本發(fā)明涉及一種基于焦磷酸測序檢測雙位點(diǎn)snp的方法，屬于單核苷酸多態(tài)性檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

單核苷酸的多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)是最為常見的一種遺傳多態(tài)性，占所有已知多態(tài)性的的90％以上?，F(xiàn)有公共數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道了超過900萬個snp位點(diǎn)。開展snp研究對遺傳學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與合理用藥、臨床診斷、法醫(yī)學(xué)的發(fā)展均具有十分重要的意義。作為第三代遺傳標(biāo)記，snp具有穩(wěn)定遺傳、高密度、容易規(guī)?；妥詣踊治龅惹皟纱z傳標(biāo)記無可比擬的優(yōu)點(diǎn)。snp分型檢測工作，已成為當(dāng)前國際上研究的熱點(diǎn)。近年來，snp檢測方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快。目前，進(jìn)行snp分型檢測的基本方法已達(dá)20余種。各種snp分型檢測方法可看成由等位基因特異性識別的原理方法和等位基因識別產(chǎn)物的分析檢測兩部分組成。等位基因特異性識別原理有引物延伸反應(yīng)原理、序列雜交反應(yīng)原理、酶連接反應(yīng)原理、酶切割反應(yīng)原理等；等位基因分析檢測手段有質(zhì)譜、熒光共振和偏振信號檢測、化學(xué)發(fā)光檢測、生物傳感器檢測等。為了提高方法的特異性和靈敏度，絕大多數(shù)的基因分型方法都需要對目標(biāo)檢測序列片段進(jìn)行pcr擴(kuò)增從而增加檢測靶標(biāo)分子的數(shù)目。等位基因識別反應(yīng)在溶液中更為穩(wěn)定，但在固相載體上捕獲反應(yīng)產(chǎn)物能夠使大量檢測平行進(jìn)行，從而極大提高分析的通量。雖然兩個部分操作可以在一定的條件下同時進(jìn)行，但是為了提高檢測的精確性和靈敏度，大多數(shù)的分型方法都將兩個操作過程分離進(jìn)行。

焦磷酸測序(preosequencing)技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新的dna序列分析技術(shù)，它通過核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測。是一個理想的遺傳分析技術(shù)平臺，既可進(jìn)行dna序列分析，又可進(jìn)行基于序列分析的單核苷酸多態(tài)性(snp)檢測及等位基因頻率測定等，該項(xiàng)技術(shù)目前已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物等各個領(lǐng)域。

焦磷酸測序是由dna聚合酶(dnapolymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(atpsulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應(yīng)體系的酶級聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，反應(yīng)底物為5’-磷酰硫酸(adenosine5’phosphosulfate，aps)和熒光素。反應(yīng)體系還包括待測序dna單鏈和測序引物。在每一輪測序反應(yīng)中，加入1種dntp，若該dntp與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)(ppi)。硫酸化酶催化asp和ppi形成atp，后者驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與atp量成正比的可見光信號，并由pyrogram^tm轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加入dntp類型和熒光信號強(qiáng)度就可實(shí)時記錄模板dna的核苷酸序列。在實(shí)驗(yàn)過程中用α-硫化的三磷酸腺苷(datpαs)代替三磷酸腺苷(datp)以有效地被dna聚合酶利用，而不被蟲熒光素識別。由于spdatpαs可以降低datpαs降解產(chǎn)物的濃度，近年來，單鏈dna結(jié)合蛋白(singlestarnddnabindingportein，ssbp)和純化spisomerdatpas的使用datpαs降解產(chǎn)物抑制雙磷酸酶活性的這一問題得到較好解決，使得測序長度可達(dá)10bp，拓展了該技術(shù)在遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

由于單核苷酸位點(diǎn)多，一段表達(dá)蛋白的基因上可能存在多個snp位點(diǎn)，但由于現(xiàn)有的snp位點(diǎn)檢測手段的限制，snp位點(diǎn)檢測均為單一檢測，即各位點(diǎn)需要單獨(dú)擴(kuò)增后進(jìn)行測序，無法在一個體系中對多個snp位點(diǎn)同時進(jìn)行檢測。中國專利cn10249166b公開了一種利用人工熔點(diǎn)標(biāo)簽序列對待測snp進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了在一個單管中檢測多個snp位點(diǎn)，該方法采用熒光探針或熔點(diǎn)的差異來區(qū)分各snp位點(diǎn)的基因型。該方法雖然可以實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)體系中檢測多個snp位點(diǎn)，但該方法制備樣品復(fù)雜，制備過程繁瑣，對反應(yīng)溫度的要求非常高，檢測結(jié)果對反應(yīng)體系的依賴度過高，檢測所需儀器及試劑昂貴，提高了使用者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不適合大規(guī)模推廣使用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種利用焦磷酸測序的方法實(shí)現(xiàn)在同一檢測體系中檢測兩個snp位點(diǎn)的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種基于焦磷酸測序檢測雙位點(diǎn)snp的方法，具體包括以下步驟：

a、將待檢測dna序列進(jìn)行擴(kuò)增、分離，其中待檢測dna序列為穩(wěn)定的dna單鏈；

b、將分離后的待測dna單鏈樣品加入反應(yīng)體系，且同時加入雙位點(diǎn)snp對應(yīng)的引物，經(jīng)所述引物啟動互補(bǔ)鏈擴(kuò)增，且分別經(jīng)焦磷酸測序檢測與待測dna單鏈互補(bǔ)堿基序列以確定待測snp位點(diǎn)；

其中，所述對應(yīng)不同位點(diǎn)的引物對應(yīng)同一待測dna序列的兩個待測snp位點(diǎn)的擴(kuò)增起始端至snp位點(diǎn)的堿基序列至少有n堿基不同或距snp位點(diǎn)的距離不同，n≥1。

為了保證測序工作的正常進(jìn)行，待測dna序列需為穩(wěn)定的dna單鏈，不能穩(wěn)定維持單鏈狀態(tài)的dna，如會配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的dna序列，鏈內(nèi)自配對或待測鏈之間配對的dna序列無法采用本發(fā)明中的檢測方法進(jìn)行測序。

作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，對應(yīng)不同位點(diǎn)的引物對應(yīng)同一待測dna序列的兩個待測snp位點(diǎn)的擴(kuò)增起始端至snp位點(diǎn)的堿基序列至少有1個或2個堿基不同或距snp位點(diǎn)的距離不同。

至少1個堿基的不同可以保證最后的檢測結(jié)果中對兩個snp位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，換言之，檢測基于堿基之間的種類及位置差異對待測snp位點(diǎn)進(jìn)行區(qū)分，理論上1個堿基的差異即可實(shí)現(xiàn)，2個或2個以上堿基的不同可起到保證結(jié)果準(zhǔn)確性的作用。

當(dāng)兩段檢測片段中自檢測起始位點(diǎn)至snp位點(diǎn)的堿基的種類及排列方式均一樣時，需通過不同的檢測起始點(diǎn)來對兩段snp片段進(jìn)行區(qū)分，起始點(diǎn)的選擇方式在此不做贅述，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明中雙位點(diǎn)檢測的選擇方式均認(rèn)為是可行的。

優(yōu)選地，擴(kuò)增起始位點(diǎn)為兩個snp位點(diǎn)的5’端，或兩個snp位點(diǎn)的3’端，或一個snp位點(diǎn)的5’端與另一個snp位點(diǎn)的3’端。

兩段snp位點(diǎn)在檢測中的檢測方向并不需要完全一致，只要被檢測的序列之間有差異可以進(jìn)行本發(fā)明中的雙位點(diǎn)檢測即可。

優(yōu)選地，snp位點(diǎn)為snp位點(diǎn)或snp位點(diǎn)互補(bǔ)鏈的配對堿基。

snp位點(diǎn)根據(jù)其特征及不同位點(diǎn)之間的差異，位點(diǎn)本身的變化情況是已知的，換言之，檢測結(jié)果的范圍是已知的，本發(fā)明中的雙位點(diǎn)snp檢測方法是基于單個snp位點(diǎn)檢測的效率低消耗大出發(fā)，根據(jù)snp位點(diǎn)之間的差異進(jìn)行設(shè)計檢測，任何可以幫助實(shí)現(xiàn)雙位點(diǎn)檢測的設(shè)計方式均認(rèn)為是可行的，包括上述的改變檢測起始點(diǎn)、選擇不同檢測方向等，另一種優(yōu)選的實(shí)施方式是可以選擇snp位點(diǎn)互補(bǔ)鏈進(jìn)行檢測，通過互補(bǔ)鏈的結(jié)果可以逆向得出snp位點(diǎn)結(jié)果。

當(dāng)snp位點(diǎn)的兩條鏈堿基均發(fā)生突變的極端情況時，檢測方式不限，對兩條鏈均進(jìn)行snp檢測也是可行的。

優(yōu)選地，同一體系中的兩個snp位點(diǎn)為同一段基因上的兩個snp位點(diǎn)。

優(yōu)選地，同一體系中的兩個snp位點(diǎn)為兩段基因上的單個snp位點(diǎn)。

對于snp位點(diǎn)的來源本發(fā)明不做限制，待測snp位點(diǎn)可以為同一段基因上的雙位點(diǎn)snp，也可以是不同dna片段的基因。

當(dāng)snp位點(diǎn)的數(shù)量大于兩個時，本發(fā)明中的檢測方法在可以設(shè)計出檢測探針的情況下，仍可以進(jìn)行snp檢測。

本發(fā)明采用焦磷酸測序的方法進(jìn)行snp雙位點(diǎn)檢測，優(yōu)選的焦磷酸測序使用焦磷酸測序儀，測序儀包括樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)，所述樣品區(qū)包括可旋轉(zhuǎn)的分離盤，所述分離盤位于反應(yīng)區(qū)的上方，所述分離盤包括至少一個dna分離區(qū)，所述分離區(qū)包括內(nèi)部設(shè)有濾膜的中空的過濾柱，連有親和連接體的dna單鏈和未連接親和連接體的dna單鏈經(jīng)所述濾膜過濾后分離；所述反應(yīng)區(qū)包括加樣部和樣品槽，所述加樣部包括dntp試劑槽、加樣針架和安裝于其上的多個加樣針，所述分離盤位于試劑槽的側(cè)上方；所述加樣針架位于樣品槽上；所述樣品槽上設(shè)有多個槽位；所述檢測區(qū)包括生物發(fā)光檢測裝置，所述槽位與生物發(fā)光檢測裝置連接；所述樣品區(qū)、反應(yīng)區(qū)和檢測區(qū)安裝在分析臺上，所述分析臺的側(cè)面設(shè)有用于操作的機(jī)械手。

作為上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)：

優(yōu)選地，濾膜設(shè)于過濾柱的一端。換言之，濾膜構(gòu)成了過濾柱的底端，dna分離區(qū)的過濾面設(shè)于分離柱底，也就是說分離后的單鏈dna在濾膜上。

進(jìn)一步，作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，過濾柱的外徑等于收集管的內(nèi)徑，通過摩擦力可使過濾柱與收集管保持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)，不需要外加結(jié)構(gòu)為過濾柱進(jìn)行限位固定。

另一種優(yōu)選的方式，所述分離盤設(shè)有多個收集管，所述過濾柱安裝于收集管中，所述濾膜位于過濾柱的非端部。

進(jìn)一步，所述濾膜為高分子納米微球結(jié)構(gòu)，所述高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑。

進(jìn)一步，所述收集管設(shè)有可拆卸的上蓋，所述上蓋通過連接帶與收集管連接。

分離后的單鏈dna在濾膜上為連接有親合體的單鏈，需要該條鏈可對濾膜進(jìn)行洗脫，濾液中含有不帶親和連接體的另一條互補(bǔ)鏈，需要反向測序時可對濾液內(nèi)的單鏈dna進(jìn)行收集。當(dāng)需要收集濾膜上的帶親和連接體的一條鏈的時候，收集管可采用回收的收集管，此時收集管僅起到回收廢液的作用，回收使用降低成本，并且環(huán)保減少白色污染的產(chǎn)生。

優(yōu)選地，所述試劑槽設(shè)有多個反應(yīng)位，所述試劑槽的側(cè)下方設(shè)有底物供給部，所述底物供給部通過輸送管道向反應(yīng)位輸送dntp的datp、dctp、dgtp、dttp四種核酸底物。

優(yōu)選地，所述加樣針架為圓盤形，所述加樣針架通過移動部可沿試劑槽和樣品槽之間做往復(fù)運(yùn)動；所述加樣針架通過轉(zhuǎn)軸做旋轉(zhuǎn)運(yùn)動。

優(yōu)選地，所述移動部包括通過安裝架固定在分析臺上方的滑軌以及所述加樣針架底端的滑塊。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)軸設(shè)有驅(qū)動電機(jī)。

優(yōu)選地，所述加樣針為實(shí)心針，所述加樣針固定于加樣針架的通孔中。

優(yōu)選地，所述加樣部還包括干燥槽和清洗槽。

優(yōu)選地，所述槽位沿樣品槽的圓心呈一系列同心圓均勻排列，所述槽位由透明材質(zhì)構(gòu)成，所述槽位延伸入生物發(fā)光檢測裝置。

優(yōu)選地，所述生物發(fā)光檢測裝置包括固定殼和相機(jī)，所述相機(jī)可旋轉(zhuǎn)的位于固定殼中，所述相機(jī)位于所有槽位圍設(shè)的中軸線上，相機(jī)通過旋轉(zhuǎn)可以拍攝所有槽位中的反應(yīng)情況。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用的雙位點(diǎn)snp檢測方法，根據(jù)snp位點(diǎn)特異性地設(shè)計底物的添加順序，保證了檢測的準(zhǔn)確性，采用焦磷酸測序方法，不僅節(jié)約底物及酶系的用量，還提高了檢測效率，特異性的引物添加方式減化了檢測過程，針對性的降低了dntp的用量，大大節(jié)約了成本。

總之，本發(fā)明提供的基于焦磷酸測序檢測雙位點(diǎn)snp的方法可以同時檢測兩個snp位點(diǎn)，隨機(jī)成功率高，節(jié)約了一倍的人力物力，且結(jié)果可視化、準(zhǔn)確率高，降低了檢測成本，滿足了臨床上雙位點(diǎn)同時檢測的需要，也為未來多位點(diǎn)的焦磷酸測序檢測snp檢測奠定了理論基礎(chǔ)，具有良好的推廣價值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

圖2是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

圖3是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

圖4是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

圖5是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

圖6是本發(fā)明提供的一種實(shí)施例的焦磷酸測序檢測結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。

本實(shí)施例以同一段dna片段上的2個snp位點(diǎn)為例進(jìn)行雙位點(diǎn)snp檢測，檢測過程采用焦磷酸測序的方式進(jìn)行，實(shí)施例中未詳細(xì)說明的擴(kuò)增及測序步驟可參照現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)其已掌握的知識均可以得到本實(shí)施例中的步驟及結(jié)果，故在此不做贅述。

本實(shí)施例以apoe基因?yàn)槔?，人apoe基因用于表達(dá)載脂蛋白e(apolipoproteine,apoe)，載脂蛋白e是血漿中重要的載脂蛋白之一。apoe主要在肝臟合成、分泌和代謝，參與脂質(zhì)的運(yùn)輸、儲存及排泄，有修復(fù)組織、抑制血小板聚集、免疫調(diào)節(jié)等作用。apoe編碼膽固醇代謝的關(guān)鍵載脂蛋e，通過調(diào)控和加速aβ蛋白代謝、以及直接通過apoe受體調(diào)控腦部脂質(zhì)代謝和突觸功能，在阿爾茨海默病的發(fā)病中起到重要作用。根據(jù)apoe表型提出apoe基因模型，認(rèn)為apoe的合成是由位于一個基因位點(diǎn)上的三個等位基因所控制，即e2、e3和e4，每一個等位基因?qū)?yīng)于一個主要異構(gòu)體產(chǎn)生三種純合子(e2/2，e3/3，e4/4)和三種雜合子(e2/3，e2/4，e3/4)共六種常見表型。apoe3/3型又稱野生型。apoe的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸(arg)和半胱氨酸(cys)的交換決定了異構(gòu)體的種類。apoe4在這兩個位置上都是arg；e2都是cys；112位為cys和158位是arg者為apoe3異構(gòu)體。

實(shí)施例1

圖1至6為apoe基因的6種等位基因snp的焦磷酸測序結(jié)果，本實(shí)施例中連接了擴(kuò)增位點(diǎn)的apoe4基因序列如seqidno:1所示。apoe基因在整段基因上有兩個snp位點(diǎn)，因此采用本發(fā)明中所述的焦磷酸測序檢測雙位點(diǎn)snp時，即為同時對apoe基因一條鏈上的兩個snp位點(diǎn)進(jìn)行檢測，具體過程如下：

(1)apoe基因樣本的獲取及擴(kuò)增過程參考現(xiàn)有技術(shù)，其中apoe基因5’端引物為帶生物素標(biāo)記的引物，序列如seqidno:2所示；3’端引物為不帶生物素的引物，序列如seqidno:3所示；

(2)純化單鏈樣本，采用dna單鏈分離器，先進(jìn)行堿解后對單鏈dna進(jìn)行分離，生物素為30μm的微球，單鏈分離器濾膜孔徑為10μm，過濾后濾膜上方留有帶生物素標(biāo)記的dna單鏈，洗脫收集dna單鏈樣本；

本實(shí)施例中的dna單鏈分離器的過濾柱濾膜設(shè)于過濾柱底端，也就是說分離柱僅具有一個腔室，單鏈dna經(jīng)過濾膜，過濾后的濾膜上方留有帶生物素標(biāo)記的dna單鏈，在過濾柱內(nèi)加入洗脫收集液，輕柔反復(fù)吹打后吸出，得到dna單鏈。

(3)選擇該apoe基因的互補(bǔ)鏈進(jìn)行反向焦磷酸測序，112位點(diǎn)的snp為待測鏈1，158位點(diǎn)的snp為待測鏈2，待測鏈1的測序起始位點(diǎn)為snp位點(diǎn)的前一個堿基序列，待測鏈2的測序起始位點(diǎn)為snp位點(diǎn)；

(4)如圖4所示，按序加入dntp，與待測鏈1及待測鏈2進(jìn)行反應(yīng)，dntp的加入順序已提前根據(jù)兩段snp序列的特征進(jìn)行設(shè)計，以保證檢測結(jié)果的單一對應(yīng)；本實(shí)施例中具體順序如下：

加入dgtp時，待測鏈2配對后單鏈延伸，待測鏈1由于不堿基不配對，故待測鏈1封閉未延伸，檢測出一倍發(fā)光，證明待測鏈2堿基為c；

加入datp，待測鏈1和2均不配對不延伸，檢測無發(fā)光；

加入dctp，待測鏈1與待測鏈2均堿基配對后延伸，檢測2倍發(fā)光，證明待測鏈1和待測鏈2的堿基均為g；

加入dgtp，待測鏈1和2均不配對不延伸，檢測無發(fā)光；

加入datp時，待測鏈1配對后單鏈延伸，待測鏈2由于不堿基不配對，故待測鏈2封閉未延伸，檢測出一倍發(fā)光，證明待測鏈1堿基為t；

加入dctp，待測鏈1配對后單鏈延伸，待測鏈2由于不堿基不配對，故待測鏈2封閉未延伸，檢測出一倍發(fā)光，證明待測鏈1堿基為g；

加入dttp，待測鏈2的兩個堿基相同，均在堿基配對后延伸，檢測2倍發(fā)光，證明待測鏈2的堿基為aa；

綜上，待測鏈1的序列為gtg，t為snp位點(diǎn)；待測鏈2的序列為cgaa，c為snp位點(diǎn)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例中連接了擴(kuò)增位點(diǎn)的apoe6基因序列如seqidno:1所示。具體檢測過程如下：

(1)apoe基因樣本的獲取及擴(kuò)增過程參考現(xiàn)有技術(shù)，其中apoe基因5’端引物為帶生物素標(biāo)記的引物，序列如seqidno:2所示；3’端引物為不帶生物素的引物，序列如seqidno:3所示；

(2)純化單鏈樣本，采用dna單鏈分離器，先進(jìn)行堿解后對單鏈dna進(jìn)行分離，生物素為30μm的微球，單鏈分離器濾膜孔徑為10μm，過濾后濾膜上方留有帶生物素標(biāo)記的dna單鏈，洗脫收集dna單鏈樣本；

本實(shí)施例中的dna單鏈分離器的過濾柱濾膜設(shè)于過濾柱的非端面，也就是說分離柱具有兩個腔室，單鏈dna經(jīng)過濾膜，過濾后的濾膜上方留有帶生物素標(biāo)記的dna單鏈，將過濾柱兩頭調(diào)轉(zhuǎn)，帶生物素標(biāo)記的dna單鏈位于濾膜下方，在過濾柱內(nèi)加入洗脫收集液，離心后即可得到dna單鏈。

(3)選擇該apoe基因的互補(bǔ)鏈進(jìn)行反向焦磷酸測序，112位點(diǎn)的snp為待測鏈1，158位點(diǎn)的snp為待測鏈2，待測鏈1的測序起始位點(diǎn)為snp位點(diǎn)的前一個堿基序列，待測鏈2的測序起始位點(diǎn)為snp位點(diǎn)；

(4)如圖6所示，按序加入dntp，與待測鏈1及待測鏈2進(jìn)行反應(yīng)，dntp的加入順序已提前根據(jù)兩段snp序列的特征進(jìn)行設(shè)計，以保證檢測結(jié)果的單一對應(yīng)；本實(shí)施例中具體順序如下：

加入dgtp時，待測鏈2配對后單鏈延伸，待測鏈1由于不堿基不配對，故待測鏈1封閉未延伸，檢測出一倍發(fā)光，證明待測鏈2堿基為c；

加入datp，待測鏈1和2均不配對不延伸，檢測無發(fā)光；

加入dctp，待測鏈1與待測鏈2均堿基配對后延伸，檢測2倍發(fā)光，證明待測鏈1和待測鏈2的堿基均為g；

加入dgtp，待測鏈1配對后單鏈延伸，檢測出一倍發(fā)光，待測鏈2由于不堿基不配對，故待測鏈2封閉未延伸，證明待測鏈1堿基為c；

加入datp時，待測鏈1與待測鏈2均不延伸不發(fā)光；

加入dctp，待測鏈1配對后單鏈延伸，待測鏈2由于不堿基不配對，故待測鏈2封閉未延伸，檢測出一倍發(fā)光，證明待測鏈1堿基為g；

加入dttp，待測鏈2的兩個堿基相同，均在堿基配對后延伸，檢測2倍發(fā)光，證明待測鏈2的堿基為aa；

綜上，待測鏈1的序列為gcg，c為snp位點(diǎn)；待測鏈2的序列為cgaa，c為snp位點(diǎn)。

根據(jù)焦磷酸測序的原理，采用本發(fā)明中方法所述的雙位點(diǎn)snp檢測中，dntp的加入順序是需要提前根據(jù)兩段snp位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)置的，設(shè)置的dntp加入順序可以保證結(jié)果的單一對應(yīng)準(zhǔn)確；也就是說，在兩條待測鏈中有一條正好在檢測snp位點(diǎn)時，加入的dntp僅能使兩條待測鏈中的snp位點(diǎn)進(jìn)行反應(yīng)，檢測過程中兩個snp位點(diǎn)的測序是不同時的；當(dāng)在待測snp位點(diǎn)的前后堿基處檢測時，加入的dntp僅能使兩條待測鏈中的至多兩條鏈同時反應(yīng)，當(dāng)無法堿基配對擴(kuò)增時，反應(yīng)被阻斷，在加入可以配對的dntp后，反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行，單鏈得到延伸。

apoe1～apoe3、apoe5的檢測方法同上述實(shí)施例，加入dntp的順序一致，檢測結(jié)果如圖1～3和圖5所示，其他相同的部分在此不做贅述。

snp位點(diǎn)可位于整個檢測過程中的起點(diǎn)，也可以作為檢測的中間及終點(diǎn)，只要可以滿足兩個snp位點(diǎn)的檢測，選擇snp位點(diǎn)所在單鏈或其互補(bǔ)鏈均是可行的，待測snp位點(diǎn)的前后堿基個數(shù)也為可調(diào)的，在此不做限制，也就是說，檢測apoe基因的snp位點(diǎn)的其他可以實(shí)現(xiàn)的dntp加樣順序也應(yīng)認(rèn)為落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

最后有必要在此說明的是：以上實(shí)施例只用于對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容作出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

<110>武漢菲思特生物科技有限公司

<120>一種基于焦磷酸測序檢測雙位點(diǎn)snp的方法

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