本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物生產(chǎn)苯甲醛的方法。

背景技術(shù)：

苯甲醛是最簡單的芳香醛，俗稱苦杏仁油，又稱為安息香醛，分子式：c7h6o，無色至淺黃色揮發(fā)性液體。有苦杏仁味，燃燒時有芳香味。苯甲醛廣泛存在于植物界，特別是在薔薇科植物中，主要以苷的形式存在于植物的莖皮、葉或種子中，例如苦杏仁中的苦杏仁苷。苯甲醛是一種重要的有機(jī)化工原料。主要用作生產(chǎn)月桂醛、月桂酸、苯乙醛、苯甲酸芐酯的原料。也是染料、香料及藥品的重要中間體。

一、物理性質(zhì)

苯甲醛，分子式為c7h6o，微溶于水，可混溶于乙醇、乙醚、苯、氯仿。純品為無色液體，工業(yè)品為無色至淡黃色液體，有苦杏仁氣味，熔點(diǎn)：28℃，沸點(diǎn)：178.1℃。飽和蒸氣壓(kpa)：0.13(26℃)

二、用途

1、重要的化工原料，用于制月桂醛、月桂酸、苯乙醛和苯甲酸芐酯等，也用作香料

2、可作為特殊的頭香香料，微量用于花香配方，如紫丁香、白蘭、茉莉、紫羅蘭、金合歡、葵花、甜豆花、梅花、橙花等中。香皂中亦可用之。還可作為食用香料用于杏仁、漿果、奶油、櫻桃、椰子、杏子、桃子、大胡桃、大李子、香莢蘭豆、辛香等香精中。酒用香精如朗姆、白蘭地等型中也用之

3、醫(yī)藥、染料、香料的中間體。用于生產(chǎn)間氧基苯甲醛、月桂酸、月桂醛、品綠、苯甲酸芐酯、芐叉苯胺、芐叉丙酮等。用以調(diào)合皂用香精、食用香精等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要目的在于提供一種具有苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株proteusvulgarishauseromk-9，該菌株在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為cctccno:m2016671。保存地點(diǎn)為湖北省武漢市，武漢大學(xué)：保存時間2016年11月23日。

本發(fā)明的另一目的在于提供所述的菌株在生產(chǎn)苯甲醛的用途。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種苯甲醛的生產(chǎn)方法，其采用前述的菌株。

本發(fā)明提供了一種具有苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株，且利用該菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)苯甲醛，發(fā)酵法生產(chǎn)苯甲醛是用天然原料糖質(zhì)、氨基酸等，經(jīng)過微生物代謝生成目標(biāo)產(chǎn)物的一種方法，該工藝屬于低溫低壓，比較安全，操作簡單，污染少，是一個安全環(huán)保的生產(chǎn)方法。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中l(wèi)-苯丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖2為實(shí)施例1中苯乙酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖3為實(shí)施例1中苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖4為實(shí)施例1中苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)品的液相檢測圖譜；

圖5為實(shí)施例1中苯甲醛發(fā)酵液的液相檢測圖譜。

具體實(shí)施方式

菌種

從垃圾處理站土壤中分離出一株具有苯甲醛生產(chǎn)能力的菌株proteusvulgarishauseromk-9，該菌已于2016年11月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為cctccno:m2016671。

該菌株：可利用葡萄糖、蔗糖。該菌株的18srrna和26srrna序列與變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的18srrna和26srrna序列有99％的相似性，該菌鑒定為變形桿菌屬。為革蘭氏染色陰性、無芽胞、運(yùn)動活潑、兩端鈍圓的小桿菌。

該菌株的活化、種子培養(yǎng)和發(fā)酵可采用如下方法：

1)菌種活化

在無菌條件下從甘油管中劃一滿環(huán)菌液均勻涂布固體斜面培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中于25-30℃培養(yǎng)24-48h。

2)種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph5-8，在培養(yǎng)溫度28-35℃，轉(zhuǎn)速150-500rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期；

種子培養(yǎng)基配方如下，按質(zhì)量比：糖質(zhì)原料1.0-3.5％；無機(jī)鹽0.1-1.0％；酵母浸粉0.1-1.0％；

3)發(fā)酵：將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以5-20％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基；

發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph3.0-10.0，在溫度30-40℃，攪拌轉(zhuǎn)速200-500rpm，通氣條件下發(fā)酵7-20h；然后減小通風(fēng)，繼續(xù)發(fā)酵50-100h；

發(fā)酵培養(yǎng)基，按質(zhì)量比：糖質(zhì)原料2.0-5.0％；無機(jī)鹽；酵母浸粉1.0-2.5；苯丙氨酸1.0-3.0。

所述的固體斜面培養(yǎng)基優(yōu)選為肉湯培養(yǎng)基。

所述的糖質(zhì)原料，包括葡萄糖，蔗糖，淀粉中的至少一種。

所述的無機(jī)鹽包括鉀鹽或鈉鹽。所述的步驟3)發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph優(yōu)選為5.0-9.0。

實(shí)施例1

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph6，在培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速150rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下,按質(zhì)量比(％)：葡萄糖1.0；nacl0.5；酵母浸粉0.1。

發(fā)酵

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以10％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph5.0，在溫度40℃，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量1:0.2的條件下發(fā)酵15h；然后減小通風(fēng)至1:0.02，繼續(xù)發(fā)酵55h。發(fā)酵配方如下(％)：葡萄糖5.0；nacl0.5；酵母浸粉1.0；苯丙氨酸2.0。

發(fā)酵液檢測方法：高效液相色譜法(hplc法)

柱型：cosmosil；5c18-ar-ⅱ；4.6id*250mm

柱溫：30℃

流動相：甲醇與水(0.1％磷酸)比例為55：45

流速：0.8ml/min，uv:216nm。

檢測結(jié)果見圖1至圖5，圖1至圖5的結(jié)果表明發(fā)酵液中含有苯甲醛，同時還含有苯甲酸，苯乙酸等副產(chǎn)物。

實(shí)施例2

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph5，在培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速500rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下(％)：蔗糖3.5；kcl0.5；酵母浸粉1.0。

發(fā)酵

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以10％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph9.0，在溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量1:0.2的條件下發(fā)酵7h；然后減小通風(fēng)至1:0.02，繼續(xù)發(fā)酵73h。

發(fā)酵配方如下(％)：蔗糖4.0；kcl0.5；酵母浸粉2.5；苯丙氨酸1.5。

實(shí)施例3

種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長勢良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始ph7，在培養(yǎng)溫度28℃，轉(zhuǎn)速500rpm的條件下培養(yǎng)菌體到對數(shù)生長期。

種子培養(yǎng)基配方如下(％)：淀粉3.5；nacl0.5；酵母浸粉1.0。

發(fā)酵

將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的種子液在無菌條件下以15％的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph7.0，在溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣量1:0.2的條件下發(fā)酵10h；然后減小通風(fēng)至1:0.02，繼續(xù)發(fā)酵65h。發(fā)酵配方如下(％)：淀粉3.5；nacl0.5；酵母浸粉1.0；苯丙氨酸3.0。

實(shí)施例4

天然苯甲醛的生產(chǎn)(三角瓶震蕩發(fā)酵)

配制種子培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成如下(g/l)：葡萄糖30，磷酸二氫鉀5，氯化鈉2.5，酵母浸粉10.0，溶劑為水，初始ph7.0。121℃滅菌30min。

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成如下(g/l)：葡萄糖30，磷酸二氫鉀5，酵母浸粉8，苯丙氨酸10.0，溶劑為水，初始ph7。121℃滅菌30min。

種子的制備：無菌轉(zhuǎn)移低溫甘油管omk-9菌株于新鮮、無菌固體平板上，28℃活化2天，挑取菌落接種于500ml三角瓶做種子培養(yǎng)，瓶中種子培養(yǎng)基的體積為50ml，搖床轉(zhuǎn)速180rpm，30℃培養(yǎng)24h，得到種子液。

天然苯甲醛的發(fā)酵：取配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基50ml倒入500ml的無菌三角瓶中，然后接入培養(yǎng)好的種子液7.5ml進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm。搖瓶發(fā)酵20h，把搖床轉(zhuǎn)速降至80rpm，然后繼續(xù)發(fā)酵80h后用hplc法測定發(fā)酵液中天然苯甲醛的濃度為2.5g/l。

實(shí)施例5：天然苯甲醛的生產(chǎn)(生物反應(yīng)器發(fā)酵)

種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基配制同實(shí)施例4。

種子的制備：無菌轉(zhuǎn)移低溫甘油管omk-9菌株于新鮮、無菌固體平板上，28℃活化2天，挑取菌落接種于裝有1.8l種子培養(yǎng)基的3l種子罐進(jìn)行種子培養(yǎng)，通風(fēng)攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，30℃培養(yǎng)24h，得到種子液。

天然苯甲醛的發(fā)酵：將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基10.2l裝入20l發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min，然后將培養(yǎng)好的1.8l種子液接入20l發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速400rpm，通氣比1：0.2。發(fā)酵10h降低通風(fēng)至1:0.02，繼續(xù)發(fā)酵70h。發(fā)酵結(jié)束用hplc法測定發(fā)酵液中天然苯甲醛的濃度為5g/l。