長春新堿耐藥性相關(guān)的microRNA分子miR-663a及其應(yīng)用<130>KHP171110286.7<160>7<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>RNA<213>miR-663a<400>1aggcggggcgccgcgggaccgc22<210>2<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>2ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgcggtccc41<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3acactccagctgggaggcggggcgccgcgg30<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>4tggtgtcgtggagtcg16<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>5cgcttcacgaatttgcgtgtcat23<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6ctcgcttcggcagcaca17<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7aacgcttcacgaatttgcgt20當(dāng)前第1頁1 2 3