本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及一種微生物培養(yǎng)方法，特別涉及一種原位環(huán)境微生物分離方法和一種土壤本源石油降解微生物分離與篩選方法。

背景技術：

微生物大量存在于自然環(huán)境中，微生物的分離與培養(yǎng)是研究和利用微生物的重要基礎。然而，傳統(tǒng)的微生物分離和培養(yǎng)方法存在許多缺陷：一是不能滿足微生物在自然環(huán)境生長條件；二是自然環(huán)境中，微生物不是孤立存在的，而是和其他微生物共同生存，通過直接接觸或物質(zhì)交流形成相互關系，而傳統(tǒng)的純培養(yǎng)不能提供物質(zhì)交流的環(huán)境；三是不同種微生物的生長速度不同，傳統(tǒng)稀釋涂平板方法中生長快的微生物快速繁衍，導致生長慢的微生物難以被分離；四是某些微生物生長量很小，在環(huán)境不適宜的情況下，不能形成菌落；五是傳統(tǒng)的平板涂布微生物培養(yǎng)方法費時費力，且難以實現(xiàn)微生物的高通量篩選和分離。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種操作步驟簡便、分離與培養(yǎng)效果好、可靠性高的原位環(huán)境微生物分離方法，以及一種土壤本源石油降解微生物分離與篩選方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術方案：

一種原位環(huán)境微生物分離方法，包括以下步驟：

s1：制備原位環(huán)境微生物采出液或浸出液；

s2：將采出液或浸出液混入lb固體培養(yǎng)基進行稀釋，使最終濃度菌濃為平均每個微孔培養(yǎng)室中只有一個微生物；

s3：將混菌的培養(yǎng)基灌裝于微孔培養(yǎng)室中，待冷卻凝固成為瓊脂后密封；

s4：將微孔培養(yǎng)室置于原位環(huán)境中進行微生物培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中微孔培養(yǎng)室中的微生物與外界產(chǎn)生物質(zhì)交換；

s5：培養(yǎng)結(jié)束后，取出瓊脂并置于lb平板上常溫培養(yǎng)；

s6：重復步驟s5進行多次純化，直至獲得純菌株。

一種土壤本源石油降解微生物分離與篩選方法，包括以下步驟：

t1：制備目標土壤樣品的微生物浸出液；

t2：將采出液或浸出液混入lb固體培養(yǎng)基進行稀釋，使最終濃度菌濃為平均每個微孔培養(yǎng)室中只有一個微生物；

t3：將混菌的培養(yǎng)基灌裝于微孔培養(yǎng)室中，待冷卻凝固成為瓊脂后密封；

t4：選取石油污染環(huán)境；或?qū)⑼寥琅c石油攪拌均勻，模擬石油污染環(huán)境；

t5：將微孔培養(yǎng)室置于石油污染環(huán)境或模擬石油污染環(huán)境中進行微生物培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中微孔培養(yǎng)室中的微生物與外界產(chǎn)生物質(zhì)交換；

t6：培養(yǎng)結(jié)束后，取出瓊脂并置于lb平板上常溫培養(yǎng)；

t7：重復步驟t5進行多次純化，直至獲得純菌株；

t7：逐一挑取待篩選菌株的單菌落，接種于液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得種子液；

t8：收集并清洗菌體；

t9：將菌體分別接種于以原油、瀝青和石蠟為唯一碳源的mf培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；

t10：判斷菌株是否能在原油中生長，能夠生長的菌株即為具備石油降解功能微生物。

進一步，所述微孔培養(yǎng)室由原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置提供；所述原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置包括上蓋板、下蓋板和夾板；所述上蓋板、下蓋板和夾板的中部設有位置一致的多個縱向通孔；所述上蓋板與夾板之間、下蓋板與夾板之間分別設有微孔濾膜，所述微孔濾膜與通孔配合形成多個獨立的微孔培養(yǎng)室。

本發(fā)明提供的一種原位環(huán)境微生物分離方法和土壤本源石油降解微生物分離與篩選方法，通過采用微孔培養(yǎng)室對細菌進行培養(yǎng)，不僅實現(xiàn)了對不同種類微生物細胞的隔離與束縛，同時還實現(xiàn)了原位環(huán)境的水分、可溶物質(zhì)或微生物代謝分解產(chǎn)生的物質(zhì)的自由交換。以石油降解功能微生物分離篩選為目標，采用本方法對目標微生物進行培養(yǎng)富集和高通量篩選，相對于傳統(tǒng)方法可以發(fā)現(xiàn)和采集更多的菌株種類。

附圖說明

圖1為本發(fā)明采用的一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置的爆炸圖；

圖2為本發(fā)明采用的一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為本發(fā)明采用的一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置的拼裝使用示意圖。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖1至3給出的實施例，進一步說明本發(fā)明一種原位環(huán)境微生物分離方法和土壤本源石油降解微生物分離與篩選方法的具體實施方式。本發(fā)明不限于以下實施例的描述。

實施例1：

本實施例主要介紹一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置的結(jié)構(gòu)組成和工作原理。如圖1至3所示，本發(fā)明提供了一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置，包括上蓋板1、下蓋板3和夾板2。優(yōu)選的，所述上蓋板1、下蓋板3、夾板2和微孔濾膜4的水平面投影形狀均為大小一致的正方形，所述上蓋板1和下蓋板3的一面為平面，另一面邊緣的厚度大于中部設置通孔位置處的厚度，這樣可以有效提升邊緣的強度，從而提高裝置的整體強度和可靠性。

所述上蓋板1、下蓋板3和夾板2的中部設有位置一致的多個縱向通孔5；所述上蓋板1與夾板2之間、下蓋板3與夾板2之間分別設有孔徑為0.22微米的微孔濾膜4，所述微孔濾膜4與通孔5配合形成多個獨立的微孔培養(yǎng)室。通過圖1可以看出，所述微孔培養(yǎng)室為圓柱形，圓柱形的圓周方向為夾板2的通孔5的側(cè)壁，為密封結(jié)構(gòu)；圓柱形的上、下兩端由微孔濾膜4覆蓋，為半密封結(jié)構(gòu)。當把裝置置于原位環(huán)境時，不同種類微生物細胞被束縛在不同的微孔培養(yǎng)室中生長，水分、原位環(huán)境可溶物質(zhì)或微生物代謝分解產(chǎn)生的物質(zhì)可以自由通過微孔濾膜4，但是微生物卻無法穿過，從而實現(xiàn)微生物隔離培養(yǎng)的目的。

優(yōu)選的，培養(yǎng)完成后，打開裝置時，為了防止微孔濾膜4與上蓋板1、下蓋板3或夾板2之間產(chǎn)生粘連、破碎，進而導致外部物質(zhì)進入并污染微孔培養(yǎng)室，所述上蓋板1與夾板2之間、下蓋板3與夾板2之間的微孔濾膜4均為2層。

所述上蓋板1、下蓋板3、夾板2和微孔濾膜4的邊緣的相應位置，設有多個用于拼裝固定的螺孔6。所述上蓋板1和下蓋板3結(jié)構(gòu)相同或為鏡像對稱結(jié)構(gòu)。拼裝式，依次將蓋板1、兩層微孔濾膜4、夾板2、兩層微孔濾膜4、下蓋板3拼合在一起，將固定用的螺栓穿過螺孔6并固定，即可完成拼裝。

考慮到在實際應用中每次試驗的規(guī)模不同，需要的微孔培養(yǎng)室數(shù)量也有差別，為提高本裝置的通用性，本裝置還可由多個單元(見附圖2)拼合成為組合體(見附圖3)使用。作為具體的實施方式之一，所述上蓋板1和/或下蓋板3上設有與其它單元上蓋板1和/或下蓋板3連接的對插插槽、掛鉤、磁鐵吸扣或粘扣。使用人員可以根據(jù)實際需求，非常方便地將多個單元組合使用。

本實施例提供的一種原位環(huán)境微生物培養(yǎng)裝置，通過由上蓋板、下蓋板、夾板和微孔濾膜構(gòu)成的微孔培養(yǎng)室，不僅實現(xiàn)了對不同種類微生物細胞的隔離與束縛，同時還實現(xiàn)了原位環(huán)境的水分、可溶物質(zhì)或微生物代謝分解產(chǎn)生的物質(zhì)的自由交換，從而實現(xiàn)了原位環(huán)境微生物培養(yǎng)富集的功能。

實施例2：

本實施例主要介紹一種石油采出液微生物分離方法。針對從吉林油田采集的石油采出液，利用實施例1所述的培養(yǎng)裝置進行原位分離功能微生物。步驟如下：

1、取適量采出液制備含2％瓊脂的固體培養(yǎng)基；

2、取部分石油采出液用血球計數(shù)板計數(shù)記錄微生物濃度(實際測量濃度約為7.6*10⁷個/ml)；

3、梯度稀釋。取部分稀釋液，混入第1步配制的2％的采出液固體培養(yǎng)基中(冷卻至約45℃)，使最終濃度菌濃為10³個/ml(即1個/μl，使平均每個孔中只有一個細胞)；

4、將夾板放入上述混菌的培養(yǎng)基中，冷卻至其凝固；快速取出夾板，使含有菌的瓊脂小塊留在夾板通孔內(nèi)；

5、小心去除夾板上多余的瓊脂，組裝培養(yǎng)裝置并密封好；

6、將培養(yǎng)裝置置于石油采出液中室溫(或者變溫狀態(tài))原位培養(yǎng)；

7、培養(yǎng)裝置原位培養(yǎng)20天后，取出，拆開；

8、取出夾板中的瓊脂，將其置于含2％瓊脂的采出液固體培養(yǎng)基的12孔板中，常溫培養(yǎng)至形成菌落；

9、挑取菌落，接種于2％lb平板上，判斷前是否能在lb上生長；

10、將可以在lb平板上生長的菌株利用lb進行三次純化，獲得純菌株；

11、提取菌株基因組dna；

12、以通用引物pcr獲得16srdna片段(基因指紋)，測序鑒定菌株分類。

實施例3：

本實施例主要介紹一種利用實施例1所述的培養(yǎng)裝置進行土壤微生物分離方法。針對從北京大學未名湖附近采集的土壤樣品，利用培養(yǎng)裝置原位分離土壤樣品中的微生物。步驟如下：

1、取1g土壤置入10ml無菌水中，振蕩10min獲得土壤浸出液；

2、取部分土壤浸出液用血球計數(shù)板計數(shù)記錄微生物濃度(實際測量濃度約為4.8*10⁷個/ml)；

3、梯度稀釋。取部分稀釋液，混入2％的lb固體培養(yǎng)基中(冷卻至約45℃)，使最終濃度菌濃為10³個/ml(即1個/μl，使平均每個孔中只有一個細胞)；

4、將夾板放入上述混菌的培養(yǎng)基中，冷卻至其凝固；快速取出培養(yǎng)裝置，使含有菌的瓊脂小塊留在孔內(nèi)；

5、去除夾板上多余的瓊脂，組裝培養(yǎng)裝置并密封好；

6、將培養(yǎng)裝置置于土壤中原位培養(yǎng)，在土壤中加入足量的水，使土壤充分潤濕，以增加環(huán)境中物質(zhì)擴散能力，讓培養(yǎng)裝置內(nèi)的微生物能更充分與外界發(fā)生物質(zhì)交流；

7、培養(yǎng)裝置原位培養(yǎng)20天后，取出，拆開；

8、取出夾板中的瓊脂，置于1.5％lb平板上，常溫培養(yǎng)，待長出一定大小的克??；

9、挑取克隆，在lb平板上進行三次純化，獲得純菌株；

10、提取菌株基因組dna；

11、以通用引物pcr獲得16srdna片段(基因指紋)，測序鑒定菌株分類。

為了驗證培養(yǎng)裝置方法相對于常規(guī)微生物分離方法的優(yōu)勢，我們分別用本方法和傳統(tǒng)的涂平板分離方法，對同樣的土壤樣品進行分菌，各自分離了136和118株菌。結(jié)果顯示，相比于傳統(tǒng)的分離方法，在屬水平上，培養(yǎng)裝置方法能分離出更多樣的微生物，平板方法分離的菌來自于9個屬，而培養(yǎng)裝置方法分離的菌株來自21個屬。

實施例4：

本實施例主要介紹一種人工模擬石油污染土壤，利用實施例1所述的培養(yǎng)裝置進行分離土壤本源石油降解微生物的方法。針對從北京大學未名湖附近采集的土壤樣品，人工模擬石油污染過程，高通量地富集和篩選環(huán)境中本源的石油降解微生物。

1、參考實施例3步驟1至5，將土壤樣品中的微生物接種在培養(yǎng)裝置中；

2、人工模擬石油污染，每1kg土壤添加20g原油，并將土壤與原油攪拌均勻；

3、將培養(yǎng)裝置置于人工模擬的石油污染土中，原位培養(yǎng)3周；

4、拆開培養(yǎng)裝置，挑取芯片中瓊脂，置于含2％瓊脂和5％lb的土壤浸出液固體培養(yǎng)基的12孔板中，常溫培養(yǎng)至形成菌落；

5、純化三次，進行菌株鑒定。

從基因指紋相似性的結(jié)果來看，大部分菌株與已鑒定菌株的相似性的都在99％以上，沒有發(fā)現(xiàn)新的微生物物種，原因可能是所選取的原油樣品多樣性較低。

實施例5：

本實施例主要介紹一種利用實施例1所述的培養(yǎng)裝置進行原油降解功能微生物的篩選方法。為了驗證人工模擬石油污染土中，利用培養(yǎng)裝置分離方法是否能獲得更多的石油降解功能微生的，同時篩選出這些石油降解功能的微生物，采用原油，以及原油中較難被降解的瀝青、石蠟分別作為唯一碳源，配制mf無機鹽培養(yǎng)基，篩選能利用這些碳源生長的微生物，步驟如下：

1、挑取待篩選菌株的單菌落，接種于液體lb培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期，獲得種子液；

2、離心收集菌體，并用不含碳源mf培養(yǎng)基清洗菌體三次；

3、用不含碳源mf培養(yǎng)基調(diào)整菌株od600，分別接種于50ml以原油，或25ml以瀝青和石蠟為唯一碳源的mf培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)；

4、10天后，觀察并測定od600值，判斷菌株是否能在原油中生長；

5、將獲得的可利用原油及瀝青、石蠟的微生物菌株進行復篩、培養(yǎng)，每種菌株做3個平行，測定菌株的生長曲線和碳源利用效率。

進一步地，在污染發(fā)生前將土壤微生物接種于培養(yǎng)裝置中(以土壤浸出液為基質(zhì))，然后人工模擬土壤石油污染，將接種好培養(yǎng)裝置芯片置于污染土中原位培養(yǎng)。

由于環(huán)境中有豐富的石油碳源，因此可降解石油的土壤微生物具有生長優(yōu)勢，因此在培養(yǎng)中可以更快更多地生長，反之由于碳源缺乏，不能降解石油的微生物的生長受到抑制。通過這種方式，可以高通量地富集和篩選土壤中本源的石油降解微生物。作為對照，我們用培養(yǎng)裝置同時分離了同樣的未污染的土壤樣品中的微生物。結(jié)果顯示，相比于直接在原位土壤中分菌，石油污染后分離的微生物種屬發(fā)生了明顯變化，acinetobacter、pseudomonas、aeromonas屬的微生物菌株量明顯增多，一些原位土壤能分離出的屬沒有分出來(可能受到石油的抑制)，而一些新的屬可以被分離出來，這些微生物可能更適宜石油污染的土壤環(huán)境。這些被石油污染選擇出的土壤微生物可能具有更強的石油降解潛力，同時又能很好的適應土壤環(huán)境，因此可能是潛在的石油污染治理的功能菌株。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。