本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程領(lǐng)域，具體涉及用于HIV感染治療的多核苷酸及其制備藥物應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：獲得性免疫缺陷綜合征(acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)是由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)感染所引起的免疫系統(tǒng)疾病，是一種危害性極大的全球化傳染病。HIV以人體免疫系統(tǒng)中最重要的T淋巴細(xì)胞作為主要攻擊對(duì)象，造成免疫功能喪失，從而易患各種疾病，死亡率高達(dá)99％-100％。HIV在人體內(nèi)的潛伏期能長(zhǎng)達(dá)8-10年，很多HIV感染者在發(fā)展成艾滋病患者之前可以無(wú)病癥的生活，但病毒在人體內(nèi)始終存在并不可治愈。雖然全世界眾多醫(yī)學(xué)研究人員專(zhuān)注于艾滋病的預(yù)防和治療，但至今尚未研制出特效藥物，由于HIV的變異極其迅速，因此也還沒(méi)有可用于預(yù)防的有效疫苗。對(duì)于HIV感染的治療，目前的主要策略是最大限度和持久的降低病毒載量、獲得免疫功能重建和維持免疫功能、提高生活質(zhì)量，以及降低HIV相關(guān)的發(fā)病率和死亡率?？鼓孓D(zhuǎn)錄病毒治療(anti-retroviraltherapy，ART)是近年來(lái)廣泛使用的治療手段，它有效抑制HIV在體內(nèi)的復(fù)制，減少體內(nèi)病毒載量，從而延長(zhǎng)感染者的壽命，但其花費(fèi)高昂，患者依從性差，長(zhǎng)期治療容易產(chǎn)生副作用和抗藥性，并且一旦中止治療病情可能快速反彈，最重要的是，ART并不能夠根除體內(nèi)的HIV病毒，達(dá)不到根治的效果。而以基因?yàn)榛A(chǔ)的治療方法可以持續(xù)的抑制病毒從而減少治療干預(yù)措施，是一種非常有前景的治療方式。對(duì)HIV感染基因治療手段的發(fā)展經(jīng)歷了兩個(gè)階段。一，基于RNA的治療方法，即一種下調(diào)相關(guān)基因表達(dá)量的方法，如shRNA、siRNA、反義RNA等。復(fù)旦大學(xué)(201110182785.5)公開(kāi)了一種攜帶特定RNAi核苷酸片段的重組慢病毒表達(dá)載體以及在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的重組慢病毒及其制備方法，可以應(yīng)用于艾滋病的基因治療，為患者提供新的安全有效的治療途徑。武漢大學(xué)(200910062851.8)公開(kāi)了一種多靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體，其中針對(duì)CCR5和HIV保守基因rev和tat的三靶點(diǎn)siRNA重組慢病毒載體具有最佳的抑制HIV病毒復(fù)制的能力，并能克服或延緩病毒逃逸。但上述技術(shù)只能達(dá)到基因沉默的效果，不能徹底的將基因敲除。二，基于蛋白質(zhì)的治療方法，即對(duì)相關(guān)基因的敲除，如ZFN(ZincFingerNuclease)、CRIAPR/Cas9，TALEN(TranscriptionActivator-likeEffectorNuclease)等。清華大學(xué)和北京唯尚立德生物科技有限公司共同申請(qǐng)的專(zhuān)利(201210385677.2)公開(kāi)了一類(lèi)調(diào)控CCR5和CXCR4的融合蛋白及方法，該方法利用TALEN技術(shù)靶向剪切CCR5或CXCR4基因的活性區(qū)域，使經(jīng)過(guò)基因編輯后的細(xì)胞具備抵御HIV的能力。中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院和呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室對(duì)CCR5缺失型的造血干細(xì)胞及其制備方法與應(yīng)用提出專(zhuān)利申請(qǐng)(201110115680.8)，該技術(shù)通過(guò)ZFN來(lái)失活人誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞的CCR5基因，再經(jīng)過(guò)體外定向誘導(dǎo)分化得到CCR5缺失型的造血干細(xì)胞。然而TALEN和ZFN基因編輯系統(tǒng)較為復(fù)雜，突變效率較低[1]，已經(jīng)逐步被CRISPR/Cas9技術(shù)所代替。CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)-Cas(CRISPR-associatedendonuclease)系統(tǒng)是基因治療領(lǐng)域的新成員，是一款強(qiáng)大的基因編輯工具。有別于ZFN和TALEN需要研究者根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)和生產(chǎn)一對(duì)特異性的核酸酶，CRISPR更簡(jiǎn)單，具有更廣泛的適應(yīng)性。CRISPR系統(tǒng)由一段crRNA和tracrRNA的嵌合體(crRNA-tracrRNAchimera)和一個(gè)Ⅱ類(lèi)CRISPR系統(tǒng)的非特異性的內(nèi)切核酸酶9(Cas9)組成，其中的RNA嵌合體由一段Cas9綁定序列g(shù)RNAscaffold和一段20nt左右的靶向結(jié)合目的基因/位點(diǎn)的RNA向?qū)蛄?guideRNA，gRNA，或稱(chēng)引導(dǎo)RNA)構(gòu)成。只要根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)特異性的gRNA序列，即可引導(dǎo)Cas9在靶位點(diǎn)附近進(jìn)行切割，產(chǎn)生雙鏈斷裂(doublestrandbreak,DSB)，然后細(xì)胞通過(guò)容易產(chǎn)生插入/缺失突變的非同源末端連接(non-homologousend-joining，NHEJ)將其修復(fù)，從而破壞目的基因的開(kāi)放閱讀框，達(dá)到敲除基因的目的。CRISPR/Cas9技術(shù)的多樣性可允許靶定病毒生命周期的各個(gè)階段[2]，并且介導(dǎo)持續(xù)、有效的對(duì)抗HIV的基因治療。比如說(shuō)，Cas9核酸酶聯(lián)合一個(gè)或多個(gè)靶向前病毒的gRNA，可以介導(dǎo)整合病毒基因組的切除；一種經(jīng)過(guò)修飾的核酸酶缺陷型Cas9與轉(zhuǎn)錄激活域融合，可定向激活前病毒的基因表達(dá)，從而清除體內(nèi)潛在的病毒。這種技術(shù)也可用于定向靶定宿主依賴(lài)的因素，如趨化因子輔助受體(chemokinco-receptors)CCR5[1,3-5]和CXCR4(201410770508.X)，從而阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞。HIV主要有R5-嗜性和X4-嗜性?xún)煞N，對(duì)應(yīng)的輔助受體分別為CCR5和CXCR4，R5-嗜性病毒是目前最普遍感染且在感染的前期起主導(dǎo)作用的病毒類(lèi)型。全球首例HIV感染的治愈發(fā)生在“柏林病人”身上，他接受了一名CCR5-Δ32基因突變純合體捐獻(xiàn)者的骨髓移植，此后的五年都沒(méi)有在其身上檢測(cè)到HIV病毒的蹤跡。2014年，利用ZFN技術(shù)對(duì)患者CD4+原代T細(xì)胞的CCR5基因進(jìn)行編輯的第一期臨床試驗(yàn)獲得成功[6]，為HIV的基因治療帶來(lái)新的突破。從此，對(duì)于HIV進(jìn)入人體細(xì)胞的主要趨化因子輔助受體——CCR5的基因編輯策略受到更廣泛的關(guān)注。HyunJanKang[4]等利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞的CCR5基因，篩選出CCR5突變純合子并誘導(dǎo)分化成造血細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞)，證明了誘導(dǎo)的造血細(xì)胞具有特異性抵抗R5嗜性病毒的能力。來(lái)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所的黃行許(201410149287.4)公開(kāi)了CRISPR-Cas9特異性敲除人CCR5基因的方法以及能夠精確靶向人CCR5基因并且實(shí)現(xiàn)基因敲除的sgRNA。自CRISPR/Cas9技術(shù)面世以來(lái)，該技術(shù)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外基因治療研究的熱點(diǎn)。到目前為止，國(guó)內(nèi)外已有很多科學(xué)家投身于CCR5基因敲除的研究，但是離臨床應(yīng)用還有很長(zhǎng)的距離。CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)基因敲除的有效性已經(jīng)得到廣泛的驗(yàn)證，目前急需要解決的是如何降低CRISPR/Cas9的脫靶效率，以確保臨床使用的安全性。在對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用的研究中，gRNA的設(shè)計(jì)一度成為研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外許多實(shí)驗(yàn)室和科學(xué)家投身于這一課題的研究[7-9]，開(kāi)發(fā)出多種在線(xiàn)或離線(xiàn)設(shè)計(jì)gRNA的軟件。對(duì)于gRNA的設(shè)計(jì)，即靶序列的選擇，必須滿(mǎn)足兩個(gè)條件：(1)靶序列的上游或下游具有PAM(protospacer-adjacentmotif)，因?yàn)镃a9對(duì)靶序列的識(shí)別有一個(gè)要求，就是結(jié)合位點(diǎn)附近必須有PAM區(qū)域，而來(lái)源不同的Cas9對(duì)PAM的序列又有不同的要求，例如最常用的來(lái)源于釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的Cas9，傾向于識(shí)別“5’-NGG”；(2)對(duì)于基因組的其他位點(diǎn)，靶序列是唯一的，即gRNA具有特異性。因?yàn)間RNA只由20nt左右的核苷酸組成，其中起主要作用的是靠近PAM的約12nt的核苷酸序列，在全基因組范圍內(nèi)，與此gRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列相似，即與靶序列具有一定同源性的序列可能有很多，所以gRNA很容易脫靶結(jié)合于非目的序列上，從而引起非預(yù)期的基因或功能性非編碼序列的突變，導(dǎo)致受基因編輯的細(xì)胞、組織或動(dòng)物出現(xiàn)非預(yù)期的毒副作用。這也是目前CRISPR/Cas9技術(shù)在臨床治療應(yīng)用上的弊端。因此，通過(guò)軟件把gRNA設(shè)計(jì)出來(lái)后，對(duì)gRNA的篩選才是CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用型研究和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的重中之重。這里所說(shuō)的篩選，一般的做法就是對(duì)軟件設(shè)計(jì)出來(lái)的gRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，通過(guò)體外甚至體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定在特定物種中的敲除效率和脫靶率，以評(píng)估該gRNA用于臨床治療利與弊?，F(xiàn)在普遍采用的篩選思路是根據(jù)目的基因的結(jié)構(gòu)和功能，選取靶定序列位于關(guān)鍵的功能性結(jié)構(gòu)域附近的gRNA(這種gRNA所引起的突變使得目的基因被敲除的可能性大大提高)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)評(píng)估體內(nèi)外的在靶效率/敲除效率和脫靶效率，擇優(yōu)選取敲除效率高而脫靶效率在可接受范圍內(nèi)的gRNA。ChangLi[3]等根據(jù)軟件評(píng)分和在靶率檢測(cè)，篩選出在靶效率較高的gRNA并對(duì)其潛在的脫靶位點(diǎn)進(jìn)行脫靶效率檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)跐撛诘拿摪形稽c(diǎn)均未造成明顯的突變效應(yīng)。然而，CRISPR/Cas9作為一種在臨床治療方面潛力無(wú)限的新興治療技術(shù)，其脫靶突變所引起的毒副作用正是限制其臨床應(yīng)用的瓶頸。在臨床應(yīng)用上，雖然常常同時(shí)強(qiáng)調(diào)“安全和有效”，但是“安全”往往被放在更加重要的位置，醫(yī)療“安全”也是全世界人民最為關(guān)注的問(wèn)題?，F(xiàn)在普遍采用的篩選思路沒(méi)有把脫靶效率作為最重要的選擇依據(jù)，而是更為重視敲除效率的提高。當(dāng)然，除了關(guān)注gRNA的脫靶效率，更應(yīng)該關(guān)注潛在脫靶基因的功能。當(dāng)脫靶突變不可避免時(shí)，應(yīng)盡量選擇潛在脫靶基因被敲除后毒副作用較小的gRNA。由于目的基因CCR5與CCR2、CCR3高度同源，大部分靶定CCR5的gRNA對(duì)CCR2和CCR3也有靶定作用，也就是說(shuō)CCR2和CCR3對(duì)于大部分設(shè)計(jì)出來(lái)的gRNA來(lái)說(shuō)，是可能性最大的潛在脫靶基因。然而，這兩個(gè)基因卻與人體非常重要的生理機(jī)能相關(guān)，他們的敲除甚至是致病性的。CCR2特異性的介導(dǎo)單核細(xì)胞的趨化性，與炎性疾病相關(guān)，如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并且參與腫瘤的炎癥應(yīng)答，而CCR2缺陷型的小鼠表現(xiàn)為加速化的老人癡呆癥樣病理癥狀。CCR3在寄生蟲(chóng)感染引起的呼吸道過(guò)敏癥中參與嗜酸性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞的聚集和活化。因此，脫靶于CCR2和CCR3可能會(huì)造成比較嚴(yán)重的毒副作用，應(yīng)盡量避免選擇與CCR2和CCR3有同源性的gRNA。然而，即使在臨床前的序列分析、體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的再安全、脫靶效率再低，真正應(yīng)用于臨床的時(shí)候也可能出現(xiàn)非預(yù)期的脫靶，這就要求選擇的gRNA其潛在的脫靶基因不會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的毒副作用?？偟膩?lái)說(shuō)，對(duì)脫靶效率的研究是CRISPR/Cas9的重要環(huán)節(jié)，影響著gRNA應(yīng)用的安全性，因此必須謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)和嚴(yán)格篩選gRNA[10]，并把脫靶效率研究提高到最重要的地位。在此基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步提高gRNA的在靶效率或敲除效率，盡可能的減少脫靶突變，科學(xué)家們還提出了很多優(yōu)化方法，例如：利用兩個(gè)或多個(gè)gRNA同時(shí)靶定目的序列，同時(shí)切割多個(gè)位點(diǎn)，造成目的序列大片段缺失，或多位點(diǎn)缺失，提高移碼突變的可能性，即提高敲除效率；縮短gRNA的長(zhǎng)度，提高gRNA的在靶率；延長(zhǎng)gRNA的長(zhǎng)度，增加gRNA的特異性；適當(dāng)延長(zhǎng)Cas9綁定序列g(shù)RNAscaffold的長(zhǎng)度，提高Cas9和gRNAscaffold的結(jié)合效率，從而提高在靶率和敲除效率；改變gRNAscaffold的堿基序列，提高gRNA轉(zhuǎn)錄活性，從而提高在靶率和敲除效率等。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種分離的多核苷酸，其編碼用于HIV感染基因治療的引導(dǎo)RNA(gRNA)。本發(fā)明也包括含有所述多核苷酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供所述多核苷酸在制備治療艾滋病病毒感染的藥物中的應(yīng)用。可以將本發(fā)明的多核苷酸單獨(dú)或與編碼另一個(gè)或多個(gè)gRNA的多核苷酸結(jié)合使用。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供包含所述多核苷酸和加長(zhǎng)型的gRNAscaffold的優(yōu)化的多核苷酸和其用途。本發(fā)明有別于普遍采用的篩選思路，以選取脫靶效率最低的gRNA為出發(fā)點(diǎn)，從軟件設(shè)計(jì)出來(lái)的gRNA中，挑選潛在脫靶效率較低的gRNA(全基因組序列比對(duì)后，潛在脫靶位點(diǎn)位于基因的內(nèi)含子或非編碼區(qū)的、PAM為非“NGG”組成的、或者種子區(qū)域內(nèi)與潛在脫靶位點(diǎn)不完全配對(duì)的)，再設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)評(píng)估其在靶/敲除效率，以及驗(yàn)證脫靶效率。在一開(kāi)始的篩選中，已經(jīng)把那些敲除效率很高但是潛在的脫靶突變也很強(qiáng)的gRNA篩除了，在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中除了測(cè)試在靶/敲除效率，更重要的是選取脫靶可能性最大的基因(或者多個(gè)脫靶可能性相對(duì)較大的基因)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)評(píng)估其真實(shí)的脫靶突變的可能性，而不僅僅停留在軟件分析預(yù)測(cè)脫靶突變的層面。然后，進(jìn)一步的，在脫靶突變程度可以接受的范圍內(nèi)，再選取可以有效敲除目的基因的gRNA。從而在安全的基礎(chǔ)上進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)治療的有效性。根據(jù)本發(fā)明的一方面，編碼用于HIV感染基因治療的引導(dǎo)RNA(gRNA)的多核苷酸，其DNA序列為SEQIDNO.3所示的序列；編碼的相應(yīng)RNA序列為SEQIDNO.8所示的序列。本發(fā)明采用軟件設(shè)計(jì)靶向敲除CCR5基因的gRNA，根據(jù)潛在脫靶位點(diǎn)從中挑取5條脫靶可能性較低的gRNA，在293T細(xì)胞中進(jìn)行在靶效率以及脫靶效率分析，由sanger測(cè)序結(jié)果從中篩選出3條gRNA，并進(jìn)一步用NGS測(cè)序分析其在靶和脫靶效率，從中選取1條在靶效率高且脫靶效率低的gRNA。。本發(fā)明的gRNA，與其他gRNA相比在靶效率高，而脫靶效率低，有望作為HIV感染基因治療的新工具。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，可通過(guò)基因工程手段，利用本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建各種表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化宿主，因此含有本發(fā)明的多核苷酸的各種表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化宿主以及各中間載體和宿主也屬于本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。本發(fā)明也提供上述編碼gRNA的多核苷酸與編碼另一種或幾種gRNA的多核苷酸組合使用的方式，可以將本發(fā)明的SEQIDNO.1至SEQIDNO.5的編碼5個(gè)gRNA的多核苷酸相互組合，例如將SEQIDNO.3所示的多核苷酸與選自SEQIDNO.1,SEQIDNO.2,SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的一個(gè)或幾個(gè)多核苷酸進(jìn)行組合作為引導(dǎo)序列，組合使用的gRNA在靶效率有明顯提高的同時(shí)，脫靶率沒(méi)有變化。上述組合使用可以是分別構(gòu)建包含各多核苷酸的表達(dá)載體，將各表達(dá)載體組合后轉(zhuǎn)化細(xì)胞，也可以是將各多核苷酸共同構(gòu)建入同一表達(dá)載體中轉(zhuǎn)化細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供上述編碼引導(dǎo)RNA的多核苷酸在制備治療艾滋病病毒感染的藥物中的應(yīng)用。在艾滋病的基因治療中，可將本發(fā)明的gRNA作為向?qū)蛄?，靶向人CCR5基因并且實(shí)現(xiàn)基因敲除。CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被用于一些特殊的基因疾病的研究，而對(duì)HIV特異性輔助受體CCR5的敲除，還處于起始階段。有別于現(xiàn)在已經(jīng)臨床試用的ZFN技術(shù)對(duì)CCR5基因的敲除，CRISPR/Cas9的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加簡(jiǎn)單，gRNA的合成也更加方便，且價(jià)格低廉，適于大量應(yīng)用。然而CRISPR/Cas9可能會(huì)存在脫靶剪切，導(dǎo)致非目的基因的破壞，引起預(yù)期外的毒副作用。因此，謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)gRNA序列，并且對(duì)gRNA序列的脫靶效率進(jìn)行深入研究顯得尤為重要。本發(fā)明針對(duì)CCR5蛋白設(shè)計(jì)gRNA序列，并將設(shè)計(jì)出來(lái)的gRNA序列在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行序列比對(duì)，尋找可能的脫靶位點(diǎn)，尤其是PAM附近的12個(gè)堿基對(duì)在靶和脫靶的影響尤為重要。在可能的脫靶位點(diǎn)中，分析哪些是外顯子，哪些是內(nèi)含子或非編碼序列，因?yàn)橥怙@子的破壞直接關(guān)系到功能基因的剪切，危害性更大。對(duì)分析后確定的危害最大的、脫靶可能性最大的脫靶位點(diǎn)采取實(shí)驗(yàn)的手段進(jìn)行進(jìn)一步的分析，確定gRNA對(duì)脫靶位點(diǎn)的基因敲除效率。最后根據(jù)對(duì)CCR5的在靶效率以及對(duì)非預(yù)期基因的脫靶效率，綜合評(píng)估gRNA的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種經(jīng)序列優(yōu)化的多核苷酸，將編碼上述gRNA的多核苷酸與gRNAscaffold序列結(jié)合，并對(duì)gRNAscaffold序列進(jìn)行優(yōu)化，獲得序列優(yōu)化的多核苷酸，其對(duì)應(yīng)的DNA序列如SEQIDNO.14所述，編碼轉(zhuǎn)錄后的RNA序列如SEQIDNO.13所示，經(jīng)序列優(yōu)化后，本發(fā)明的gRNA可在脫靶效率保持低水平的情況下，在靶效率能有效提高。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，含有所述gRNA的載體、宿主，以及所述序列優(yōu)化的多核苷酸在制備治療艾滋病藥物的用途也相應(yīng)地屬于本發(fā)明的內(nèi)容。有益效果：相較于其它多核苷酸，本發(fā)明的多核苷酸G3單獨(dú)使用的在靶突變效率最高，且脫靶突變效率最低。將本發(fā)明的多核苷酸G3和其它多核苷酸組合使用，可以大大提高對(duì)CCR5基因的在靶突變效率，且不會(huì)提高脫靶突變效率。本發(fā)明提供的序列優(yōu)化的多核苷酸，是在原有的gRNAscaffold基礎(chǔ)上改進(jìn)序列，然后將改進(jìn)的gRNAscaffold和G3結(jié)合為一種嵌合多核苷酸，上述多核苷酸對(duì)CCR5基因的在靶突變效率有所提高。附圖說(shuō)明圖1為多核苷酸對(duì)應(yīng)的帶粘性末端的雙鏈DNA序列；圖2為多核苷酸對(duì)HEK293T細(xì)胞CCR5基因的突變效率比較(sanger測(cè)序圖)；圖3為PX458質(zhì)粒圖譜；圖4為G3和G1組合、G3和G2組合以及G3對(duì)CCR5的在靶效率分析；其中：泳道1：PX458-G3和PX458-G1共轉(zhuǎn)化在293T細(xì)胞中的在靶突變效率；2：PX458-G3和PX458-G2共轉(zhuǎn)化在293T細(xì)胞中的在靶突變效率；3：PX458-G3在293T細(xì)胞中的在靶突變效率；4：mock；5：markerDL1000(TaKaRa)；圖5為G3和G1組合、G3和G2組合共轉(zhuǎn)化與G1、G2、G3單獨(dú)轉(zhuǎn)化的脫靶效率比較；其中：泳道1：G3和G1組合對(duì)INTS7基因的脫靶突變效率；2：G3和G1組合對(duì)CCR3基因的脫靶突變效率；3：G1對(duì)CCR3基因的脫靶突變效率；4：G3對(duì)INTS7基因的脫靶突變效率；5：mock；6：G3對(duì)INTS7基因的脫靶突變效率；7：G2對(duì)CCR3基因的脫靶突變效率；8：G3和G2組合對(duì)CCR3基因的脫靶突變效率；9：G3和G2組合對(duì)INTS7基因的脫靶突變效率。圖6為PX458eL-gRNA質(zhì)粒圖譜；圖7為PX458-G3和PX458eL-G3的在靶突變效率比較；其中：泳道1：PX458-G3在293T細(xì)胞中的突變效率；2：PX458eL-G3在293T細(xì)胞中的突變效率；3：mock；4：markerDL1000(TaKaRa)。圖8為原gRNAscaffold和加長(zhǎng)型的gRNAscaffold對(duì)應(yīng)關(guān)系。具體實(shí)施方式一、多核苷酸的設(shè)計(jì)和篩選以下通過(guò)對(duì)本發(fā)明較佳實(shí)施方式的詳細(xì)描述，說(shuō)明但不限制本發(fā)明。試劑盒和遺傳材料：轉(zhuǎn)染試劑盒l(wèi)ipofectamine3000(賽默飛世爾科技)、重組酶試劑盒“ClonExpressIIOneStepCloningKit”(南京諾唯贊生物科技有限公司)、PX458(來(lái)源于A(yíng)ddgene，武漢淼靈生物科技有限公司代理)、pGSI(廣州艾基生物技術(shù)有限公司)、Top10大腸桿菌感受態(tài)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、HEK293T(ATCC保藏，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。其他的試劑材料等均為市售材料。本發(fā)明方案的建立：(1)軟件設(shè)計(jì)用于敲除CCR5基因的編碼gRNA的多核苷酸，根據(jù)潛在脫靶位點(diǎn)的功能和脫靶的可能性(即gRNA與脫靶位點(diǎn)的匹配程度),初步篩選出5條多核苷酸序列,它們對(duì)應(yīng)的序列分別為：G1：TCATCCTCCTGACAATCGAT(SEQIDNO.1)G2：CCTGACAATCGATAGGTACC(SEQIDNO.2)G3：ACAATGTGTCAACTCTTGAC(SEQIDNO.3)G4：CATACAGTCAGTATCAATTC(SEQIDNO.4)G5：GGTCCTGCCGCTGCTTGTCA(SEQIDNO.5)它們編碼的gRNA序列分別為：UCAUCCUCCUGACAAUCGAU(SEQIDNO.6)CCUGACAAUCGAUAGGUACC(SEQIDNO.7)ACAAUGUGUCAACUCUUGAC(SEQIDNO.8)CAUACAGUCAGUAUCAAUUC(SEQIDNO.9)GGUCCUGCCGCUGCUUGUCA(SEQIDNO.10)(2)合成上述5條多核苷酸序列；(3)分別將上述編碼gRNA的多核苷酸克隆至pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)載體的g(N)20gRNA位置，形成5個(gè)質(zhì)粒：PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5；(4)將PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5分別轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞，并對(duì)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞進(jìn)行sanger測(cè)序初步分析各個(gè)gRNA的在靶效率；(5)根據(jù)sanger測(cè)序結(jié)果，初步選出3條在靶效率較高的質(zhì)粒，分別為PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3。(6)對(duì)G1、G2、G3這三條篩選出來(lái)的多核苷酸進(jìn)行全基因組序列比對(duì)，根據(jù)PAM序列、同源性(尤其是近PAM的12個(gè)堿基)，以及是否脫靶于外顯子位置等，選擇脫靶可能性最高的潛在脫靶序列；(7)用PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3分別轉(zhuǎn)HEK293T細(xì)胞，對(duì)CCR5基因和上述篩選出來(lái)的脫靶可能性最高的潛在脫靶序列進(jìn)行NGS測(cè)序，精確分析各自編碼出的gRNA在293T細(xì)胞中的脫靶效率和在靶效率；(8)選取脫靶效率最低、在靶效率最好的多核苷酸序列，即G3，用于后續(xù)的優(yōu)化和驗(yàn)證。本發(fā)明涉及的G3，對(duì)其脫靶位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和分析如表1所示(主要列出脫靶于基因外顯子的情況)。由表中的配對(duì)情況可見(jiàn)，其所編碼的gRNA的種子區(qū)內(nèi)與脫靶位點(diǎn)匹配程度低，所以脫靶的可能性較小。另外，臨床治療針對(duì)的是體內(nèi)局部組織和細(xì)胞，被敲除的基因是否在接受治療的細(xì)胞或組織中特異性表達(dá)或致病，都是臨床治療安全性必須考慮的因素。表1G3潛在脫靶位點(diǎn)功能分析注：“|”表示該多核苷酸編碼的gRNA的位點(diǎn)與脫靶基因可配對(duì)；“—”表示不匹配；“[]”表示種子區(qū)域。二、多核苷酸的組合使用(1)分別合成G3或者其他多核苷酸雙鏈序列；(2)分別插入PX458載體的g(N)20gRNA位置，形成PX458-G3和其他PX458與多核苷酸的嵌合載體；(3)用PX458-G3和其他PX458與多核苷酸的嵌合載體共同轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞，可以是用兩個(gè)或者兩個(gè)以上的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞，其中必須包含PX458-G3；(4)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞提取基因組，對(duì)CCR5基因進(jìn)行PCR后，收集PCR產(chǎn)物用T7核酸內(nèi)切酶酶切，分析G3和其他多核苷酸共同作用于CCR5基因的在靶效率；(5)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞提取基因組，對(duì)G3和其他共同轉(zhuǎn)化的多核苷酸所潛在的脫靶基因進(jìn)行PCR后，收集PCR產(chǎn)物用T7核酸內(nèi)切酶酶切，分析G3和其他共同轉(zhuǎn)化的多核苷酸的綜合脫靶效率。三、多核苷酸的優(yōu)化(1)合成G3雙鏈序列，插入PX458載體的g(N)20gRNA位置，形成PX458-G3；(2)在PX458-G3的gRNAscaffold序列的第13bp的位置插入“5’-TGCTG”5個(gè)核苷酸，在第17bp的位置插入“5’-CAGCA”5個(gè)核苷酸，形成加長(zhǎng)型的gRNAscaffold，然后把gRNAscaffold的第5bp的核苷酸T，替換成任意核苷酸N(A、T、G或C)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒命名為PX458eL-G3；原gRNAscaffoldSEQIDNO.11和加長(zhǎng)型的gRNAscaffoldSEQIDNO.12對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖8所示；原gRNAscaffold序列：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQIDNO.11)加長(zhǎng)型的gRNAscaffold序列：GTTTNAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQIDNO.12)(3)用PX458eL-G3轉(zhuǎn)化293T細(xì)胞；(4)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞提取基因組，對(duì)CCR5基因和潛在的脫靶基因進(jìn)行PCR后，收集PCR產(chǎn)物用T7核酸內(nèi)切酶酶切，分析PX458eL-G3的在靶效率和脫靶效率。因此，本發(fā)明也涉及將G3與上述優(yōu)化的gRNAscaffold結(jié)合為嵌合多核苷酸，其序列如下：ACAATGTGTCAACTCTTGACGTTTNAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(SEQIDNO.14)其編碼的RNA序列為：ACAAUGUGUCAACUCUUGACGUUUNAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQIDNO.13)實(shí)施例1多核苷酸的設(shè)計(jì)和篩選1.1通過(guò)軟件設(shè)計(jì)用于敲除人類(lèi)CCR5基因的編碼gRNA的多核苷酸，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)的脫靶位點(diǎn)，從中篩選出5條脫靶作用較小的多核苷酸，如表2所示；表2多核苷酸序列及潛在脫靶基因1.2分別合成G1～G5對(duì)應(yīng)正義鏈，以及相對(duì)應(yīng)的反義鏈，同時(shí)在正義鏈的5'端添加CACCG，反義鏈的5'端添加AAAC，反義鏈的3'端添加C。將上述正義鏈和對(duì)應(yīng)的反義鏈經(jīng)加熱后退火，形成雙鏈DNA序列，如圖1所示；1.3用BbsI酶對(duì)pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)(圖3)載體酶切線(xiàn)性化；1.4將合成的帶粘性末端的雙鏈DNA序列與線(xiàn)性化的PX458載體用T4連接酶連接，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞；1.5轉(zhuǎn)化后的Top10感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)1h后，涂布氨芐青霉素LB平板，培養(yǎng)24小時(shí)以上；1.6挑取單菌落，接種至氨芐青霉素LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體提取質(zhì)粒進(jìn)行sanger測(cè)序，測(cè)序引物為表3中SeqForward和SeqReverse；1.7根據(jù)測(cè)序結(jié)果選取陽(yáng)性克隆菌，用氨芐青霉素LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)；1.8收集擴(kuò)大培養(yǎng)的菌體，提取質(zhì)粒PX458-Gx(x代表多核苷酸編號(hào)，即PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3、PX458-G4、PX458-G5)；1.9使用試劑盒l(wèi)ipofectamine3000，分別用質(zhì)粒PX458-Gx轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞；1.10對(duì)轉(zhuǎn)化后的HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)48小時(shí)后收集細(xì)胞，提取基因組；1.11對(duì)上述各組細(xì)胞的基因組進(jìn)行sanger測(cè)序(測(cè)序引物見(jiàn)表3),對(duì)PX458-G1、PX458-G2和PX458-G3轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞用引物G1G2G3Forward和G1G2G3Reward進(jìn)行測(cè)序，對(duì)PX458-G4轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用引物G4Forward單向測(cè)序，對(duì)PX458-G5轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用引物G5Reverse單向測(cè)序，以測(cè)序結(jié)果圖初步判斷各個(gè)gRNA對(duì)HEK293T細(xì)胞CCR5基因的突變效率，結(jié)果見(jiàn)圖2；表3引物序列表名稱(chēng)序列SeqForward5'-ATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3'(SEQIDNO.22)SeqReverse5'-GGTAATAGCGATGACTAATA-3'(SEQIDNO.23)G1G2G3Forward5'-CTGACATCTACCTGCTCAAC-3'(SEQIDNO.24)G1G2G3Reward5'-GCTGCAGGTGTAATGAAGAC-3'(SEQIDNO.25)G4Forward5'-ACTTGGGTGGTGGCTGTGTT-3'(SEQIDNO.26)G5Reverse5'-CTTGGTCCAACCTGTTAGAG-3'(SEQIDNO.27)1.12根據(jù)sanger測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)G1、G2、G3的突變效率較高，選擇PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3再次轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測(cè)定轉(zhuǎn)化效率(轉(zhuǎn)化率約為80％)，并對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行NGS測(cè)序，精確測(cè)定G1、G2、G3對(duì)CCR5基因的在靶效率，結(jié)果如表4所示。表4G1、G2、G3對(duì)CCR5基因的在靶效率1.13對(duì)G1、G2、G3在全基因組范圍內(nèi)比對(duì)潛在脫靶位點(diǎn)，優(yōu)先考慮PAM序列為NGG，且種子區(qū)域內(nèi)(離PAM最近的12nt)同源性最高的外顯子序列，篩選的潛在脫靶基因見(jiàn)表5；表5脫靶可能性最大的潛在脫靶位點(diǎn)多核苷酸序號(hào)脫靶基因PAM同源性分析G1CCR3AGG|-|||||-[|||||||||||-]PAMG2CCR3TGG-|||||||[||||-|||||||]PAMG3INTS7TGG||||-||-[||||||--||||]PAM注：“|”表示該多核苷酸編碼的gRNA位點(diǎn)與脫靶基因可配對(duì)；“—”表示不匹配；“[]”表示種子區(qū)域。1.14對(duì)轉(zhuǎn)化后的HEK293T細(xì)胞的潛在脫靶基因進(jìn)行NGS測(cè)序，精確測(cè)定G1、G2、G3對(duì)潛在脫靶基因的脫靶效率，結(jié)果見(jiàn)表6。表6G1、G2、G3對(duì)潛在脫靶基因的脫靶效率實(shí)施例2多核苷酸的組合使用2.1提取從上述實(shí)施例1中篩選獲得的質(zhì)粒，PX458-G1、PX458-G2、PX458-G3；2.2將PX458-G1和PX458-G3，PX458-G2和PX458-G3分別共轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞；2.3轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)48小時(shí)，收集細(xì)胞，提取基因組DNA；2.4用PCR法擴(kuò)增(引物見(jiàn)表3的G1G2G3Forward和G1G2G3Reward)各組細(xì)胞的CCR5基因中含靶序列的片段；2.5收集上述PCR產(chǎn)物后，用T7內(nèi)切核酸酶法進(jìn)行突變效率分析，結(jié)果如圖4所示。2.6用灰度分析軟件(imageJ)對(duì)圖4每個(gè)泳道的酶切效率進(jìn)行分析比較，即可分析出多核苷酸在靶效率，結(jié)果如表7；表7G3和G1組合、G3和G2組合以及G3對(duì)CCR5的在靶效率序號(hào)多核苷酸敲除效率1G3+G122.99％2G3+G231.70％3G316.46％從表7的結(jié)果可知，將G3和G1組合，或者G3和G2組合使用，可以大大提高對(duì)CCR5基因的在靶突變效率。2.7以PX458-G1和PX458-G3組合，PX458-G2和PX458-G3組合分別共轉(zhuǎn)化的HEK293T細(xì)胞的基因組DNA為模板，用PCR法(引物見(jiàn)表8)擴(kuò)增各靶點(diǎn)潛在的脫靶基因中含脫靶位點(diǎn)的片段；表8脫靶基因CCR3和INTS7的PCR引物CCR31-fatccctaggctgctatcaca(SEQIDNO.28)CCR31-rttgctccgctcacagtcatt(SEQIDNO.29)INTS71-fTGCTTGCAGCGTCATCTTTG(SEQIDNO.30)INTS71-rTGTTCTGAGGCAACCTGAGTC(SEQIDNO.31)2.8回收上述含脫靶位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物后，用T7內(nèi)切核酸酶法進(jìn)行脫靶位點(diǎn)的突變效率分析，結(jié)果如圖5所示：從圖5可知，G3和G1組合、G3和G2組合，兩條多核苷酸同時(shí)使用與單獨(dú)使用G1、G2、G3相比，脫靶效率并沒(méi)有明顯提高。實(shí)施例3多核苷酸的優(yōu)化3.1合成編碼gRNA-EX的雙鏈DNA片段，上述DNA片段是以如SEQIDNO.12所示加長(zhǎng)型的gRNAscaffold為基礎(chǔ)，在其兩側(cè)分別附加一段與pX458質(zhì)粒兩個(gè)酶切位點(diǎn)對(duì)應(yīng)的同源序列而成，其正義鏈如下：AACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTATGCTGGAAACAGCATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTTTTAGCGCGTGCGCCAATTCTGCAGACAAATGGCTCTAGAGG(SEQIDNO.32)3.2取pGSI質(zhì)粒進(jìn)行SmaI單酶切，與上述雙鏈DNA片段連接，轉(zhuǎn)化Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布Amp平板，培養(yǎng)24小時(shí)后挑取菌落進(jìn)行Sanger測(cè)序，選取測(cè)序正確的單克隆(命名為pGSI-gRNA-EX)擴(kuò)大培養(yǎng)；3.3提取pGSI-gRNA-EX質(zhì)粒；3.4設(shè)計(jì)并合成表9所示的引物，以pGSI-gRNA-EX為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取用于替換pX458中原始gRNAscaffold的同源DNA片段；(注：將被替換優(yōu)化gRNAscaffold后的pX458命名為pX458eL)表9pX458eL替換片段擴(kuò)增引物pX458eL-F5'-TGTGGAAAGGACGAAAcaccGGgtcttcGAGAAG-3'(SEQIDNO.33)pX458eL-R5'-TATGTAACGGGTACCtctagaGCCATTTGTCTGCAG-3'(SEQIDNO.34)3.5回收上述PCR產(chǎn)物(用于替換pX458中原始gRNAscaffold的同源DNA片段)；3.6提取pX458質(zhì)粒，以BbsI和XbaI對(duì)pX458進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收酶切后的線(xiàn)性化pX458質(zhì)粒(pX458質(zhì)粒的gRNAscaffold如SEQIDNO.11所示)；3.7將上述酶切后的線(xiàn)性化pX458質(zhì)粒與上述同源DNA片段進(jìn)行同源重組(使用重組酶試劑盒“ClonExpressIIOneStepCloningKit”)；3.8將上述重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)1h后涂布氨芐青霉素LB平板，培養(yǎng)24小時(shí)以上挑選單菌落進(jìn)行sanger測(cè)序(以SeqForward為引物)；3.9選取上述測(cè)序正確的質(zhì)粒擴(kuò)大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，即為pX458eL(圖6)；3.10參考實(shí)施例1.2-1.7的步驟，將G3連接于pX458eL，形成pX458eL-G3，pX458eL-G3中的嵌合多核苷酸序列如SEQIDNO.14所示。3.11用pX458-G3和pX458eL-G3分別轉(zhuǎn)化HEK293T細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)化的HEK293T細(xì)胞為對(duì)照；3.12收集上述細(xì)胞，提取基因組，對(duì)CCR5基因中含靶序列的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3.13收集上述PCR產(chǎn)物后，用T7內(nèi)切核酸酶法進(jìn)行突變效率分析，結(jié)果如圖7所示；3.14用灰度分析軟件(imageJ)對(duì)圖7每道的酶切效率進(jìn)行分析比較，結(jié)果如表10。表10PX458-G3和PX458eL-G3的在靶突變效率序列質(zhì)粒敲除效率1PX458-G313.48％2PX458eL-G319.33％從表10結(jié)果可知，延長(zhǎng)了gRNAscaffold之后的PX458eL-G3，比起PX458-G3，對(duì)CCR5基因的敲除效率有所提高。以上對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在此基礎(chǔ)上做出各種改變和變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。參考文獻(xiàn)[7]N.Wong,W.Liu,X.Wang.WU-CRISPR:characteristicsoffunctionalguideRNAsfortheCRISPR/Cas9system[J].GenomeBiol,2015,16:1-8.[8]M.V.Wiles,W.Qin,A.W.Cheng,etal.CRISPR-Cas9-mediatedgenomeeditingandguideRNAdesign[J].MammGenome,2015,26(9-10):501-10.[9]Y.Naito,K.Hino,H.Bono,etal.CRISPRdirect:softwarefordesigningCRISPR/CasguideRNAwithreducedoff-targetsites[J].Bioinformatics,2015,31(7):1120-3.[2]S.Saayman,S.A.Ali,K.V.Morris,etal.ThetherapeuticapplicationofCRISPR/Cas9technologiesforHIV[J].ExpertOpinBiolTher,2015,15(6):819-30.[3]C.Li,X.Guan,T.Du,etal.InhibitionofHIV-1infectionofprimaryCD4+T-cellsbygeneeditingofCCR5usingadenovirus-d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