本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤靶向性金屬配合物及合成方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

中國的癌癥發(fā)病率和死亡率一直在上升，從2010年開始已經(jīng)成為主要的致死原因，成為了中國以及全球的一個主要公共衛(wèi)生問題。據(jù)統(tǒng)計，預(yù)計2015年有4292000個新癌癥病例和2814000個癌癥死亡。在眾多治療的癌癥的策略中，腫瘤診療是一種將治療和診斷成像相結(jié)合的綜合治療策略，它可同時實現(xiàn)精確的醫(yī)學(xué)診斷和藥物治療。[B Kumar,et al,Journal of the American Chemical Society,2014,136,17836-17843]在眾多的材料和化合物中，具有磷光發(fā)光特性的金屬配合物在診療劑的研究引起廣泛的關(guān)注。因為金屬配合物為藥物設(shè)計提供了一個寬闊的平臺，通過改變輔助的配體種類和數(shù)量，可以調(diào)節(jié)配合物的發(fā)光性質(zhì)和抗腫瘤活性。

金屬配合物是抗腫瘤藥物重要的一員。順鉑是第一個臨床應(yīng)用抗腫瘤活性的，且鉑類抗腫瘤藥物得到廣泛的應(yīng)用。但臨床上使用順鉑會產(chǎn)生嚴重的毒副作用，如腎毒性、神經(jīng)毒性、惡心和嘔吐等，因此尋找低毒高效的非鉑類藥物成為亟待解決的問題。釕(II/III)配合物被認為是代替鉑類抗腫瘤藥物最有潛力的一類藥物。它們展示出新型的抗腫瘤機制，因此和鉑類藥物展現(xiàn)出交叉耐藥性。當前，尋找作用機制明確抗腫瘤的金屬配合物已成為研究的熱點。

過渡金屬配合物如釕(II)、銥(III)、銠(III)和鉑(II)等具有獨特的d電子構(gòu)型，使之能發(fā)射出高強度的磷光。在過去十年，大量的具有發(fā)光特性的過渡金屬配合物合成，并廣泛應(yīng)用在分子探針、生物成像和發(fā)光二極管研究中。相對于有機分子，金屬配合物在分子探針和成像具有以下優(yōu)勢：(1)金屬配合物具有較高的磷光效能；(2)其可調(diào)節(jié)的激發(fā)和發(fā)射波長能夠涵蓋整個可見光區(qū)域，甚至是近紅外區(qū)域，使之能夠容易辨認；(3)擁有較大的Stokes位移，使配合物具有易于區(qū)別的發(fā)射光譜和有效地避免自身熒光淬滅；(4)相對于有機熒光分子，配合物具有相對長的熒光壽命，一般達到100ns～100μs[Q Zhao,et al,Chemical.Society.Review.,2011,40,2508–2524.]。

盡管金屬配合物在診療方面具有應(yīng)用潛力，但小分子藥物在體內(nèi)應(yīng)用中往往遇到對正常組織選擇性差，生物利用低等缺點?；谀[瘤快速增殖和永生性的特點，其細胞膜會過度表 達某些蛋白受體，如整合素、葉酸和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體。因此將小分子藥物共價連接在靶向藥物運輸系統(tǒng)上，可以選擇性地將小分子藥物運輸?shù)侥[瘤區(qū)域，并且在腫瘤特有的微環(huán)境進行釋放。故此，通過構(gòu)建腫瘤靶向性的藥物系統(tǒng)，運輸具有診斷治療效果的金屬配合物到達腫瘤組織，將成為具有創(chuàng)新性和應(yīng)用前景藥物開發(fā)領(lǐng)域。

目前，抗腫瘤藥物已廣泛應(yīng)用于癌癥的治療，但這些藥物對腫瘤細胞和正常細胞選擇性，在治療癌細胞的同時，也影響了正常機體功能。因此，提高藥物生物利用度，減少全身毒性反應(yīng)是腫瘤化學(xué)治療迫切解決的問題。開發(fā)安全低毒、具有腫瘤特異性且能高效負載抗腫瘤藥物的腫瘤遞藥系統(tǒng)勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供一種腫瘤靶向性金屬配合物的合成方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供通過所述合成方法得到的腫瘤靶向性金屬配合物。

本發(fā)明的又一目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，提供所述的腫瘤靶向性金屬配合物的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種腫瘤靶向性金屬配合物的合成方法，將具有取代基團的配體通過連接具有靶向性的分子，配體與金屬離子進行配位，合成腫瘤靶向性金屬配合物。

所述的配體為菲咯啉衍生物、聯(lián)吡啶衍生物、苯并咪唑類衍生物、苯基-吡啶類衍生物和噻吩-吡啶類衍生物中的一種。

所述的菲咯啉衍生物包括1,10-菲咯啉、5,6-二甲基-1,10-菲咯啉、5-硝基-6氨基-1,10-菲咯啉、5-硝基-1,10-菲咯啉、4-醛基-1,10-菲咯啉、1,10-菲咯啉-4-甲酸、2,9-二氯-1,10-菲咯啉、4,7-二苯基-1,10-菲咯啉、咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉、[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉等；優(yōu)選為咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉和[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉。

所述的聯(lián)吡啶衍生物包括2,2'-聯(lián)吡啶、2,2'-聯(lián)吡啶-3,3'-二羧酸、4,4'-二甲基-2,2'-聯(lián)吡啶、4,4'-二氨基-2,2'-聯(lián)吡啶、4,4'-二氯-2,2'-聯(lián)吡啶、6,6'-二氰基-2,2'-聯(lián)吡啶等；優(yōu)選為4-甲基-2,2-聯(lián)吡啶-4-甲酸。

所述的苯并咪唑類衍生物包括2-(2-吡啶)-苯并咪唑、2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-甲基、2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸等；優(yōu)選為2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸。

所述的苯基-吡啶類衍生物包括2-(2-溴苯基)吡啶、2-(3-溴苯基)吡啶、2-(4-氯苯基)吡啶、2-(2-羥基苯基)吡啶、4-(2-吡啶基)-苯甲醛、2-(4-氨基苯基)吡啶、2-(4-甲基苯基) 吡啶、2-(2,4-二氟苯基)吡啶、2-(4-硝基苯基)吡啶、2-(2-噻吩)吡啶、2-(2-吡啶基)苯并噻吩；優(yōu)選為2-(2-噻吩)吡啶。

所述的具有靶向性的分子為生物素、葉酸、整合素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、穿膜肽、八聚精氨酸、MUC-1附膜蛋白(粘蛋白1)、半乳糖胺、新生血管靶向肽和粒細胞巨噬細胞刺激因子中的一種；優(yōu)選為生物素。

所述的連接為配體直接或通過橋連分子與具有靶向性的分子連接。

所述的橋連分子為含有可供縮合反應(yīng)的官能團的烷烴類衍生物或氨基酸分子，包括乙二胺，己二胺、4-氨基丁酸、戊二酸、1，5-戊二醇、3,6,9-三氧雜十一烷-1,11-二胺、甘氨酸、天冬氨酸等；優(yōu)選為己二胺。

所述的可供縮合反應(yīng)的官能團優(yōu)選為氨基、羧基、羥基和巰基中的至少一種。

所述的金屬離子為釕(II)、鋨(II)、銠(III)和銥(III)離子中的一種。

所述的腫瘤靶向性金屬配合物的合成方法，優(yōu)選通過如下任一種方法實現(xiàn)：

S1：腫瘤靶向性釕配合物的合成

(1)將2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配體I)、EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)溶解于DMF(二甲基甲酰胺)中，加熱至60℃進行反應(yīng)，再加入產(chǎn)物A和三乙胺繼續(xù)反應(yīng)，然后加入冰水，抽濾，得到產(chǎn)物B，其中，2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC、NHS和產(chǎn)物A按摩爾比1：1～2：1～2：1～2進行配比；

(2)將金屬化合物和配體II加入DMF中，于100～140℃進行反應(yīng)，再加入丙酮析出沉淀，過濾、洗滌，烘干得到產(chǎn)物C，其中，金屬離子和配體II按摩爾比1：2進行配比，配體II為咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉或[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉；

(3)將步驟(1)得到的產(chǎn)物B和步驟(2)得到的產(chǎn)物C加入乙二醇乙醚中，于90～130℃進行反應(yīng)，冷卻，再加入飽和高氯酸鈉溶液，得到腫瘤靶向性金屬配合物，其中，產(chǎn)物B和產(chǎn)物C按摩爾比1：1進行配比；

或者是：

S2：腫瘤靶向性銥配合物的合成

(a)將4-甲基-2,2-聯(lián)吡啶-4-甲酸、EDC和NHS溶解于DMF中，加熱至60℃進行反應(yīng)，再加入產(chǎn)物A和三乙胺繼續(xù)反應(yīng)，然后加入冰水，抽濾，得到產(chǎn)物D，其中，4-甲基-2,2-聯(lián)吡啶-4-甲酸、EDC、NHS和產(chǎn)物A按摩爾比1：1～2：1～2：1～2進行配比；

(b)將金屬化合物和2-(2-噻吩)吡啶加入乙二醇乙醚和水的混合溶劑中，于90～130℃進行反應(yīng)，冷卻，抽濾，取固體，洗滌，烘干，得到產(chǎn)物E，其中，金屬化合物和2-(2-噻吩)吡啶按摩爾比1：2進行配比；

(c)將步驟(a)得到的產(chǎn)物D和步驟(b)得到的產(chǎn)物E加入甲醇和二氯甲烷的混合溶 劑中，于10～70℃進行反應(yīng)，冷卻，再加入六氟磷酸銨攪拌進行反應(yīng)，然后蒸發(fā)溶劑，洗滌，得到腫瘤靶向性金屬配合物，其中，產(chǎn)物D、產(chǎn)物E和六氟磷酸銨按摩爾比1：1：1～20進行配比；

步驟(1)和步驟(a)中所述的產(chǎn)物A通過如下方法制備得到：將己二胺溶解于DMF中，再加入生物素-N-琥珀酰亞胺基酯，常溫反應(yīng)，再加入冰水，抽濾，洗滌，得到產(chǎn)物A，其中，生物素-N-琥珀酰亞胺基酯和己二胺按摩爾比1:1～30進行配比。

所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為24h。

所述的冰水的用量優(yōu)選為按冰水與DMF的體積比5:1配比計算。

所述的洗滌為用水洗滌兩次。

所述的生物素-N-琥珀酰亞胺基酯和己二胺優(yōu)選為按摩爾比1:6進行配比。

所述的生物素-N-琥珀酰亞胺基酯優(yōu)選通過如下方法制備得到：將1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和D-生物素混合在二甲基甲酰胺(DMF)中，于10～100℃反應(yīng)2h～4h，再加入冰水，過濾、取沉淀，得到生物素-N-琥珀酰亞胺基酯，其中，EDC、NHS和D-生物素按摩爾比1：1～2：1～2進行配比。

所述的反應(yīng)優(yōu)選為常溫條件下進行反應(yīng)。

所述的的時間優(yōu)選為4h。

所述的冰水的用量為按冰水與DMF的體積比5:1配比計算。

所述的EDC、NHS和D-生物素優(yōu)選為按摩爾比1：1：1進行配比。

步驟(1)中所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸優(yōu)選通過如下方法制備得到：將3，4-二氨基苯甲酸溶于乙醇中，加入吡啶-2-甲醛進行反應(yīng)，蒸發(fā)、加入冰水析出后過濾，得到2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配體I)，其中，3，4-二氨基苯甲酸和吡啶-2-甲醛按摩爾比1:1進行配比。

所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸(配體I)還可以進一步經(jīng)硅膠柱層析純化。

所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為2h。

所述的蒸發(fā)優(yōu)選為蒸發(fā)部分乙醇至體系體積的一半。

所述的冰水的用量為按冰水與乙醇的體積比4:1配比計算。

步驟(1)和步驟(a)中所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為2h。

步驟(1)和步驟(a)中所述的加入產(chǎn)物A和三乙胺繼續(xù)反應(yīng)的時間優(yōu)選為24h。

步驟(1)和步驟(a)中所述的三乙胺與DMF的體積比為1：10～60，優(yōu)選為1：30。

步驟(1)中所述的產(chǎn)物B還可以進一步經(jīng)硅膠柱層析純化。

所述的硅膠柱層析為采用乙酸乙酯和甲醇的洗脫液進行洗脫。

所述的乙酸乙酯和甲醇的體積比為1：1。

步驟(1)中所述的2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸、EDC、NHS和產(chǎn)物A優(yōu)選為按摩爾比1：1：1：1進行配比。

步驟(2)中所述的金屬化合物為釕和鋨化合物中的一種；優(yōu)選為RuCl₃。

步驟(2)中所述的咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉優(yōu)選通過如下方法制備得到：將1,10-鄰菲咯啉-5,6-二酮溶解于乙酸，加入醋酸銨和甲醛于110℃回流反應(yīng)，調(diào)pH值至11，抽濾，得到咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉，其中，1,10-鄰菲咯啉-5,6-二酮和甲醛按摩爾比1:1進行配比。

所述的咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉還可以進一步經(jīng)硅膠柱層析純化。

所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為6h。

所述的調(diào)pH值優(yōu)選為加入氨水進行調(diào)pH值。

步驟(2)中所述的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉優(yōu)選通過如下方法制備得到：將1,10-鄰菲咯啉-5,6-二胺溶解于乙醇中，加入二氧化硒，加熱至90℃回流反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉，其中，1,10-鄰菲咯啉-5,6-二胺和二氧化硒按摩爾比1:1.2進行配比。

所述的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉還可以進一步純化。

所述的純化優(yōu)選通過如下方法實現(xiàn)：將[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉用乙醇洗滌，再用甲醇溶解、過濾、重結(jié)晶，得到純化的[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉。

所述的洗滌的次數(shù)優(yōu)選為2次。

所述的過濾為通過過濾除去不溶物。

所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為6h。

步驟(2)和步驟(b)中所述的反應(yīng)優(yōu)選為在惰性氣體保護下進行反應(yīng)。

所述的惰性氣體優(yōu)選為氬氣。

步驟(2)中所述的反應(yīng)的溫度優(yōu)選為140℃，反應(yīng)的時間優(yōu)選為8h。

步驟(2)中所述的加入丙酮析出沉淀的溫度優(yōu)選為-20℃。

步驟(2)中所述的洗滌為用-20℃的凍丙酮洗滌2次。

步驟(3)和步驟(c)中所述的反應(yīng)的溫度優(yōu)選為130℃，反應(yīng)的時間優(yōu)選為6h。

步驟(3)和步驟(c)中所述的腫瘤靶向性金屬配合物還可以進一步經(jīng)氧化鋁柱層析純化。

所述的氧化鋁膠柱層析為采用二氯甲烷和甲醇的洗脫液進行洗脫。

所述的二氯甲烷和甲醇的體積比為10～60：1，優(yōu)選為30～60：1。

步驟(a)中所述的產(chǎn)物D還可以進一步經(jīng)硅膠柱層析純化。

所述的硅膠柱層析為采用乙酸乙酯和甲醇的洗脫液進行洗脫。

所述的乙酸乙酯和甲醇的體積比為1～10：1。

步驟(b)中所述的金屬化合物為銠和銥化合物中的一種；優(yōu)選為IrCl₃。

步驟(b)中所述的混合溶劑中乙二醇乙醚和水體積比為1～6：1，優(yōu)選為3：1。

步驟(b)中所述的反應(yīng)的時間優(yōu)選為12h。

步驟(c)中所述的混合溶劑中二氯甲烷和甲醇的體積比為1～6：1。

步驟(c)中所述的加入六氟磷酸銨攪拌進行反應(yīng)的時間優(yōu)選為10h。

一種腫瘤靶向性金屬配合物，通過上述任一項所述的方法制備得到。

所述的腫瘤靶向性金屬配合物優(yōu)選為釕配合物和銥配合物中的至少一種；更優(yōu)選為配合物Ru-Bio、Ru-Bse和Ir-Bty中的至少一種，所述的Ru-Bio、Ru-BSe和Ir-Bty的結(jié)構(gòu)式如式I、式II和式III所示：

所述的腫瘤靶向性金屬配合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

所述的腫瘤靶向性金屬配合物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤靶向性金屬配合物在劑量為1～10μmol/Kg能有效抑制裸鼠荷瘤模型的腫瘤組織的增殖，優(yōu)選為4～5μmol/Kg。

所述的腫瘤為人非小細胞肺癌、人宮頸癌、黑色素瘤、人成骨肉瘤、乳腺癌或腦膠質(zhì)瘤。

所述的腫瘤靶向性金屬配合物在分子探針、細胞成像和活體熒光成像等領(lǐng)域中應(yīng)用。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明涉及金屬配合物在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，具體公開了靶向性金屬配合物和其配體的制備、表征及其在腫瘤診斷治療方面的應(yīng)用。制備方法如下：在配體上共價連接具有腫瘤靶向性的生物分子，合成具有磷光發(fā)光特性的過度金屬配合物。本發(fā)明基于正常細胞和腫瘤細胞之間的差異，對傳統(tǒng)的金屬配合物進行修飾，提高抗腫瘤藥物的利用度和降低毒副 性。同時利用金屬配合物良好的磷光性質(zhì)，有效地對腫瘤細胞和組織成像，實現(xiàn)診斷治療的功效。對配合物的抗腫瘤機制進行探究，為開發(fā)新型的金屬抗腫瘤藥物提供了新思路。本發(fā)明原料價廉易得，制備方法簡單易行，且制備的產(chǎn)物重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

(2)本發(fā)明對傳統(tǒng)的金屬配合物進行腫瘤靶向性修飾，提高腫瘤組織對藥物的吸收，減低了金屬配合物在體內(nèi)應(yīng)用的毒副性。通過在配合物的配體上引入取代基，引入靶向基團對藥物進行改性，該方法具有良好的可操作性和重現(xiàn)性。

(3)本發(fā)明所合成金屬配合物具有良好的磷光發(fā)射性能，可以用于在生物成像和活體成像。利用熒光實時監(jiān)控技術(shù)，為腫瘤的早期診斷提供診斷劑。

(4)在裸鼠荷瘤模型實驗中，本發(fā)明所合成的藥物對腫瘤組織的增殖具有明顯的抑制效果，且對正常組織毒副性低。

(5)本發(fā)明所得產(chǎn)物的原料廉價易得，合成和純化步驟可操作性強，可通過優(yōu)化工藝，適當擴大合成規(guī)模，實現(xiàn)藥物的商業(yè)化和應(yīng)用。

(6)當前使用的小分子抗腫瘤藥物和診斷劑，對腫瘤細胞的選擇性較低。本發(fā)明合成腫瘤靶向性的金屬配合物，基于腫瘤細胞和正常細胞的差異，有效地被腫瘤組織吸收，在裸鼠荷瘤模型中，實現(xiàn)對腫瘤的診斷和治療。對比于傳統(tǒng)的鉑類抗腫瘤藥物，具有更低的毒性和對腫瘤成像的能力。在其抗腫瘤作用機制研究，發(fā)現(xiàn)所合成的配合物能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞的線粒體功能紊亂和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，提高了細胞內(nèi)活性氧水平，激活腫瘤細胞內(nèi)源性凋亡通路。

附圖說明

圖1為配體2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸的合成路線圖。

圖2為多吡啶配體的合成路線；其中，圖a為配體咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉的合成路線圖，圖b[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉的合成路線圖。

圖3為靶向配體的合成路線圖。

圖4為腫瘤靶向性釕配合物的合成路線圖。

圖5為腫瘤靶向性銥配合物的合成路線圖。

圖6為所合成的配合物的結(jié)構(gòu)式。

圖7為配合物的紫外可見光吸收光譜和熒光發(fā)射光譜圖；其中，圖a為釕配合物的紫外可見光吸收光譜，圖b為釕配合物的熒光發(fā)射光譜，圖c為銥配合物的熒光發(fā)射光譜。

圖8為宮頸癌細胞HeLa和人肝細胞L02對含硒藥物的吸收圖。

圖9為靶向配合物Ru-BSe選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡圖。

圖10為釕配合物對細胞內(nèi)線粒體膜電位的影響圖。

圖11為釕配合物對線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路相關(guān)蛋白的調(diào)控圖。

圖12為經(jīng)系列釕配合物處理4h后，細胞內(nèi)ROS水平的變化圖。

圖13為細胞內(nèi)凋亡相關(guān)的Caspase家族蛋白的活性檢測結(jié)果圖；其中，圖a為釕配合物激活Caspase-3和9蛋白的活性，圖b為釕配合物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡。

圖14為經(jīng)過Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)注射后，釕(II)配合物在HeLa荷瘤裸鼠模型的體內(nèi)不同時間段的熒光成像圖。

圖15為釕配合物經(jīng)尾靜脈注射72h后，在不同器官內(nèi)的分布(腦、心、肝、脾、肺、腎和腫瘤)結(jié)果圖。

圖16為經(jīng)含硒釕配合物Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)處理30天后，HeLa荷瘤裸鼠模型的(a)體重和(b)腫瘤體積的變化圖；其中，圖a為腫瘤體積變化，圖b為體重變化。

圖17為釕配合物在經(jīng)歷30天體內(nèi)抗腫瘤活性研究后的體內(nèi)分布圖。

圖18為H&E染色檢測經(jīng)含硒釕配合物處理后，裸鼠模型的臟器損傷情況圖；其中，箭頭標記強調(diào)正常器官組織的病理學(xué)變化和腫瘤組織的細胞異型性。

圖19為經(jīng)含硒釕(II)配合物注射72h后，裸鼠血清的生化指標圖；其中。圖a～h分別為：尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血清甘油三酯(TG)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、血清總蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)和肌酸激酶(CK)。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1腫瘤靶向性配合物的制備和表征

1、腫瘤靶向性釕配合物的制備

(1)配體1的合成：如圖1所示，取3，4-二氨基苯甲酸3.04g(20mmol)溶于100mL無水乙醇在單口燒瓶中，使用分液漏斗于20min內(nèi)滴加入吡啶-2-甲醛2.14g(20mmol)。室溫反應(yīng)2h后，蒸發(fā)部分乙醇至50mL，加入200mL冰水析出黃色固體，過濾得到固體，再使用硅膠柱層析(硅膠顆粒100～200目，購于阿拉丁試劑有限公司，柱徑高為1cm×10cm，下同)提純上述產(chǎn)物，用3mL乙酸乙酯溶解樣品上樣，每次上樣量為1g，洗脫劑為乙酸乙酯和甲醇的混合溶劑，體積比為3～1：1，進行梯度洗脫，收集黃色洗脫液，蒸發(fā)溶劑得到黃色固體，為苯并咪唑類衍生物：2-(2-吡啶)-苯并咪唑-5-羧酸，產(chǎn)率：71.3％。

(2)配體2(IP)的合成：如圖2所示，咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉的合成：稱取2.51g(12mmol)1,10-鄰菲咯啉-5,6-二酮溶解于60mL乙酸中，并加入3g醋酸銨和0.36g(12mmol)甲醛。反應(yīng)加熱至110℃回流攪拌6h。待反應(yīng)結(jié)束后，向體系加入氨水，將pH值調(diào)至11，抽濾得到固體使用100～200目的硅膠進行柱層析提純，使用3mL甲醇溶解樣品上樣，每次上樣量為1g，洗脫劑為無水甲醇，得到黃色固體，為菲咯啉衍生物：咪唑[4,5-f]-[1,10]菲咯啉， 產(chǎn)率：66.3％。

(3)配體3(PhenSe)的合成：如圖3所示，稱取2.1g(10mmol)1,10-鄰菲咯啉-5,6-二胺于100mL的圓底燒瓶中，并加入300mL的乙醇超聲溶解。常溫攪拌下，往燒瓶加入2.1g(12mmol)二氧化硒，加熱至90℃回流攪拌6h。待反應(yīng)結(jié)束后，將圓底燒瓶內(nèi)的液體旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到粗產(chǎn)物。使用少量乙醇洗滌兩次，并用200mL甲醇加熱至60℃溶解，將不溶物過濾。重結(jié)晶后得到粉紅色固體粉末，為菲咯啉衍生物：[1,2,5]硒二唑[3,4-f][1,10]菲咯啉；產(chǎn)率：67.3％。

(4)產(chǎn)物4的合成：如圖4所示，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)3.83g(20mmol)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)2.30g(20mmol)和D-生物素(購于阿拉丁試劑有限公司)4.87g(20mmol)混合在40mL的二甲基甲酰胺(DMF)中。反應(yīng)在常溫下攪拌4小時后，加入200mL冰水中，過濾得到生物素-N-琥珀酰亞胺基酯。13.9g(120mmol)的己二胺溶解于40mL的DMF中，緩慢滴加上述生物素-N-琥珀酰亞胺基酯6.82g(20mmol)，在常溫反應(yīng)24小時后，倒入加入200mL冰水中，抽濾得到淡黃色固體，并用100mL的水洗滌兩次得到產(chǎn)物4，產(chǎn)率：77.1％。

(5)產(chǎn)物5的合成：0.49g(2.05mmol)配體1，0.39g(2.05mmol)EDC，0.24g(2.05mmol)NHS溶解于30mL DMF，加熱至60℃反應(yīng)2h。0.7g產(chǎn)物4(2.05mmol)和1mL三乙胺加入至上述反應(yīng)中，并保持反應(yīng)24h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液倒入100mL冰水中，抽濾得到黃色的粗產(chǎn)物。使用100-200目的硅膠進行柱層析提純，使用3mL預(yù)制洗脫液(70％(v/v)乙酸乙酯、30％(v/v)甲醇)溶解樣品上樣，每次上樣量為1g，洗脫液為體積比乙酸乙酯：甲醇為1：1的混合溶液，收集淡黃色的洗脫液，蒸發(fā)溶劑得到產(chǎn)物5，產(chǎn)率：54.1％。

(6)產(chǎn)物6的合成：如圖5所示，將1mmol的RuCl₃與2mmol配體2加入15mL的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，反應(yīng)在氬氣保護下加熱至140℃攪拌8h。待反應(yīng)冷卻至室溫，加入100mL的丙酮放置-20℃過夜。將反應(yīng)過濾，濾渣用20mL的-20℃的凍丙酮洗滌兩次，烘干得到產(chǎn)物6，待用；產(chǎn)率：56.9％。

(7)配合物Ru-Bio的合成：如圖5所示，將上述產(chǎn)物5(0.15g；0.25mmol)與產(chǎn)物6(0.14g；0.25mmol)，溶解于30mL乙二醇乙醚中130℃反應(yīng)6h，得到紅色溶液。冷卻至室溫后，該溶液加入50mL飽和高氯酸鈉溶液，得到紅色沉淀，并用氧化鋁柱層析純化(氧化鋁規(guī)格為200-300目，購于阿拉丁試劑有限公司，柱徑高為1cm×10cm，下同)，利用5mL二氯甲烷溶解樣品，每次上樣量為0.4g，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇，體積比為30：1，蒸發(fā)溶劑，得到配合物Ru-Bio，產(chǎn)率：49.3％。

(8)配合物Ru-BSe的合成：參照步驟(7)中配合物Ru-Bio的合成，以等物質(zhì)的量的 配體3代替配體2進行同樣的合成步驟，得到配合物Ru-Bse，產(chǎn)率37.1％。

所得釕配合物如結(jié)構(gòu)式如圖6所示。利用ESI-TOFMS質(zhì)譜法、核磁共振氫譜和碳譜、CHN元素分析進行表征。

2、腫瘤靶向性銥配合物的制備

(1)參照實施例1腫瘤靶向性釕配合物的制備方法，合成產(chǎn)物4。

(2)產(chǎn)物7的合成：如圖6所示，將0.44g(2.05mmol)4-甲基-2,2-聯(lián)吡啶-4-甲酸、0.39g EDC(2.05mmol)和0.24g NHS(2.05mmol)溶解于DMF中，加熱至60℃進行反應(yīng)2h，再加入步驟(1)中得到的0.70g產(chǎn)物4(2.05mmol)和1mL三乙胺繼續(xù)反應(yīng)24h，然后加入冰水，抽濾，得到產(chǎn)物7，產(chǎn)率69.4％。

(3)產(chǎn)物8的合成：將0.70g三氯化銥(2mmol)和0.65g(4mmol)2-(2-噻吩)吡啶加入乙二醇乙醚與水的混合溶劑(乙二醇乙醚與水的體積比為3：1)中，反應(yīng)溫度為130℃，反應(yīng)時間為12h。溶液冷卻室溫后，抽濾得到產(chǎn)物E，并用去離子水沖洗后，烘干固體，產(chǎn)率82.7％。

(4)配合物Ir-Bty的合成：將步驟(2)得到的0.27g產(chǎn)物7(0.5mmol)和步驟(3)得到的0.19g產(chǎn)物8(0.5mmol；按銥的物質(zhì)的量計算)加入100mL甲醇和二氯甲烷的混合溶劑(甲醇和二氯甲烷的體積比為1：1～6)中，反應(yīng)溫度為60℃，反應(yīng)時間為10h。溶液冷卻室溫后，加入1.64g六氟磷酸銨(10mmol)攪拌后，蒸發(fā)溶劑，得到的固體使用去離子水洗滌。粗產(chǎn)物使用200～300目的氧化鋁進行柱層析純化，用5mL二氯甲烷溶解樣品，每次上樣量為0.5g，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇混合溶劑(體積比60：1)。蒸發(fā)溶劑，得到固體Ir-Bty，產(chǎn)率為67.3％。

所得銥配合物如結(jié)構(gòu)式如圖6所示。利用ESI-TOFMS質(zhì)譜法、核磁共振氫譜、CHN元素分析進行表征。

3、非腫瘤靶向性釕配合物的制備

為了證明配合物的腫瘤靶向性功能，合成了無靶向分子修飾的釕配合物Ru-IP和Ru-Se進行對比。參照上述腫瘤靶向性釕配合物的的合成方法合成釕配合物Ru-IP和Ru-Se：

(1)參照實施例1腫瘤靶向性釕配合物的制備，得到產(chǎn)物6。

(2)配合物Ru-IP的合成：取上述0.15g產(chǎn)物6(0.25mmol)與0.05g 2-(2-吡啶)-苯并咪唑(0.25mmol)溶解于30mL乙二醇乙醚中，于130℃反應(yīng)6h，得到紅色溶液。冷卻至室溫后，該溶液加入50mL飽和高氯酸鈉溶液，得到紅色沉淀，并用200-300目的氧化鋁進行柱層析純化，用5mL二氯甲烷溶解樣品，洗脫劑為二氯甲烷和甲醇(體積比為30：1)，得到配合物Ru-IP。產(chǎn)率：43.7％。

(3)配合物Ru-Se的合成：參照配合物Ru-IP的合成，以等物質(zhì)的量的配體3代替配體2進行同樣的合成步驟，得到配合物Ru-Se，產(chǎn)率32.8％。

所得釕配合物如結(jié)構(gòu)式如圖6所示。利用ESI-TOFMS質(zhì)譜法、核磁共振氫譜和碳譜、CHN元素分析進行表征。

Ru-Bio

Anal.Calcd for C₅₅H₅₃Cl₂N₁₅O₁₁RuS(％):C,50.65；H,4.10；N,16.11Found(％):C,50.73；H,4.11；N,16.13.ESI-TOFMS(CH₃OH):m/z 1104.7496[M-2ClO₄-H⁺]⁺.¹H NMR(DMSO-d₆,δppm):13.48(d,1H),9.03(t,2H),8.97(t,2H),8.72(d,2H),8.64(s,1H),8.55-8.46(m,4H),8.33(d,1H),8.13(d,1H),7.92(d,1H),7.79(t,1H),7.73(t,2H),7.65(t,2H),7.57-7.34(m,5H),6.43(d,2H),4.48(t,1H),4.41(t,1H),3.64(q,2H),3.44(q,1H),3.39(q,2H),3.21(t,1H),2.98(d,2H),2.42(t,2H),1.99-1.79(m,6H),1.73(t,3H),1.63(m,6H).¹³C NMR(DMSO-d6,δppm):172.44,167.08,163.45,163.31,159.56,155.65,153.49,151.78,150.06,148.76,145.97,140.98,138.24,132.37,129.07,125.58,61.63,59.78,56.02,38.89,35.80,29.79,29.74,28.80,28.63,26.85,26.76,25.94.

Ru-BSe

Anal.Calcd for C₅₃H₄₉Cl₂N₁₅O₁₁RuSe₂S(％):C,44.39；H,3.44；N,14.65；Found(％):C,44.41；H,3.56；N,14.55.ESI-TOFMS(CH₃OH):m/z 1234.7032[M-2ClO₄-H⁺]⁺,628.8790[M-2ClO₄+Na]²⁺,618.4017[M-2ClO₄]²⁺.¹H NMR(DMSO-d₆,δppm):13.33(d,1H),8.77(d,1H),8.51(d,1H),8.35(d,1H),8.27(s,1H),8.03(m,1H),7.83(t,1H),7.74(q,1H),7.56(t,1H),6.40(d,2H),4.29(t,1H),4.13(t,1H),3.29(q,2H),3.09(q,1H),3.04(q,2H),2.80(dd,1H),2.57(d,1H),2.08(t,2H),1.65-1.40(m,9H),1.40-1.20(m,6H).¹³C NMR(DMSO-d6,δppm):177.58,171.88,168.16,165.92,161.65,159.57,157.08,156.47,154.62,152.33,142.41,139.29,134.16,133.80,132.98,130.00,129.60,126.54,126.04,67.24,63.13,61.21,57.33,36.46,30.22,30.20,29.03,27.20,27.11,26.26.

Ir-Bty

Anal.Calcd for C₄₆H₅₂F₆IrN₈O₃PS₃(％):C,46.11；H,4.37；N,9.35；Found(％):C,46.00；H,4.43；N,9.29.ESI-TOFMS(CH₃OH):m/z 1053.2260[M-PF₆]⁺.¹H NMR(DMSO-d₆,δppm):9.14(s,1H),9.05(t,1H),8.88(s,1H),8.01(d,1H),7.92(d,1H),7.84(s,1H),7.77-7.74(m,4H),7.65(t,4H),7.57(t,2H),7.52(d,1H),6.96(q,2H),6.40(d,2H),6.18(t,2H),4.30(s,1H),4.13(t,1H),3.10(q,1H),3.03(q,2H),2.81(dd,1H),2.58(s,3H),2.06(t,2H),1.53-1.44(m,6H),1.41-1.27(m,12H).

Ru-IP

Anal.Calcd for C₃₈H₂₅Cl₂N₁₁O₈Ru(％):C,48.78；H,2.69；N,16.47.Found(％):C,48.68；H,2.66；N,16.39.ESI-TOFMS(CH₃OH):m/z 736.5047[M-2ClO₄-H⁺]⁺,368.8029[M-2ClO₄]²⁺.¹H NMR(DMSO-d₆,δppm):9.03(d,2H),9.01(d,2H),8.94(d,1H),8.75(s,2H),8.94(d,2H),8.75(s,2H),8.73(s,1H),8.71(s,1H),8.06-8.04(dd,4H),7.95(s,4H),7.79-7.77(q,4H).¹³C NMR(DMSO-d₆,δppm):173.35,159.72,155.79,151.17,150.37,149.94,149.51,149.45,147.83,146.85,146.54,146.34,146.08,145.70,144.88,144.65,137.62,129.49,129.37,129.04,126.29,126.18,126.12,125.65,125.02,124.66,124.44,124.17,124.07,121.92,121.11,120.31,119.59,112.90.

Ru-Se

Anal.Calcd for C₃₆H₂₁Cl₂N₁₁O₈RuSe₂(％):C,40.58；H,1.99；N,14.46；Found(％):C,40.46；H,2.05；N,14.27.ESI-TOFMS(CH₃OH):m/z 866.4620[M-2ClO₄-H⁺]⁺,433.8093[M-2ClO₄]²⁺.¹H NMR(DMSO-d₆,δppm):9.00(m,4H),8.42(t,2H),8.32(d,1H),8.24(d,1H),8.01(t,1H),7.93(m,3H),7.81(q,1H),7.77(q,1H),7.65(d,1H),7.55(d,1H),7.22(t,1H),7.08(t,1H),6.87(t,1H),6.54(t,1H)¹³C NMR(DMSO-d₆,δppm):173.39,159.76,155.83,151.20,150.41,149.97,149.55,149.49,147.87,146.88,146.57,146.38,137.66,129.52,129.40,129.07,126.32,126.21,126.16,125.69,125.06,121.96,121.14,120.34,119.63,112.94,173.39,144.92,144.69,124.69,124.48,124.11,124.20.

結(jié)果如圖7所示，釕(II)配合物在PBS溶液的紫外-可見光吸收光譜顯示出兩個吸收峰，270～382nm處較強的吸收峰為配體內(nèi)部(IL)π→π*躍遷，而407～547nm的吸收峰為金屬中心-配體躍遷(MLCT)dπ(Ru)→π*(IP/phenSe)。當釕(II)配合物的PBS溶液在MLCT吸收段處λmax＝467nm激發(fā)，發(fā)射出³MLCT紅色的磷光λmax＝594nm(Ru-IP和Ru-Bio)和λmax＝596nm(Ru-Se和Ru-BSe)。我們進一步測定了釕配合物的熒光壽命，所合成的多吡啶釕(II)配合物Ru-IP和Ru-Bio的熒光壽命分別為0.64和0.69μs，而含硒釕(II)配合物Ru-Se和Ru-BSe的則為0.42和0.50μs。此外，絕對量子產(chǎn)率測試儀測定四個配合物的量子產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)多吡啶釕(II)配合物亦比含硒釕(II)配合物的具有更高的量子產(chǎn)率。銥配合物也在600nm處有熒光發(fā)射。綜上所述，所合成的金屬配合物有較大的Stokes位移和長波長的磷光發(fā)射，表明配合具備體內(nèi)成像的潛力。

表1合成的釕(II)配合物的磷光光學(xué)性質(zhì)

實施例2釕配合物的選擇性吸收

本實施例從細胞層面檢測釕配合物對腫瘤細胞的靶向性：

選用腫瘤細胞生物素受體高表達的HeLa宮頸癌細胞(購于美國菌種保藏中心)和其低表達的L02正常肝細胞(購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)研究藥物的吸收。細胞在DMEM培養(yǎng)基(Gibco，含10％(v/v)的牛血清蛋白，100units/mL盤尼西林和50units/mL鏈霉素)中培養(yǎng)，放置于37℃細胞培養(yǎng)箱(相對濕度為95％、含5％(v/v)CO₂)。

為了證明配合物的腫瘤靶向性的功效，我們利用ICP-MS(電感耦合等離子體質(zhì)譜儀)檢測對不同含硒藥物的吸收。HeLa和L02細胞經(jīng)不同的含硒化合物PhenSe(實施例1制備得到的配體3，終濃度為40μM)、Ru-Se(終濃度為20μM)或Ru-Bse(終濃度為20μM)孵育后，使用PBS溶液(濃度為0.01M；pH＝7.4，下同)洗滌兩次后，用胰酶(購于捷貝斯生物科技有限公司，工作液濃度為0.25％)重懸收集吸收，并計數(shù)。樣品加入1mL的混酸(V_HNO3：V_HClO4＝3:1)，加熱至180℃硝化1h。硝化后的溶液用Milli-Q純水(美國Millipore公司)定容至5mL后，用ICP-MS檢測硒的含量。結(jié)果表明，腫瘤細胞HeLa對生物素化的Ru-BSe有更高的吸收，而對PhenSe和Ru-Se的吸收較低。正常細胞L02對三種含硒化合物(PhenSe、Ru-Se或Ru-Bse)的吸收無明顯的差別。為了證明生物素受體介導(dǎo)的主動吸收，我們對細胞加入終濃度為100μM生物素提前孵育細胞1h，更新DMEM培養(yǎng)基后，再分別加入藥物(PhenSe、Ru-Se或Ru-Bse，方法同上)。但HeLa細胞經(jīng)過量的生物素封閉后，Ru-BSe的吸收量明顯下降。且這相同的實驗條件下，生物素對受體的封閉對PhenSe和Ru-Se的吸收無顯著變化。這表明Ru-BSe能通過生物素受體介導(dǎo)的途徑進入細胞。

通過構(gòu)建HeLa-L02細胞共培養(yǎng)模型，我們進一步測定釕配合物對腫瘤細胞的靶向能力：將8×10⁴的L02細胞加入2cm的細胞培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁生長后，加入Cell tracker Blue染料(購于Thermo Fisher Scientific公司；工作濃度為1μg/mL)染色2h后，使L02細胞標記為藍色熒光，用PBS溶液洗滌兩遍。加入等量無熒光標記的HeLa細胞，培養(yǎng)24h。共培養(yǎng)細胞經(jīng)終濃度為20μM Ru-BSe孵育24h后，使用TUNEL試劑盒(羅氏(Roche)公司)檢測細胞的凋亡情況。細胞處理后，利用流式細胞分析儀檢測不同細胞的凋亡情況。在共培養(yǎng)模型中，Ru-BSe能選擇性誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡。流式細胞分析結(jié)果(圖9)表明， 對照組中沒有發(fā)現(xiàn)細胞凋亡信號，而Ru-BSe處理后，藍色熒光標記的HeLa細胞發(fā)生了凋亡，由控制組的0.2％上升至20.7％。但無熒光標記的正常L02細胞則無明顯變化。因此，靶向性的Ru-BSe能選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。

實施例3釕配合物的抗腫瘤機制

1、細胞的存活率采用MTT法測定：

HeLa細胞、A549細胞、MCF-7細胞、MB231細胞和HepG2細胞，以上腫瘤細胞均購于美國菌種保藏中心；L02細胞購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；上述細胞在DMEM培養(yǎng)基(含10％(v/v)的牛血清蛋白，100units/mL盤尼西林和50units/mL鏈霉素)中培養(yǎng)；

NCM460細胞，購于美國INCELL公司，并用INCELL’s enriched M3:10培養(yǎng)基培養(yǎng)；

所有細胞放置于37℃細胞培養(yǎng)箱(相對濕度為95％、含5％(v/v)CO₂)。

取對數(shù)生長的上述各種細胞，以2×10⁴cells/mL的濃度接種在96孔板，細胞在DMEM培養(yǎng)基中，放置于37℃細胞培養(yǎng)箱。孵育24h待細胞貼壁生長后，加入以濃度梯度為5～80μM的待測藥物(Ru-IP、Ru-Se、Ru-Bio、Ru-Bse、Ir-Bty、PhenSe或順鉑)，孵育72h后加入20μL的5mg/mL的MTT溶液繼續(xù)孵育4h。結(jié)束后，抽走培養(yǎng)基，加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，與570nm出測定吸光度，計算半數(shù)抑制濃度IC₅₀。結(jié)果如表2所示，所合成的系列釕配合物對腫瘤細胞具有一定抗腫瘤活性，但差異較大。由Ru-IP和Ru-Se比較得知，硒元素的引入能有效地增加藥物的活性，如對A549細胞的IC₅₀值由104.3μM下降至19.4μM，但對正常細胞L02和NCM460的毒性較大。由Ru-Se和Ru-BSe對比可知，而引入靶向基團生物素后，對藥物的活性無明顯影響，卻大大提高了藥物的選擇性。靶向性配合物Ru-BSe和Ir-Bty的安全系數(shù)分別為4.24和5.47，遠大于Ru-Se的0.97和臨床的抗腫瘤藥物順鉑的0.46。此外，靶向性Ru-BSe對生物素受體高表達的HeLa和A549細胞的活性高于其他腫瘤細胞和正常細胞，這證明了靶向基團的引入有效地提高釕配合物的吸收效率，進而提高其抗腫瘤活性。

2、(1)線粒體是為生命活動提供能量的主要器官，也與細胞的凋亡存在密切的聯(lián)系。因此，我們用JC-1熒光探針(購于西格瑪奧德里奇公司)檢測了腫瘤HeLa細胞的線粒體膜電位耗散情況。HeLa細胞經(jīng)不同藥物(Ru-Bio或Ru-Bse，終濃度分別為10μM和20μM)孵育24h后，用2mL磷酸緩沖鹽PBS溶液(濃度為0.01M；pH＝7.4)洗滌兩次后，用胰酶懸浮，后用JC-1染料染色30min后用流式細胞儀進行測試。結(jié)果如圖10所示，所合成的釕配合物能不同程度地誘導(dǎo)線粒體膜電位耗散。其中含硒釕配合物Ru-BSe能劑量依賴性地造成線粒體功能紊亂，綠色的JC-1染料的比例由控制組的2.9％上升至40.9％。

(2)此外，用Western blot檢測HeLa細胞內(nèi)線粒體凋亡的信號通路。向貼壁細胞加入不同藥物(終濃度為40μM的Ru-Bio或Ru-Bse，以不添加藥物為對照)處理72h后，吸去培養(yǎng)基并用PBS溶液洗滌三次，在低溫孵育下加入150μL的細胞裂解液(購于捷貝斯生物科技有限公司)，作用5min后，收集蛋白。取等量的蛋白加入電泳槽，使用4％的濃縮膠和12％的分離膠進行電泳。電泳結(jié)束后，將分離好的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移硝酸纖維膜上，然后使用5％(w/v)全脂牛奶(購于捷貝斯生物科技有限公司)的TBST緩沖溶液(每升含8g NaCl，0.2g KCl、3g Tris-base和1mL吐溫-20，pH＝7.4，)進行封閉。在4℃下用1：1000的一抗(購于美國cell signaling technology公司)孵育過夜，然后再用1：2000的二抗(購于美國cell signaling technology公司)孵育2h，高強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(Kodak)在X光片上蛋白的泳道顯影。結(jié)果如圖11所示，含硒釕配合物能有效的下調(diào)促生存蛋白Bcl-2和上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達水平。

(3)基于配合物誘導(dǎo)線粒體功能紊亂的結(jié)果，我們進一步檢測HeLa細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。細胞經(jīng)不同配合物(Ru-IP、Ru-Se、Ru-Bio和Ru-Bse，終濃度都為40μM，以不添加藥物為對照)作用不同時間后，裝在DCFH-DA探針(購于西格瑪奧德里奇公司)，用PBS溶液洗滌后，利用熒光酶標儀檢測激活后的DCF探針(激活后DCFH-DA變?yōu)镈CF)的熒光強度。結(jié)果如圖12所示，含硒釕配合物能顯著的提升了細胞內(nèi)ROS的水平，Ru-BSe處理組4h內(nèi)ROS的水平達到130％以上。而非硒釕配合物Ru-IP和Ru-Bio僅輕微上調(diào)ROS水平。由于靶向性的Ru-BSe能通過生物素受體有效地被HeLa細胞吸收，故能在細胞內(nèi)產(chǎn)生最多的ROS。此外，經(jīng)含硒配合物處理后，過量的ROS能引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路蛋白p-PERK和CHOP表達水平顯著地上升。由此可得，含硒釕配合物能誘導(dǎo)腫瘤細胞線粒體功能紊亂，促使細胞內(nèi)ROS上升，激活了ROS介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路。

(4)我們檢測了細胞內(nèi)凋亡相關(guān)的Caspase家族蛋白的活性。取上述步驟(2)收集的細胞蛋白100μg加入Caspase蛋白底物熒光探針(Caspase-3：Ac-DEVD-AMC和Caspase-9：Ac-LEHD-AMC)(北京泰澤瑞達科技有限公司)在37℃孵育2h，在多功能熒光酶標儀測定探針的熒光強度(Ex＝380nm，Em＝440nm)。結(jié)果如圖13(a)所示，含硒配合物Ru-BSe能有效地激活Caspase-3和Caspase-9蛋白的活性，而多吡啶釕配合物Ru-Bio經(jīng)輕微激活蛋白的活性。

(5)最后，利用碘化丙啶(PI)染料(Sigma)檢測細胞的周期分布。經(jīng)過終濃度為20、40μM的釕配合物Ru-Bio和Ru-BSe處理72h的HeLa細胞，加入胰酶消化細胞。待收集懸浮與貼壁細胞后，加入70％(v/v)的冷凍乙醇在-20℃固定過夜。用PI染料在常溫避光孵育1h。染料溶液經(jīng)400目的篩網(wǎng)過濾后，用Beckman流式細胞分析儀測試。每個樣品中的計數(shù)細胞數(shù)為10000，再用Multi Cycle軟件分析腫瘤細胞的各周期分布比例。結(jié)果 顯示，配合物能劑量依賴性上調(diào)凋亡細胞比例，其中經(jīng)20、40μM的含硒釕配合物處理后，凋亡細胞的比例從控制組的1.1％分別上升至22.0％和62.9％。

綜上所述，含硒釕配合物能激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡通路，誘導(dǎo)細胞凋亡。

表2系列釕(II)配合物與順鉑的體外抗腫瘤活性

注：表中SI表示藥物的安全系數(shù)，反映了藥物的低毒性，由公式SI＝IC₅₀(L02)/IC₅₀(HeLa)得到。

實施例4靶向性釕配合物對人宮頸癌細胞HeLa裸鼠異種移植瘤模型的診斷治療效果

本發(fā)明應(yīng)用HeLa裸鼠荷瘤模型去研究系列釕配合物的體內(nèi)診斷治療效應(yīng)。HeLa荷瘤裸鼠模型：在6-8周齡BALB/c裸小鼠(購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心)后肢腋皮下接種1×10⁶個HeLa細胞，將接種后的裸小鼠隨機分成陰性對照組、Ru-Se實驗組和Ru-BSe實驗組(每組6只，雌雄鼠平均)，待瘤塊大小長到約200mm³時開始用藥。首先，我們使用熒光活體成像儀器檢測72小時內(nèi)釕配合物在裸小鼠體內(nèi)的分布(圖14)。荷瘤裸鼠分別經(jīng)過尾靜脈注射Ru-Se和Ru-BSe(4μmol/kg)不同時間段后，經(jīng)乙醚麻醉固定后，在熒光活體成像儀內(nèi)觀察藥物在體內(nèi)的分布。如圖15所示，尾靜脈注射24h，Ru-BSe能在腫瘤區(qū)域附近聚集，而Ru-Se則沒有發(fā)現(xiàn)在腫瘤區(qū)域附近聚集。經(jīng)過48和72小時的觀測后，我們發(fā)現(xiàn)Ru-BSe依然能在腫瘤區(qū)域集聚，但是Ru-Se測遍布裸鼠全身。注射后72h，我們將小鼠處死，將主要器官：腦、心、肝、脾、肺、腎和腫瘤取出，用活體熒光成像儀觀測配合物在各組織內(nèi)積聚情況。值得注意的是，靶向性的Ru-BSe能夠別腫瘤所吸收，而其它 組織的積累則很少。相反，Ru-Se則沒能被腫瘤組織選擇性吸收，而且在活體熒光成像儀中可以觀測到在肝和脾組織有很強的熒光信號。

向已成瘤的HeLa裸鼠模型(n＝6)按照4μmol/Kg的劑量隔天注射釕配合物(Ru-Se或Ru-BSe)，陰性對照組注射生理鹽水，共15次。隔天測量裸鼠的體重，和腫瘤的長(l)和寬(w)。腫瘤的體積通過公式V＝l×w²/2計算。如圖16所示，含硒釕配合物Ru-Se和Ru-BSe均能有效抑制腫瘤的生長，抑制率分別為55.7％和35.8％(抑制率的計算公式：抑制率＝V _實驗組/V_對照組)，可見靶向性的含硒釕配合物在體內(nèi)具有更強的抗腫瘤活性。在Ru-Se注射組的裸鼠模型中，我們發(fā)現(xiàn)裸鼠的體重有輕微的下降，而Ru-BSe組的裸鼠的體重變化不大。如圖17所示，利用ICP-AES檢測Ru元素在體內(nèi)的分布。通過對裸鼠的器官和腫瘤組織硝化，發(fā)現(xiàn)Ru-BSe內(nèi)特異性地被腫瘤組織所吸收，而在正常組織內(nèi)的分布很少。與之相反的是，Ru-Se則被肝和脾大量地吸收。特別的是，Ru-BSe在腫瘤組織的含量比Ru-Se高出3倍，證明其在體內(nèi)也具有腫瘤靶向性。

為了綜合評價含硒釕配合物對機體所產(chǎn)生的毒性，比較了藥物注射30天后裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤的組織切片變化和血液生化指標(血液生化分析儀)。將組織切片脫蠟至水后，在顯微鏡下觀察組織狀態(tài)，拍照。如圖18所示，我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)Ru-Se處理后的，肝組織出血、肺泡腔出血和腎小球萎縮的變化，而Ru-BSe處理組的臟器則未出現(xiàn)損傷或炎癥反應(yīng)。

30天治療結(jié)束后，對裸鼠摘除眼球取血。完成取血后，血液立即使用3000g/min離心10min，收集血清，并置于碎冰中。血液生化指標結(jié)果分析表明，經(jīng)含硒釕(II)配合物治療后，有效降低腫瘤對小鼠血液生化指標的影響。其中，相對于Ru-Se，靶向基團的引入使Ru-BSe能選擇性地聚集在腫瘤組織，有效降低了含硒配合物的腎毒性(圖19)，如下調(diào)了尿酸(UA)、尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)。同時，靶向釕配合物也降低了肝毒性，如減輕了血清總蛋白(TP)和血清白蛋白(ALB)的下降，但對谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)無顯著的改變。另外，含硒釕配合物具有有效避免血清甘油三酯(TG)的上升，且無明顯心臟毒性，如肌酸激酶(CK)指標無顯著差異。

綜上所述，生物素靶向基團能提高含硒釕配合物被腫瘤組織的吸收能力，從而提高其抗腫瘤活性和降低藥物的腎毒性和肝毒性；含硒配合物通過靶向分子修飾后，能在荷瘤裸鼠模型中有效地被腫瘤組織吸收，從而降低了對正常組織的毒副性，實現(xiàn)對金屬配合物有效的改性。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。