本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的KASP標(biāo)記及其應(yīng)用，特別適用于大量群體的細(xì)胞質(zhì)育性鑒定。

背景技術(shù)：

大蔥(Allium fistulosum L.)是起源于中國(guó)的一種蔬菜作物，在中國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家廣泛栽培。大蔥是非常重要的香辛類(lèi)蔬菜，是中國(guó)人日常生活中必不可少的蔬菜和調(diào)味品，其味辛、性溫、生食或熟食皆宜，具有開(kāi)胃消食、抗癌、抗腫瘤、保護(hù)心血管、降血壓、提高人體免疫力和防止衰老等保健功能。然而，我國(guó)種植的大蔥品種則以章丘大蔥等地方品種以及日本進(jìn)口品種為主?，F(xiàn)有品種不能滿(mǎn)足生產(chǎn)的需要，并存在著進(jìn)口種子價(jià)格昂貴的問(wèn)題。因此，我們必須培育出具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的大蔥雜交種。

利用雄性不育特性培育和生產(chǎn)雜交種是保持品種特性、保證種子質(zhì)量、降低種子成本最為有效的技術(shù)措施，因此蔬菜作物雄性不育的研究無(wú)論是在應(yīng)用基礎(chǔ)還是基礎(chǔ)理論研究都是非常重要的熱點(diǎn)。由于大蔥是兩年生蔬菜，傳統(tǒng)方式選育大蔥雄性不育系與保持系，具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)工、效率低的問(wèn)題，利用常規(guī)育種與分子標(biāo)記輔助育種相結(jié)合能夠有效地解決育種年限長(zhǎng)，選擇效率低的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)。大蔥雄性不育屬于核質(zhì)互作，只有細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核均不育時(shí)，才能表現(xiàn)為不育。大蔥不育基因型只有一種，即S(sm1sm1sm2sm2)，而可育基因型很多，我們只選擇基因型為N(sm1sm1sm2sm2)的大蔥植株作為保持系。選擇具有N型細(xì)胞質(zhì)的大蔥植株進(jìn)行下一步的測(cè)交等試驗(yàn)，縮小篩選群體范圍，減小工作量，提高選擇效率。

在大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育分子標(biāo)記研究方面，已有相關(guān)報(bào)道。蓋樹(shù)鵬等以章丘大蔥不育系與保持系為材料，對(duì)細(xì)胞質(zhì)線(xiàn)粒體DNA進(jìn)行了RAPD標(biāo)記，獲得了兩個(gè)能夠鑒定部分大蔥品種細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型的RAPD標(biāo)記(蓋樹(shù)鵬，孟祥棟，徐麗娟.2004.大蔥雄性不育分子標(biāo)記輔助選擇的研究.分子植物育種，2：223–228.；蓋樹(shù)鵬，孟祥棟.2004.大蔥胞質(zhì)雄性不育位點(diǎn)RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的研究.萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，21：189–192；WANG,C.,LI,H.Y.,ZHANG,L.Y.,PEI,Y.X.and WANG,Y.Q.2013.Identification of an AFLP marker and conversion to a SCAR marker to identify cytoplasmic male-sterile or normal cytoplasm in Welsh onion(Allium fistulosum L.).Journal of Horticultural Science&Biotechnology,88,409–414.)。然而該標(biāo)記是以線(xiàn)粒體DNA為材料，由于線(xiàn)粒體DNA的提取比較復(fù)雜，因此在實(shí)際應(yīng)用上受到一定的限制。后來(lái)，本課題組開(kāi)發(fā)了以大蔥總DNA為模板的SCAR分子標(biāo)記(高莉敏，董飛，霍雨猛，劉冰江，繆軍，陳運(yùn)起*，大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的SCAR標(biāo)記開(kāi)發(fā)，園藝學(xué)報(bào)，第40卷，第7期，1382-1388頁(yè)，2013；高莉敏，陳運(yùn)起，董飛，孔素萍，一種大蔥細(xì)胞質(zhì)雄性不育檢測(cè)的試劑盒及其應(yīng)用，中國(guó)，ZL201210348974.X；Li Min Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,Fei Dong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,Wei Chen and Xiong Wu*Development of SCAR markers to distinguish male-sterile and normal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal of Horticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57-62.)，這些標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用有效的避免了保持系篩選的盲目性，提高了選擇效率。但是，這些標(biāo)記均以PCR為基礎(chǔ)，然后進(jìn)行電泳來(lái)判斷細(xì)胞質(zhì)育性，雖然較田間鑒定快速的多，但是這些實(shí)驗(yàn)均需人工操作，實(shí)驗(yàn)室工作量也不小。一般的PCR儀只有96孔板，我們每次只能檢測(cè)96個(gè)樣品。對(duì)于大量樣本檢測(cè)來(lái)說(shuō)，具有一定的局限性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種快速鑒定大量群體大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的KASP標(biāo)記及其應(yīng)用，可用于輔助選育大蔥雄性不育系和配套保持系，能夠方便、快捷、準(zhǔn)確的鑒定出細(xì)胞質(zhì)的類(lèi)型。

本發(fā)明一種鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的KASP標(biāo)記，用于擴(kuò)增所述標(biāo)記的引物核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示。

SEQ No.1(KASP-F)：

CTCTCGGTTTGGTCCTACTGATGAT

SEQ No.2(KASP-R1)：下劃線(xiàn)部分為FAM熒光標(biāo)簽序列

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAT

SEQNo.3(KASP-R)：下劃線(xiàn)部分為HEX熒光標(biāo)簽序列

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAA。

所述熒光標(biāo)簽序列還可以采用其他本領(lǐng)域通用的熒光標(biāo)簽序列。

本發(fā)明還提供一種利用上述標(biāo)記進(jìn)行大蔥細(xì)胞質(zhì)育性檢測(cè)的方法，檢測(cè)步驟包括：

a.提取被檢測(cè)大蔥的總DNA；

b.將樣本從96孔板中通過(guò)Replikator轉(zhuǎn)移至384孔板中，再最終轉(zhuǎn)移至1536

孔板中，確保樣本DNA終濃度約為10ng/ul；

c.將裝有DNA的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；

d.干燥后的DNA進(jìn)行PCR體系構(gòu)建，每個(gè)反應(yīng)僅需1ul反應(yīng)體系，包括10ng DNA,0.5μl KASP 2x Master Mix standard ROX(LCG Genomics,Teddington,Middlesex,UK,Beverly,MA,USA)and 0.014μl KASP-by-Design assay mix(LGC Genomics,Beverly,MA,USA)，ddH₂O補(bǔ)至1μl；

e.將加好反應(yīng)體系的孔板進(jìn)行封膜，并低速快速離心；

f.離心后進(jìn)行水浴PCR，反應(yīng)程序包括94℃預(yù)變性15min；94℃變性20s，61-55℃退火1min(每一個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，55℃退火1min，26-29個(gè)循環(huán)；

g.將完成反應(yīng)的孔板，吹干降溫后在酶標(biāo)儀Pherastar上進(jìn)行讀板。

h.檢測(cè)出的不育細(xì)胞質(zhì)位于圖片的左上方，為紅色標(biāo)記(純合T-atp6)，可育細(xì)胞質(zhì)位于圖片的右下方，為綠色(雜合atp6)和藍(lán)色標(biāo)記(純合A-atp6)。由于綠色和藍(lán)色均為可育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型，在實(shí)際檢測(cè)中合并為一類(lèi)，均顯示藍(lán)色。對(duì)5對(duì)大蔥雄性不育系與保持系進(jìn)行KASP標(biāo)記驗(yàn)證，PCR結(jié)果與遺傳分析結(jié)果一致，說(shuō)明標(biāo)記的有效性。

進(jìn)一步，本發(fā)明還提供一種用于鑒定大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的試劑盒，包括含有核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物，還含有熒光探針及PCR體系構(gòu)建所需試劑。

利用本發(fā)明可以對(duì)大量群體的大蔥細(xì)胞質(zhì)育性進(jìn)行快速準(zhǔn)確的判斷，提高大蔥保持系選育效率，對(duì)于建立大蔥分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系具有重要意義。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)快速準(zhǔn)確：通過(guò)本發(fā)明，只需提取大蔥總DNA進(jìn)行批量PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行讀板即可，這些實(shí)驗(yàn)均由儀器操作完成，可以進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)，節(jié)省了大量人力，而且特別適用于大量樣本的操作。通過(guò)讀板后的數(shù)據(jù)顯示即可判斷細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。

(2)標(biāo)記穩(wěn)定：對(duì)已經(jīng)育成的5對(duì)不育系及其保持系進(jìn)行驗(yàn)證，其分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與遺傳分析結(jié)果完全一致。且本發(fā)明僅需要一對(duì)引物即可完成檢測(cè)，既高效又準(zhǔn)確。

(3)和國(guó)際上最先進(jìn)類(lèi)似標(biāo)記(Li Min Gao,Yun Qi Chen,Yu Meng Huo,Fei Dong,Yan Yan Yang,Su Ping Kong,Wei Chen and Xiong Wu*Development of SCAR markers to distinguish male-sterile and normal cytoplasm in bunching onion(Allium fistulosum L.),Journal of Horticultural Science&Biotechnology,2015,90(1):57-62.)相比，本標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)驗(yàn)操作可以批量化、自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，特別適用于大量群體的檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1樣本檢測(cè)結(jié)果，左上方的紅色圓點(diǎn)標(biāo)記表示不育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型，右下方的綠色和藍(lán)色圓點(diǎn)標(biāo)記表示可育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。

圖2為實(shí)施例2KASP標(biāo)記檢測(cè)驗(yàn)證結(jié)果，左上方的紅色圓點(diǎn)標(biāo)記表示不育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型，右下方的藍(lán)色圓點(diǎn)標(biāo)記表示可育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此，凡是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，若無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實(shí)施例1 KASP標(biāo)記及檢測(cè)方法的建立

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中大蔥T-atp6(GenBank No.KR973431)以及A-atp6(GenBank(No.KR973430)基因序列，采用Primer Premier 5.0和Primer 3.0(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/input.htm)設(shè)計(jì)KASP標(biāo)記引物，核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示：

SEQ No.1(KASP-F)：

CTCTCGGTTTGGTCCTACTGATGAT

SEQ No.2(KASP-R1)：下劃線(xiàn)部分為FAM熒光標(biāo)簽序列

GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAT

SEQNo.3(KASP-R)：下劃線(xiàn)部分為HEX熒光標(biāo)簽序列

GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCCCCCTCCCTTTTTCGTAACAAAA

在本發(fā)明中，采用的熒光報(bào)告基團(tuán)A為FAM，熒光報(bào)告基團(tuán)B為HEX，熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。熒光探針A、熒光探針B、淬滅探針A和探針B來(lái)自于KASP 2×Master Mix(LGC公司產(chǎn)品)。

大蔥材料總DNA提取方法采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的快捷型植物基因組提取試劑盒，提取方法參照說(shuō)明書(shū)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。

用核苷酸序列如序列表中SEQ No.1、SEQ No.2和SEQ No.3所示的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。將樣本從96孔板中通過(guò)Replikator轉(zhuǎn)移至384孔板中，再最終轉(zhuǎn)移至1536孔板中，確保樣本DNA終濃度約為10ng/ul；將裝有DNA的1536孔板置于65℃烘箱中干燥30min；干燥后的DNA進(jìn)行PCR體系構(gòu)建，每個(gè)反應(yīng)僅需1ul反應(yīng)體系，包括10ng DNA,0.5μl KASP 2x Master Mix standard ROX(LCG Genomics,Teddington,Middlesex,UK,Beverly,MA,USA)and 0.014μl KASP-by-Design assay mix(LGC Genomics,Beverly,MA,USA)，ddH2O補(bǔ)至1μl。將加好反應(yīng)體系的孔板進(jìn)行封膜，并低速快速離心；離心后進(jìn)行水浴PCR，反應(yīng)程序包括94℃預(yù)變性15min；94℃變性20s，61-55℃退火1min(每一個(gè)循環(huán)降低0.6℃)，10個(gè)循環(huán)；94℃變性20s，55℃退火1min，26-29個(gè)循環(huán)。將完成反應(yīng)的孔板，吹干降溫后在酶標(biāo)儀Pherastar上進(jìn)行讀板。檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：位于左上方紅色標(biāo)記顯示的為不育細(xì)胞質(zhì)大蔥材料，純合T-atp6；位于圖片的右下方，綠色和藍(lán)色標(biāo)記顯示的是可育細(xì)胞質(zhì)大蔥材料：綠色的為雜合atp6，藍(lán)色標(biāo)記為純合A-atp6，由于綠色和藍(lán)色均為可育細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型，在實(shí)際檢測(cè)中合并為一類(lèi)。

實(shí)施例2 KASP標(biāo)記檢測(cè)方法的驗(yàn)證

參試的大蔥雄性不育系與保持系共5組：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所選育的3組(980238A/B、980128A/B、200501A/B)，遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供1組(244A/B)，河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供1組(08-9A/B)。5個(gè)雄性不育系均為多代回交選育而成的穩(wěn)定不育系，與其保持系核背景高度一致。

對(duì)上述已知細(xì)胞質(zhì)育性的5對(duì)雄性不育系及其保持系進(jìn)行KASP標(biāo)記驗(yàn)證，所有S型細(xì)胞質(zhì)材料檢測(cè)結(jié)果均位于圖譜的左上方，為紅色標(biāo)記；所有N型細(xì)胞質(zhì)材料檢測(cè)結(jié)果均位于圖譜的右下方，為藍(lán)色標(biāo)記(如圖2所示)。KASP檢測(cè)結(jié)果與遺傳分析結(jié)果一致，說(shuō)明本發(fā)明所用引物及檢測(cè)方法完全可以鑒別大蔥細(xì)胞質(zhì)類(lèi)型。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所

<120> 一種快速鑒定大量群體大蔥細(xì)胞質(zhì)育性的KASP標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctctcggttt ggtcctactg atgat 25

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gaaggtgacc aagttcatgc tccccctccc tttttcgtaa caaat 45

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaaggtcgga gtcaacggat tccccctccc tttttcgtaa caaaa 45