本發(fā)明涉及天然藥物提取領(lǐng)域，特別是涉及一種基于連續(xù)色譜技術(shù)同時提取分離甘草酸、甘草總黃酮的方法。

背景技術(shù)：

甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Tapiliantae Taub.）甘草屬（Glycyrrhiza）多年生草本植物，在我國分布廣泛，資源豐富，其根和根莖是我國重要的傳統(tǒng)中藥。甘草中的主要有效成分為三萜類和總黃酮類，其中甘草酸及甘草苷分別是三萜類和總黃酮類化合物中重要的單體成分，具有很強(qiáng)的藥理活性。

現(xiàn)階段，在中藥加工企業(yè)中，對甘草中有效成分的提取分離主要以酸沉法為主，即經(jīng)粉碎后的甘草先使用氨水浸提，然后用濃硫酸將浸提液酸沉，最后將沉淀干燥，從而得到甘草酸粗品；并將浸提后的甘草殘?jiān)俅斡靡掖继崛∫缘玫礁什菘傸S酮。這種粗放式加工方法，不僅不能一次性的將甘草酸、甘草總總黃酮同時提取，而且在生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生大量的廢水，嚴(yán)重地污染了企業(yè)周邊的生態(tài)環(huán)境。

近年來，涌現(xiàn)出許多對甘草中有效成分的提取分離方法，如專利申請CN102453075A公開的一種甘草酸的分離純化工藝，甘草經(jīng)水煮提取、乙醇提取、大孔吸附樹脂層析及丙酮洗脫、離子交換樹脂層析及氨水洗脫、濃縮結(jié)晶，得到甘草酸。專利申請CN103159809A公開的一種高純度甘草酸的制備方法，甘草經(jīng)堿水提取、濃縮回收、純化水或乙醇洗脫、冰乙酸重結(jié)晶得甘草酸精品。專利申請CN102219824A公開的甘草酸的酶解生產(chǎn)方法，利用復(fù)合酶將甘草藥材酶解，采用10體積%乙醇提取甘草酸，再采用大孔吸附樹脂進(jìn)行分離、提純，以10體積%乙醇為洗脫液洗脫，得到甘草酸。上述這些分離純化甘草中有效成分的新工藝中，只能分離得到甘草酸，并不能有效地的將甘草酸、甘草總黃酮同時得到，極大地浪費(fèi)了甘草資源。

發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)，提出了一種基于連續(xù)色譜技術(shù)同時提取分離甘草酸、甘草總黃酮的方法，該方法溶劑消耗少、對周邊環(huán)境友好、執(zhí)行效率高，且能最大程度地提取甘草中的有效成分，并能應(yīng)用于工業(yè)化大生產(chǎn)。本發(fā)明提取分離甘草酸、甘草總黃酮的新方法，在國內(nèi)外尚未見報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種基于連續(xù)色譜技術(shù)同時提取分離甘草酸、甘草總黃酮的方法，甘草酸純度可達(dá)70%以上，甘草總黃酮純度可達(dá)60%以上。

1、一種基于連續(xù)色譜技術(shù)同時提取分離甘草酸、甘草總黃酮的方法，具體步驟如下：

（1）將甘草粉末加6倍量（w/v）的氨醇溶液于燒杯中，攪拌均勻后，將其倒入滲濾裝置中，再向滲濾柱中緩慢加入34倍量（w/v）的氨醇溶液，設(shè)置流入速度為5—10 ml/min，調(diào)節(jié)流出速度與流入速度一致，收集滲濾液，得甘草提取液；

（2）將甘草提取液上樣至裝有樹脂的色譜柱上進(jìn)行吸附，收集上樣流出液；

（3）用乙醇溶液洗脫吸附在色譜柱上的少量甘草總黃酮，并收集乙醇洗脫液1；

（4）合并上樣流出液、乙醇洗脫液1，將合并液旋蒸至溶液中不含有乙醇為止，并將旋蒸液上樣至裝有聚酰胺樹脂的色譜柱上進(jìn)行吸附，用6倍量70%乙醇溶液洗脫，收集乙醇洗脫液2；

（5）將乙醇洗脫液2旋蒸干燥，得到甘草總黃酮，用蘆丁比色法測定其純度；

（6）再用NaOH水溶液洗脫吸附在色譜柱上的甘草酸，并收集NaOH洗脫液；

（7）用1mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)NaOH洗脫液pH = 7并旋蒸干燥，得到甘草酸粗品1；

（8）用純甲醇溶解甘草酸粗品1，過濾以去除其中的鹽分，收集濾液并旋蒸干燥，得到甘草酸粗品2；

（9）用冰醋酸將甘草酸粗品2重結(jié)晶，過濾得到甘草酸，用HPLC法測定其純度。

所述氨醇溶液為0.5%氨水、50-90%乙醇溶液，優(yōu)選70%的乙醇溶液。

該方法采用的生產(chǎn)裝置為一個由12支色譜柱組成的在一個邏輯控制閥控制下的連續(xù)色譜分離系統(tǒng)，系統(tǒng)內(nèi)的色譜柱分為四個區(qū)，分別為吸附區(qū)、甘草總黃酮解析區(qū)、甘草酸解析區(qū)和樹脂再生區(qū)，每個區(qū)分別對應(yīng)1個進(jìn)口、1個出口，該生產(chǎn)裝置共4個進(jìn)口、4個出口；吸附區(qū)用于步驟（2）中甘草酸的吸附，甘草總黃酮解析區(qū)用于步驟（3）中甘草總黃酮的解析，甘草酸解析區(qū)用于步驟（4）中甘草酸的解析，樹脂再生區(qū)用于陰離子樹脂的再生。

所述樹脂為D261、D285、D941、330、D301、D900型陰離子交換樹脂，上樣流速為10-20 ml/min。

所述乙醇溶液為50-90%乙醇溶液，洗脫流速為10-20 ml/min。

所述（4）NaOH水溶液濃度為0.25-0.75mol/L，洗脫流速為5-10 ml/min。

本發(fā)明的有益效果為：采用連續(xù)色譜技術(shù)同時提取分離甘草酸、甘草總黃酮，取得以下有益效果：（1）性狀良好：通過提取、吸附、洗脫、結(jié)晶、干燥，是產(chǎn)品色澤優(yōu)良，晶體均一；（2）產(chǎn)品純度高：以干燥品計(jì)算，所得甘草酸純度可達(dá)70%，甘草總黃酮純度可達(dá)60%；（3）配方合理、實(shí)用：該申請利用甘草酸、甘草總黃酮的理化性質(zhì)，使用乙醇洗脫總黃酮，NaOH水溶液洗脫甘草酸，結(jié)晶干燥，既科學(xué)合理、實(shí)用，又保證其質(zhì)量；（4）可以得到甘草總總黃酮，簡化了甘草總黃酮的提取過程，避免了甘草總黃酮的浪費(fèi)；（5）制備工藝簡單、質(zhì)量好、純度高，最重要是適用于規(guī)模化制備。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的工藝流程示意圖；

圖2本發(fā)明所使用的連續(xù)色譜裝置示意圖圖；

圖3本發(fā)明中甘草酸的高效液相色譜圖；

圖4 本發(fā)明中甘草總黃酮的高效液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

將甘草的根或莖粉碎，取2000g甘草粉末加12L的氨醇溶液于燒杯中，攪拌均勻后，將其倒入滲濾裝置中，再向滲濾柱中緩慢加入68L的含0.5%氨水、70%乙醇的氨醇水溶液，設(shè)置流入速度為5ml/min，調(diào)節(jié)流出速度與流入速度一致，收集滲濾液，得甘草提取液。將甘草提取液上樣至裝有D941樹脂的連續(xù)色譜裝置進(jìn)行以流速為14.08ml/min進(jìn)行吸附，設(shè)置單柱運(yùn)行時間為107min，收集上樣流出液，用70%乙醇溶液以流速為14.00ml/min洗脫吸附在樹脂上的少量甘草總黃酮，并收集乙醇洗脫液1，再用0.5mol/L NaOH水溶液以流速為7.89ml/min洗脫甘草酸，并收集NaOH洗脫液。合并上樣流出液、乙醇洗脫液1，將合并液旋蒸至溶液中不含乙醇為止，并將旋蒸液上樣至裝有聚酰胺樹脂的色譜柱上進(jìn)行吸附，再用6倍量乙醇溶液以流速為1.5BV/h洗脫，收集液乙醇洗脫液2，最后將乙醇洗脫液2旋蒸干燥，得到甘草總總黃酮63.81g，用蘆丁比色法測定其純度為67.33%。然后用1 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)NaOH洗脫液pH = 7并旋蒸干燥，得到甘草酸粗品1，再用純甲醇溶解甘草酸粗品1，過濾以去除其中的鹽分，收集濾液并選蒸干燥，得到甘草酸粗品2，最后用冰醋酸將甘草酸粗品2重結(jié)晶，過濾干燥得到甘草酸精品43.84g，用HPLC法測定其純度為76.53%。

實(shí)施例2：

將甘草的根或莖粉碎，取1000g甘草粉末加6L的氨醇溶液于燒杯中，攪拌均勻后，將其倒入滲濾裝置中，再向滲濾柱中緩慢加入34L的0.5%氨水、70%乙醇的氨醇水溶液，設(shè)置流入速度為5ml/min，調(diào)節(jié)流出速度與流入速度一致，收集滲濾液，得甘草提取液。將甘草提取液上樣至裝有D941樹脂的連續(xù)色譜裝置進(jìn)行以流速為14.08ml/min進(jìn)行吸附，設(shè)置單柱運(yùn)行時間為107min，收集上樣流出液，用70%乙醇溶液以流速為14.00ml/min洗脫吸附在樹脂上的少量甘草總黃酮，并收集乙醇洗脫液1，再用0.5mol/L NaOH水溶液以流速為7.89ml/min洗脫甘草酸，并收集NaOH洗脫液。合并上樣流出液、乙醇洗脫液1，將合并液旋蒸至溶液中不含乙醇為止，并將旋蒸液上樣至裝有聚酰胺樹脂的色譜柱上進(jìn)行吸附，再用6倍量乙醇溶液以流速為1.5BV/h洗脫，收集液乙醇洗脫液2，最后將乙醇洗脫液2旋蒸干燥，得到甘草總總黃酮29.67g，用蘆丁比色法測定其純度為61.21%。然后用1 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)NaOH洗脫液pH = 7并旋蒸干燥，得到甘草酸粗品1，再用純甲醇溶解甘草酸粗品1，過濾以去除其中的鹽分，收集濾液并選蒸干燥，得到甘草酸粗品2，最后用冰醋酸將甘草酸粗品2重結(jié)晶，過濾干燥得到甘草酸精品24.11g，用HPLC法測定其純度為72.70%。

實(shí)施例3：

將甘草的根或莖粉碎，取4000g甘草粉末加24L的氨醇溶液于燒杯中，攪拌均勻后，將其倒入滲濾裝置中，再向滲濾柱中緩慢加入136L的0.5%氨水、70%乙醇的氨醇水溶液，設(shè)置流入速度為5ml/min，調(diào)節(jié)流出速度與流入速度一致，收集滲濾液，得甘草提取液。將甘草提取液上樣至裝有D941樹脂的連續(xù)色譜裝置進(jìn)行以流速為14.08ml/min進(jìn)行吸附，設(shè)置單柱運(yùn)行時間為107min，收集上樣流出液，用70%乙醇溶液以流速為14.00ml/min洗脫吸附在樹脂上的少量甘草總黃酮，并收集乙醇洗脫液1，再用0.5mol/L NaOH水溶液以流速為7.89ml/min洗脫甘草酸，并收集NaOH洗脫液。合并上樣流出液、乙醇洗脫液1，將合并液旋蒸至溶液中不含乙醇為止，并將旋蒸液上樣至裝有聚酰胺樹脂的色譜柱上進(jìn)行吸附，再用6倍量乙醇溶液以流速為1.5BV/h洗脫，收集液乙醇洗脫液2，最后將乙醇洗脫液2旋蒸干燥，得到甘草總總黃酮136.48g，用蘆丁比色法測定其純度為70.39%。然后用1 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)NaOH洗脫液pH = 7并旋蒸干燥，得到甘草酸粗品1，再用純甲醇溶解甘草酸粗品1，過濾以去除其中的鹽分，收集濾液并選蒸干燥，得到甘草酸粗品2，最后用冰醋酸將甘草酸粗品2重結(jié)晶，過濾干燥得到甘草酸精品110.91g，用HPLC法測定其純度為82.88%。