本發(fā)明涉及一種富含RG-I的超低分子量果膠的制備方法，特別涉及一種利用超聲輔助氧化處理綠色、快速制備超低分子量果膠的方法，屬于多糖降解領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
果膠主要是由D-半乳糖醛酸經(jīng)α-1,4糖苷鍵連接的一類(lèi)酸性雜多糖，其側(cè)鏈含有大量的鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等中性糖。果膠主要包括均聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I(RG-I)和鼠李半乳糖醛酸聚糖II(RG-II)三個(gè)結(jié)構(gòu)域，其廣泛存在于植物中，如蘋(píng)果、柑橘、番石榴、向日葵花盤(pán)及甘薯渣中，且被認(rèn)為是一種可溶性的膳食纖維，具有降低膽固醇、預(yù)防糖尿病、防止肥胖以及維持腸道健康等多種生理功能。但果膠分子量太大，不易被消化吸收，因此限制其在小腸中的吸收，影響其生理活性的發(fā)揮。而改性后的超低分子量果膠溶解性好，易被吸收，且RG-I含量增加，并能表現(xiàn)出更強(qiáng)的生物活性，因此開(kāi)發(fā)新型降解果膠的方法，制備改性低分子量果膠具有重要意義。
目前果膠降解的方法主要包括生物降解、物理降解和化學(xué)降解。生物酶解反應(yīng)溫和，專(zhuān)一性高，但反應(yīng)條件苛刻，成本較高。物理降解法主要有超聲降解、輻射降解、微波降解等，輻射法降解效率最高，但對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞大，且安全性存在爭(zhēng)議，使其應(yīng)用受到限制；微波降解易產(chǎn)生高溫影響降解產(chǎn)物生物活性；超聲降解對(duì)產(chǎn)物活性結(jié)構(gòu)破壞小，但其降解能力有限，只能將果膠降解至30kDa左右，仍不能被人體吸收?；瘜W(xué)降解目前主要包括酸降解和堿降解，但由于加入強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，易造成環(huán)境污染，反應(yīng)速率較慢，且一般在高溫下進(jìn)行反應(yīng)，因此對(duì)結(jié)構(gòu)影響破壞較大，降低生物活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)目前制備RG-I型超低分子量果膠技術(shù)，提供了一種綠色、安全、快速的富含RG-I的超低分子量果膠的制備方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明生產(chǎn)工藝的主要特征包括以下步驟：
(1)取蒸餾水，加入適量HCl溶液調(diào)整pH在3-5之間，加入FeCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、Cu(CH3COO)2·H2O或CuSO4·5H2O，配置成金屬離子濃度為0.5-5mmol/L的溶液A；
(2)取果膠溶于溶液A中，使得果膠的濃度為2-10mg/mL，渦旋振蕩儀震蕩，使其完全溶解；
(3)在步驟2配制的果膠溶液中加入5mol/LH2O2溶液，使金屬離子與過(guò)氧化氫摩爾濃度比為1:20，轉(zhuǎn)移到0-50℃環(huán)境中進(jìn)行超聲處理，超聲強(qiáng)度為1.5-20W/mL。
(4)超聲處理后，加入亞硫酸氫鈉，終止反應(yīng)；然后通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱置換溶液中的陽(yáng)離子；
(5)對(duì)步驟4處理后的溶液進(jìn)行4000r/min離心，取上清液，調(diào)整上清液pH至5-8；
(6)將步驟5處理后的上清液轉(zhuǎn)移至500Da的透析袋，流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機(jī)中凍干，得到富含RG-I的超低分子量果膠。
進(jìn)一步地，所述步驟2中，果膠的濃度為5mg/mL。
進(jìn)一步地，所述步驟3中，超聲處理的環(huán)境溫度為30℃，超聲強(qiáng)度為3-5W/mL
進(jìn)一步地，所述步驟5中，上清液pH優(yōu)選6。
本發(fā)明的有益效果在于：
(1)本發(fā)明為富含RG-I超低分子量果膠提供一種綠色、安全、快速降解方法，得率可達(dá)到65％以上，所得產(chǎn)品純度較高、質(zhì)量穩(wěn)定、成本低。
(2)降解工藝簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，所用樹(shù)脂可重復(fù)利用，工藝條件環(huán)保無(wú)污染。
(3)本發(fā)明所得果膠的重均分子量在5-10kDa，酯化度下降，產(chǎn)物多為富含RG-I的超低分子量果膠，抗氧化活性顯著高于原果膠，綜合利用率提高。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明通過(guò)超聲強(qiáng)化氧化反應(yīng)，促進(jìn)反應(yīng)體系(如公式1)中生成的Fe3+還原為Fe2+，強(qiáng)化Fe2+與過(guò)氧化氫重新反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基，造成果膠糖鏈氧化斷裂，且特異型攻擊果膠中的半乳糖醛酸，形成富含RGI結(jié)構(gòu)域的低分子量果膠。
Fe2++H2O2→Fe3++·OH+OH-
下面結(jié)合具體施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1：
(1)取25mL蒸餾水，加入3mol/L HCl溶液，用pH計(jì)調(diào)整pH為3.0，加入FeCl2·4H2O，配置成0.5mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取60mg果膠(Sigma公司)溶解于25ml溶液A中，充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲管(內(nèi)徑3cm)中；
(3)將其置于30℃恒溫槽中，將超聲探頭置于液面下1.5cm處進(jìn)行超聲處理，同時(shí)加入50μL 5mol/LH2O2溶液，設(shè)定超聲強(qiáng)度1.5W/mL，超聲處理40min；
(4)在降解液中加入過(guò)量亞硫酸氫鈉，還原多余的雙氧水，以終止反應(yīng)；
(5)將步驟4處理后的溶液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，控制流速為0.5mL/min，使得陽(yáng)離子交換樹(shù)脂置換其中的金屬陽(yáng)離子；
(6)將置換后的溶液4000r/min離心，取上清液，調(diào)整pH 6.0；
(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500Da的透析袋流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機(jī)中凍干；取果膠樣品進(jìn)行分子量及單糖組成測(cè)定，結(jié)果如表1所示，處理后，分子量由448.26kDa降至6.32kDa，果膠RG-I域比例增加，主要以RG-I結(jié)構(gòu)為主。
表1 降解前后果膠單糖組成
本實(shí)施例通過(guò)40分鐘快速地完成了果膠的降解，從表中可以看出，降解后的果膠寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值從0.13升至0.55，，說(shuō)明RG-I結(jié)構(gòu)域占比分布增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I側(cè)鏈長(zhǎng)度，側(cè)鏈長(zhǎng)度略微下降，但相對(duì)于RG-I結(jié)構(gòu)域占比和半乳糖酸酸含量，其改變較小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值從2.20將至0.56，說(shuō)明果膠線(xiàn)性度顯著下降，即支鏈度升高，從以上信息可以推測(cè)出超聲結(jié)合氧化降解，主要作用于果膠中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I結(jié)構(gòu)較好的保留，從而制備出富含RG-I果膠。
實(shí)施例2：
(1)取100mL蒸餾水，加入3mol/L HCl溶液，用pH計(jì)調(diào)整pH為4.0，加入FeCl2·4H2O，配置成2mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取500mg果膠(Sigma公司)溶解于100ml溶液A中，充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲管(內(nèi)徑6cm)中；
(3)將其置于30℃恒溫槽中，將超聲探頭置于液面下1.5cm處進(jìn)行超聲處理，同時(shí)加入800μL高濃度H2O2溶液，設(shè)定超聲強(qiáng)度4.0W/mL，超聲處理30min；
(4)在降解液中加入過(guò)量亞硫酸氫鈉，還原多余的雙氧水，以終止反應(yīng)；
(5)將步驟4處理后的溶液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，控制流速為1.0mL/min，使得陽(yáng)離子交換樹(shù)脂置換其中的金屬陽(yáng)離子；
(6)將置換后的溶液4000r/min離心，取上清液，調(diào)整pH 6.0；
(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500Da的透析袋流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機(jī)中凍干；取果膠樣品進(jìn)行分子量及單糖組成測(cè)定，結(jié)果如表2所示，處理后，分子量由448.26kDa降至7.29kDa，果膠RG-I域比例增加，主要以RG-I結(jié)構(gòu)為主。
表2 降解前后果膠單糖組成
本實(shí)施例通過(guò)30分鐘快速地完成了果膠的降解，從表中可以看出，降解后的果膠寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值從0.13升高至0.53，說(shuō)明RG-I結(jié)構(gòu)域占比分布顯著增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I側(cè)鏈長(zhǎng)度，側(cè)鏈長(zhǎng)度略微下降，但相對(duì)于RG-I結(jié)構(gòu)域占比和半乳糖酸酸含量，其改變較小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值從2.20將至0.58，說(shuō)明果膠線(xiàn)性度下降，即支鏈度升高，從以上信息可以推測(cè)出超聲結(jié)合氧化降解，主要作用于果膠中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I結(jié)構(gòu)較好的保留，從而制備出富含RG-I果膠。
實(shí)施例3：
(1)取1000mL蒸餾水，加入3mol/L HCl溶液，用pH計(jì)調(diào)整pH為5.0，加入FeCl2·4H2O，配置成5mmol/L Fe2+的溶液A；
(2)取10g果膠(Sigma公司)溶解于1000ml溶液A中，充分溶解后，轉(zhuǎn)移至超聲槽中；
(3)將其置于40℃恒溫槽中，并加入20mL高濃度H2O2溶液，設(shè)定超聲強(qiáng)度4.0W/mL，超聲處理30min；
(4)在降解液中加入過(guò)量亞硫酸氫鈉，還原多余的雙氧水，以終止反應(yīng)；
(5)將步驟4處理后的溶液通過(guò)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂柱，控制流速為2.0mL/min，使得陽(yáng)離子交換樹(shù)脂置換其中的金屬陽(yáng)離子；
(6)將置換后的溶液4000r/min離心，取上清液，調(diào)整pH 6.0；
(7)將上述溶液轉(zhuǎn)移至500Da的透析袋流水透析24h，純水透析12h，后將其置于真空冷凍機(jī)中凍干；取果膠樣品進(jìn)行分子量及單糖組成測(cè)定，結(jié)果如表2所示，處理后，分子量由448.26kDa降至2.14kDa，果膠RG-I域比例增加，主要以RG-I結(jié)構(gòu)為主。
表3 降解前后果膠單糖組成
本實(shí)施例通過(guò)30分鐘快速地完成了果膠的降解，從表中可以看出，降解后的果膠寡糖中，半乳糖含量大大降低，且Rha/GalA比值從0.13升高至0.61，說(shuō)明RG-I結(jié)構(gòu)域占比分布顯著增加，(Gal+Ara)/Rha代表RG-I側(cè)鏈長(zhǎng)度，側(cè)鏈長(zhǎng)度略微下降，但相對(duì)于RG-I結(jié)構(gòu)域占比和半乳糖酸酸含量，其改變較小。此外，GalA/(Fuc+Rha+GlcA+Ara+Gla+Xyl)比值從2.20將至0.53，說(shuō)明果膠線(xiàn)性度下降，即支鏈度升高，從以上信息可以推測(cè)出超聲結(jié)合氧化降解，主要作用于果膠中HG域，造成HG域含量降低，而RG-I結(jié)構(gòu)較好的保留，從而制備出富含RG-I果膠。