本發(fā)明涉及基因檢測方法。尤其是涉及一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，我國惡性腫瘤的發(fā)生率和病死率呈明顯上升趨勢，已躍居我國居民死亡病因的首位。然而，對于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷以及防治，尚無突破性研究，部分患者就診時已處于中晚期，療效較差。因此，提高惡性腫瘤的早期診斷水平，是改善惡性腫瘤診治療效的有效出路。目前臨床上，多采用血清學(xué)檢測的方法監(jiān)測血清或其他體液中的腫瘤標(biāo)志物，動態(tài)地對腫瘤的存在、發(fā)生發(fā)展及預(yù)后做出判斷。然而，任何一種科學(xué)指標(biāo)都不是絕對的。腫瘤標(biāo)志物的器官特異性和腫瘤特異性較差,既存在于腫瘤中也存在于正常人群和非腫瘤患者血液和體液中,每個人對于腫瘤標(biāo)志物都有各自的基礎(chǔ)水平,不能單憑超過參考范圍而進(jìn)行診斷。有時要借助相關(guān)輔助檢查,對檢測結(jié)果進(jìn)行仔細(xì)分析后,才能提高對腫瘤的存在、發(fā)展及預(yù)后的實(shí)用價值。同時，腫瘤標(biāo)志物濃度會受到體內(nèi)代謝的很多因素影響，所以準(zhǔn)確性也會受到影響。以腫瘤標(biāo)記物甲胎蛋白(AFP)為例，除絕大多數(shù)肝癌病人的血清呈陽性外，還有31％～52％的急性肝炎、15％～58％的慢性肝炎以及11％～47％的肝硬化病人的AFP也會有大幅上升，因此不必一看到“陽性”就“色變”。當(dāng)然，與此同時，甲胎蛋白陰性自感不適的患者也不能掉以輕心，還要依靠大夫聯(lián)合多項檢查直至細(xì)胞學(xué)、病理學(xué)檢查等做進(jìn)一步查實(shí)和鑒別?；蚴蔷哂羞z傳效應(yīng)的DNA片段，支持著生命的基本構(gòu)造和性能?；螂m然十分穩(wěn)定，能在細(xì)胞分裂時精確地復(fù)制自己，但這種穩(wěn)定性是相對的。在一定的條件下基因也可以從原來的存在形式突然改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點(diǎn)上，突然出現(xiàn)了一個新基因，代替了原有基因，這個基因叫做突變基因。無論是堿基置換突變還是移碼突變，都能使多肽鏈中的氨基酸組成或順序發(fā)生改變，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)或酶的生物功能，使機(jī)體的表型出現(xiàn)異常。因此，對基因的突變進(jìn)行檢測，能夠在疾病發(fā)生的早期階段被檢測出，有利于實(shí)現(xiàn)疾病的早發(fā)現(xiàn)，早診斷，早治療。HRM(高分辨率熔解曲線分析)是近幾年來在國外興起的一種用于突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠?qū)崿F(xiàn)真正的閉管操作。比起普通的技術(shù)來說有更好的靈敏性和特異性。采用這種方法進(jìn)行的突變的檢測不依賴于突變在片段中所在的位置。當(dāng)片段的大小在400bp或者更小時，靈敏性最高。對于目前絕大多數(shù)的突變分析方法來說，都很難鑒定出純合子序列突變。在一些不同種類的小的擴(kuò)增片段中，高分辨率熔解曲線則顯示出了鑒定純合子序列突變的能力，這種方法能鑒定出大多數(shù)的純合突變。美中不足的是在進(jìn)行未知突變篩查、掃描時，只能檢測到有無突變，無法確定突變在DNA片段中位置。觸底PCR(Touchdown(TD)PCR)是一種特殊技術(shù)，只需要做一次正式實(shí)驗，就可能保證此次擴(kuò)增試驗在即使不是最佳也是在比較理想的條件下進(jìn)行的，絕大多數(shù)情況下都可以獲得理想的擴(kuò)增效果。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的技術(shù)目的是提供一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，其不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，能夠?qū)崿F(xiàn)真正的閉管操作。同時針對人群快速篩查，具有高通量、速度快、可試劑盒化、檢測成本低等特點(diǎn)。一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，包括以下步驟：(1)提取外周血樣品基因組DNA；(2)設(shè)計合成用于擴(kuò)增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對；(3)使用上述引物對樣品基因組DNA進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析聯(lián)合觸底PCR，95℃預(yù)變性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50個循環(huán)；95℃1min，40℃1min，從65℃開始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲線，到95℃，之后40℃10s結(jié)束，用分析軟件對采集后的曲線進(jìn)行分析；(4)HRM曲線分析：如相對于陰性對照出現(xiàn)了單獨(dú)的峰，則為陽性結(jié)果，表明發(fā)生P53基因突變。例如附圖1、圖2、圖3中箭頭所示，相對于陰性對照出現(xiàn)一個單獨(dú)的峰，為陽性結(jié)果，可以表明存在P53基因突變。所述步驟(2)中的特異性引物，是針對P53基因外顯子5-8特別設(shè)計的引物，經(jīng)過反復(fù)試驗篩選和驗證，最終篩選得到，具有特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高等優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)選的核苷酸序列分別是：所述步驟(3)中PCR的反應(yīng)體系優(yōu)選的是：總體積為15μL的反應(yīng)體系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；正向引物1μL；反向引物1μL，其余為RNasefreeH2O。反應(yīng)時，向所述反應(yīng)體系中加入樣品基因組DNA、陰性對照、空白對照進(jìn)行觸底PCR反應(yīng)，其中陰性對照是P53野生型序列，空白對照是無DNA模板。本發(fā)明的檢測方法，還有一個明顯的技術(shù)特征是，所述步驟(1)中外周血樣品采用干血片收集。只需要0.5mL的外周血即可，對于待檢者來說，具有可長途運(yùn)輸、保存時間長、采血簡單等優(yōu)點(diǎn)，是基因檢測技術(shù)中一項重大的改進(jìn)。同時步驟(1)中樣品基因組DNA的提取可采用商品化試劑盒提取。操作簡單易行，也方便高通量檢測時使用。本發(fā)明的檢測方法可用于快速篩查P53基因外顯子5-8突變。利用HRM聯(lián)合觸底PCR的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)在同一實(shí)驗條件下，對干血片中提取得到的待檢人群的DNA中P53基因多個外顯子的突變進(jìn)行檢測。實(shí)驗顯示，通過對200例實(shí)驗人群血液中P53基因5-8外顯子進(jìn)行檢測，能夠成功檢測到3例受檢者血液DNA中P53基因存在突變，之后運(yùn)用一代測序法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測并與人類基因組序列進(jìn)行比對后證實(shí)，這3例樣本確實(shí)存在DNA序列上的改變。證明了本發(fā)明方法的正確性。本發(fā)明的檢測方法可以應(yīng)用在任意一種快速篩查P53基因突變檢測試劑盒中。優(yōu)選包含用于擴(kuò)增P53基因外顯子5-8的特異性引物共4對，其核苷酸序列分別如上表所示。檢測試劑盒還含有PCR試劑、陰性對照、空白對照，其中陰性對照是P53野生型序列，空白對照是無DNA模板。本發(fā)明的試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)全部引物能在同一溫度下進(jìn)行穩(wěn)定的PCR反應(yīng)，獲取特異性的P53基因片段；(2)檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)；(3)小反應(yīng)體系(15μL)，標(biāo)本和試劑用量少；(4)采用檢測樣本為外周血干血片，采集容易，保存時間長，運(yùn)輸容易；(5)反應(yīng)簡便迅速，2小時即可獲得實(shí)驗結(jié)果，便于大樣本高通量處理；(6)試劑價格低廉，成本低。附圖說明圖1為實(shí)施例2中第68號樣本的HRM溶解曲線圖；圖2為實(shí)施例2中第105號樣本的HRM溶解曲線圖；圖3為實(shí)施例2中第160號樣本的HRM溶解曲線圖；圖4為實(shí)施例2中第68號樣本的測序結(jié)果圖；圖5為實(shí)施例2中第105號樣本的測序結(jié)果圖；圖6為實(shí)施例2中第160號樣本的測序結(jié)果圖；圖7為實(shí)施例2中陰性樣本的HRM溶解曲線圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1一種快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法，包括以下步驟：(1)干血片DNA的提取總DNA提取按照磁珠法干血斑基因組DNA提取試劑盒(天根)說明書進(jìn)行，如下：1、取一塊新的96孔深孔板，然后在每孔加入三片3*3mm的干血斑樣品。在96深孔板中加入200μL的緩沖液GA。2、加入20μL蛋白酶K溶液，渦旋震蕩10秒混勻后，放入預(yù)熱至56度的恒溫振蕩器中，900rpm恒溫震蕩裂解30分鐘。3、在上一步樣品裂解期間，向新的96孔深孔板中加入10μL磁珠懸浮液G，200μL緩沖液GB和200μL無水乙醇，抽打混勻或震蕩混勻10秒。4、樣品裂解后，將步驟3中深孔板短暫離心，冰箱裂解液完全移至步驟4中的深孔板，然后將其放入恒溫振蕩器，室溫900rpm震蕩3分鐘。5、將深孔板放置于磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。6、將深孔板放置于磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。7、將深孔板從磁力架上取下，加入500μL緩沖液GD，抽打混勻或震蕩混勻。8、將深孔板放置于磁力架上靜置1分鐘，待磁珠完全吸附時小心去除液體。9、將深孔板從磁力架上取下，加入500μL漂洗液PW，抽打混勻或振蕩混勻3分鐘。10、將深孔板放置于磁力架上靜置1分鐘，帶磁珠完全吸附時小心去除液體，使磁珠繼續(xù)被吸附。11、緩慢加入750μL漂洗液PWIII，盡量不要沖起磁珠，靜置20秒后用移液器小心去除液體，取下深孔板。12、加入50-100μL洗脫緩沖液TB或去離子水，抽打混勻或振蕩混勻，置于56度，孵育5-10分鐘。13、將深孔板放置于磁力架上靜置2分鐘，待磁珠完全吸附時小心將DNA溶液轉(zhuǎn)移至收集板，并于適當(dāng)條件保存。(2)高分辨率熔解曲線分析聯(lián)合觸底PCR高分辨率熔解曲線分析的P53基因外顯子5-8的特異性引物共計4對，序列如下表所示：P53外顯子5正向引物TTACTCTTCAAGCTGTCCTC如SEQIDNo.1所示P53外顯子5反向引物CTTATGGTCATTATTACTTT如SEQIDNo.2所示P53外顯子6正向引物TACTGGAAGTTATTCGATCT如SEQIDNo.3所示P53外顯子6反向引物TGTTTACCACTAGATCTCTG如SEQIDNo.4所示P53外顯子7正向引物GTACTAATTCCTAGGTGGGC如SEQIDNo.5所示P53外顯子7反向引物CTTGTCGATCCTGACCTGTA如SEQIDNo.6所示P53外顯子8正向引物TGTATCCTGAGTATTGGTCT如SEQIDNo.7所示P53外顯子8反向引物ATCTGCTTGCGGCTCTCGCT如SEQIDNo.8所示配制總體積為15μL的PCR反應(yīng)體系；體系包含：mastermix10μL；MgCl22.4μL；GCenhancer0.5μL；引物F1μL；引物R1μL，其余為RNasefreeH2O。將配好的反應(yīng)體系加入96孔板內(nèi)，之后按照加樣順序，取5μL樣品、陰性對照、空白對照依次加入相應(yīng)孔內(nèi)，在96孔板上封膜，振蕩混勻，之后短暫離心。高分辨率熔解曲線分析聯(lián)合觸底PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，60℃15s，72℃15s，95℃10s，50個循環(huán)；95℃1min，40℃1min，從65℃開始，以0.02℃每秒的斜率采集熔解曲線，到95℃，之后40℃10s結(jié)束，用LightCycler480所配分析軟件對采集后的曲線進(jìn)行分析。如相對于陰性對照出現(xiàn)了單獨(dú)的峰，則為陽性結(jié)果，表明發(fā)生P53基因突變。(3)直接測序法進(jìn)行驗證(此為可選步驟)用高分辨率熔解曲線分析聯(lián)合觸底PCR的方法得到陽性結(jié)果的樣本，即發(fā)生P53基因突變。將發(fā)生突變的樣本剩余的DNA進(jìn)行基因測序，驗證其有無假陽性。實(shí)施例2：臨床樣品檢測采用實(shí)施例1的方法對200例體檢人群血液中P53基因5-8外顯子進(jìn)行檢測，能夠成功檢測到3例受檢者血液DNA中P53基因存在突變，之后運(yùn)用一代測序法對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測并與人類基因組序列進(jìn)行比對后證實(shí)，這3例樣本確實(shí)存在DNA序列上的改變。200例體檢人群血液樣本，其中有3例(第68號，105號，160號)出現(xiàn)突變(出現(xiàn)了單獨(dú)的峰)，第68號樣本P53基因外顯子7疑似出現(xiàn)核酸序列變化(圖1)；第105號樣本P53基因外顯子6疑似出現(xiàn)核酸序列變化(圖2)；第160號樣本P53基因外顯子5疑似出現(xiàn)核酸序列變化(圖3)。經(jīng)一代測序檢測，結(jié)果顯示第68號樣本P53基因coden244出現(xiàn)GGC/GGT同義變(圖4)；第105號樣本P53基因12759位出現(xiàn)C/G變異(圖5)，此變異對P53蛋白功能無影響；第160號樣本P53基因coden163出現(xiàn)TAC/TGC(酪氨酸/半胱氨酸)變異(圖6)。另圖7是檢測樣本中的陰性樣本的HRM溶解曲線圖，相對于陰性對照，陰性樣本的檢測曲線未出現(xiàn)明顯的差異。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測方法可快速檢測P53基因5-8外顯子的多種突變，適用于臨床早期腫瘤患者篩查。具有檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)，反應(yīng)簡便迅速，2小時即可獲得實(shí)驗結(jié)果，便于大樣本高通量處理等特點(diǎn)，篩查出的陽性結(jié)果再經(jīng)過基因測序法確定，可以大為減少早期腫瘤篩查的困難度和檢測成本。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表<110>北京青航基因科技有限公司<120>快速篩查P53基因外顯子5-8突變的體外檢測方法及應(yīng)用<130>P1610248<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ttactcttcaagctgtcctc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2cttatggtcattattacttt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3tactggaagttattcgatct20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4tgtttaccactagatctctg20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gtactaattcctaggtgggc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6cttgtcgatcctgacctgta20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7tgtatcctgagtattggtct20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8atctgcttgcggctctcgct20當(dāng)前第1頁1 2 3