本發(fā)明涉及腫瘤的細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用，具體為采用嵌合抗原受體擴(kuò)增CART細(xì)胞的方法，一種新的增加CD4+CART細(xì)胞擴(kuò)增的方法。
背景技術(shù)：
：近5年來(lái)，嵌合抗原受體T細(xì)胞(Chimericantigenreceptor,CAR)等過(guò)繼性免疫療法迅速的從基礎(chǔ)科研階段轉(zhuǎn)化至臨床試驗(yàn)，并在臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出強(qiáng)大的腫瘤殺傷效果。CAR為能夠特異性靶向腫瘤抗原的重組受體，一般由單鏈抗體可變區(qū)基因片段(Singlechainfragmentvariable，scFv)、鉸鏈區(qū)(Hinge，H)、跨膜區(qū)、共刺激分子、CD3ζ鏈等元件組成。目前為止，已發(fā)展出第四代CAR分子，由于普遍認(rèn)為胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)域，尤其是共刺激分子是決定CART細(xì)胞殺傷和維持的重要元件，因此CAR分子的改造升級(jí)主要關(guān)注新的共刺激分子的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，而對(duì)于其他非信號(hào)傳導(dǎo)區(qū)域的研究還甚少，例如對(duì)于鉸鏈區(qū)的研究。為獲得合適的共刺激信號(hào)來(lái)激活CART細(xì)胞，提高CART細(xì)胞的應(yīng)答和體內(nèi)維持時(shí)間，許多不同的共刺激分子被單獨(dú)或者串聯(lián)應(yīng)用于CAR分子的改造升級(jí)過(guò)程，例如：CD28,41BB，OX40，ICOS，CD27等。鉸鏈區(qū)為位于scFv和T細(xì)胞膜之間的一段區(qū)域，鉸鏈區(qū)通常來(lái)源于IgG家族，例如IgG1和IgG4，還有些來(lái)源于IgD和CD8，其中IgG1來(lái)源的鉸鏈?zhǔn)褂米顬閺V泛。目前對(duì)于鉸鏈區(qū)的研究和發(fā)現(xiàn)主要集中于以下四點(diǎn)：1.增強(qiáng)scFv區(qū)域的靈活性，從而降低CAR分子與其特異性靶點(diǎn)之間的空間約束，進(jìn)而促進(jìn)CART細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的突觸形成。例如為了克服空間約束和增強(qiáng)scFv的靈活性，MUC1特異性CAR分子中就引入了一個(gè)來(lái)源于IgD的鉸鏈區(qū)。2.拉近scFv與其靶向表位之間的距離，從促進(jìn)突觸的形成。例如，CD22特異性CAR分子就需要一個(gè)鉸鏈區(qū)拉近與腫瘤細(xì)胞的距離才能夠發(fā)揮最優(yōu)的殺傷效果。3.通過(guò)檢測(cè)鉸鏈區(qū)的表達(dá)水平來(lái)反映CAR分子的表達(dá)水平，從而方便CAR分子表達(dá)水平的監(jiān)測(cè)。然而，關(guān)于鉸鏈區(qū)對(duì)于CART細(xì)胞擴(kuò)增影響的研究卻還沒有。盡管CART細(xì)胞在臨床試驗(yàn)中取得了驚人的療效，但仍然存在很多的阻礙。例如，CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率還有待提高，特別是CD4+的CART細(xì)胞。通常的體外培養(yǎng)體系中，CD8T細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因此培養(yǎng)結(jié)束時(shí)主要獲得的為CD8T細(xì)胞，CD4T細(xì)胞百分比極低。最近，研究發(fā)現(xiàn)CART細(xì)胞中CD4和CD8T細(xì)胞的比例對(duì)于CART細(xì)胞的抗腫瘤活性有很大的影響，CART細(xì)胞中CD4T細(xì)胞的比例與CART細(xì)胞的治療效果成正相關(guān)，因此為了獲得大量的CD4CART細(xì)胞，就需要在體外培養(yǎng)過(guò)程中，首先分選出CD4和CD8CART細(xì)胞，然后再通過(guò)不同的細(xì)胞因子組合分別擴(kuò)增CD4和CD8CART細(xì)胞，這無(wú)疑增加了巨大的勞動(dòng)力和成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用，通過(guò)向CAR分子結(jié)構(gòu)中引入IgG4-CH3鉸鏈區(qū)，在體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠特異性的提高CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率，主要促進(jìn)CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增，無(wú)需將CD4和CD8T細(xì)胞分開單獨(dú)培養(yǎng)，在混合體系中就能完成，增加了CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一方面，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體，所述嵌合抗原受體包括鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)為IgG4-CH3。發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嵌合抗原受體帶上了IgG4-CH3鉸鏈區(qū)會(huì)促進(jìn)CART細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)，尤其是CD4+的CART細(xì)胞增長(zhǎng)明顯，增長(zhǎng)數(shù)量的倍數(shù)相比于沒有帶上這個(gè)鉸鏈區(qū)的CART細(xì)胞倍數(shù)的1.5-2倍。根據(jù)本發(fā)明，所述鉸鏈區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1所述的核酸序列如下：Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體還包括信號(hào)肽、抗原識(shí)別區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽為GM-CSF信號(hào)肽，所述GM-CSF信號(hào)肽的核酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2所述的核酸序列如下：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.優(yōu)選地，所述抗原識(shí)別區(qū)為抗CD19抗體、抗Meso抗體或抗PSCA抗體中的任意一種或至少兩種的組合。優(yōu)選地，所述抗CD19抗體的核酸序列如SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3所述的核酸序列如下：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.優(yōu)選地，所述抗Meso抗體的核酸序列如SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.4所述的核酸序列如下：Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.優(yōu)選地，所述抗PSCA抗體的核酸序列如SEQIDNO.5所示。SEQIDNO.5所述的核酸序列如下：Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.優(yōu)選地，所述的跨膜區(qū)為人CD28跨膜區(qū)，所述人CD28跨膜區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.6所述的核酸序列如下：Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.優(yōu)選地，所述胞內(nèi)區(qū)為人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列如SEQIDNO.7所示。SEQIDNO.7所述的核酸序列如下：Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體由GM-CSF信號(hào)肽、抗CD19抗體、抗PSCA抗體或抗Meso抗體中的任意一種抗體、人CD28跨膜區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成的嵌合抗原受體。本發(fā)明中，所述鉸鏈區(qū)特異性地針對(duì)這三種嵌合抗原受體的CART細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)效果更好，CART細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)明顯，CD4+的CART細(xì)胞數(shù)量顯著增長(zhǎng)。第二方面，本發(fā)明提供一種重組慢病毒，將包含如第一方面所述的嵌合抗原受體的病毒載體與包裝輔助質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2共轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞得到的重組慢病毒。第三方面，本發(fā)明提供一種嵌合抗原受體T細(xì)胞，所述嵌合抗原受體T細(xì)胞通過(guò)將如第二方面所述的重組慢病毒轉(zhuǎn)染到T細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，所述T細(xì)胞為CD4+T細(xì)胞和其他T細(xì)胞的組合；優(yōu)選地，所述其他T細(xì)胞為CD3+T細(xì)胞和/或CD8+T細(xì)胞。第四方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的嵌合抗原受體、如第二方面所述的重組慢病毒用于擴(kuò)增CART細(xì)胞。優(yōu)選地，所述如第一方面所述的嵌合抗原受體、如第二方面所述的重組慢病毒用于擴(kuò)增CD4的CART細(xì)胞。本發(fā)明中，所述嵌合抗原受體可以明顯促進(jìn)CART細(xì)胞的擴(kuò)增，其作為一種新的CART細(xì)胞擴(kuò)增的方法，可以克服體外培養(yǎng)體系中，CD8T細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，培養(yǎng)結(jié)束后主要獲得的為CD8T細(xì)胞，CD4T細(xì)胞百分比極低的問(wèn)題，也避免了分選出CD4和CD8CART細(xì)胞的步驟，可以直接用于擴(kuò)增CART細(xì)胞，CART細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)明顯，尤其是CD4+的CART細(xì)胞增長(zhǎng)尤其顯著。所述嵌合抗原受體包括鉸鏈區(qū)，所述鉸鏈區(qū)為IgG4-CH3。根據(jù)本發(fā)明，所述鉸鏈區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1所述的核酸序列如下：Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.根據(jù)本發(fā)明，所述嵌合抗原受體還包括信號(hào)肽、抗原識(shí)別區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽為GM-CSF信號(hào)肽，所述GM-CSF信號(hào)肽的核酸序列如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2所述的核酸序列如下：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.優(yōu)選地，所述抗原識(shí)別區(qū)為抗CD19抗體、抗Meso抗體或抗PSCA抗體中的任意一種或至少兩種的組合。優(yōu)選地，所述抗CD19抗體的核酸序列如SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3所述的核酸序列如下：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.優(yōu)選地，所述抗Meso抗體的核酸序列如SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.4所述的核酸序列如下：Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.優(yōu)選地，所述抗PSCA抗體的核酸序列如SEQIDNO.5所示。SEQIDNO.5所述的核酸序列如下：Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.優(yōu)選地，所述的跨膜區(qū)為人CD28跨膜區(qū)，所述人CD28跨膜區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.6所述的核酸序列如下：Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.優(yōu)選地，所述胞內(nèi)區(qū)為人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，所述人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列如SEQIDNO.7所示。SEQIDNO.7所述的核酸序列如下：Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.優(yōu)選地，所述嵌合抗原受體由GM-CSF信號(hào)肽、抗CD19抗體、抗PSCA抗體或抗Meso抗體中的任意一種抗體、人CD28跨膜區(qū)和人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域串聯(lián)構(gòu)成的嵌合抗原受體。本發(fā)明中，所述鉸鏈區(qū)特異性地針對(duì)這三種嵌合抗原受體的CART細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)效果更好，CART細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量增長(zhǎng)明顯，CD4+的CART細(xì)胞數(shù)量顯著增長(zhǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：(1)本發(fā)明通過(guò)向CAR分子結(jié)構(gòu)中引入IgG4-CH3鉸鏈區(qū)，在體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠特異性的提高CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率，且主要促進(jìn)CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增，無(wú)需將CD4和CD8T細(xì)胞分開單獨(dú)培養(yǎng)，在混合體系中就能完成，增加了CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率；(2)發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嵌合抗原受體帶上了IgG4-CH3鉸鏈區(qū)會(huì)促進(jìn)CART細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng)，尤其是CD4+的CART細(xì)胞增長(zhǎng)明顯，增長(zhǎng)數(shù)量的倍數(shù)相比于沒有帶上這個(gè)鉸鏈區(qū)的CART細(xì)胞倍數(shù)的1.5-2倍。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明的嵌合抗原受體的合成基因序列圖譜；圖2為本發(fā)明流式檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的CD3和GFP雙陽(yáng)性的T細(xì)胞；圖3為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入能夠促進(jìn)CD19特異性CART細(xì)胞的體外擴(kuò)增，其中，圖3(A)為CART細(xì)胞比例，圖3(B)為CART細(xì)胞數(shù)量；圖4為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入主要促進(jìn)CD4+CD19特異性CART細(xì)胞的擴(kuò)增，其中，圖4(A)為19-.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例，圖4(B)為19-H.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例；圖5為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入能夠促進(jìn)Mesothelin特異性CART細(xì)胞的體外擴(kuò)增，其中，圖5(A)為CART細(xì)胞比例，圖5(B)為CART細(xì)胞數(shù)量；圖6為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入主要促進(jìn)CD4+Mesothelin特異性CART細(xì)胞的擴(kuò)增，其中，圖6(A)為Meso.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例，圖6(B)為Meso-H.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例；圖7為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入能夠促進(jìn)PSCA特異性CART細(xì)胞的體外擴(kuò)增，其中，圖7(A)為CART細(xì)胞比例，圖7(B)為CART細(xì)胞數(shù)量；圖8為本發(fā)明IgG-CH3鉸鏈的引入主要促進(jìn)CD4+PSCA特異性CART細(xì)胞的擴(kuò)增，其中，圖8(A)為PSCA.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例，圖8(B)為PSCA-H.28zT中的CD8+的CART和CD4+的CART細(xì)胞比例。具體實(shí)施方式為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明所采取的技術(shù)手段及其效果，以下結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明并非局限在實(shí)施例范圍內(nèi)。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過(guò)正規(guī)渠道商購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1：嵌合抗原受體的構(gòu)建(1)通過(guò)全基因合成含有IgG4-CH3鉸鏈區(qū)的19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z以及不含有鉸鏈區(qū)的19.28z、Meso.28z、PSCA.28zCAR分子序列，合成基因的C端含限制性內(nèi)切酶PmeⅠ的酶切位點(diǎn)，N端含限制性內(nèi)切酶SpeⅠ的酶切位點(diǎn)，CAR分子全長(zhǎng)基因圖譜如圖1所示；所述IgG4-CH3鉸鏈區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.1所示：Ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa.所述GM-CSF信號(hào)肽的核酸序列如SEQIDNO.2所示：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatccca.所述抗CD19抗體的核酸序列如SEQIDNO.3所示：Atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgc.所述抗Meso抗體的核酸序列如SEQIDNO.4所示：Tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaatagtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagttcagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcacagatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaaggcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtccccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctgactgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggt.所述抗PSCA抗體的核酸序列如SEQIDNO.5所示：Gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaagatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacaggggaccaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggtggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggctcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgggtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggtgacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaaaacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgtaaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc.所述人CD28跨膜區(qū)的核酸序列如SEQIDNO.6所示：Attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc.所述人CD3ζ胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的核酸序列如SEQIDNO.7所示：Agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc.(2)通過(guò)限制性內(nèi)切酶PmeⅠ和SpeⅠ雙酶切慢病毒表達(dá)載體pwpxld-eGFP以及合成的CAR分子片段：19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z、19.28z、Meso.28z、PSCA.28z；(3)通過(guò)瓊脂凝膠電泳回收含有粘性末端的目的基因：19-H.28z、Meso-H.28z、PSCA-H.28z、19.28z、Meso.28z、PSCA.28z和線性化的表達(dá)載體pwpxld-EGFP；(4)通過(guò)T4DNA連接酶(Invitrogent公司)，將CAR分子DNA片段連接至pwpxld-eGFP表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性質(zhì)粒，最終獲得CAR分子的慢病毒表達(dá)載體：pwpxld-19.28z-eGFP、pwpxld-19-H.28z-eGFP、pwpxld-Meso.28z-eGFP、pwpxld-Meso-H.28z-eGFP、pwpxld-PSCA.28z-eGFP、pwpxld-PSCA-H.28z-eGFP。實(shí)施例2：慢病毒包裝當(dāng)細(xì)胞鋪滿100mm培養(yǎng)皿板底80-90％時(shí)，進(jìn)行慢病毒包裝：(1)病毒包裝前2h，培養(yǎng)基更換為含有1％胎牛血清的DMEM，每個(gè)培養(yǎng)皿5mL/100mm；(2)每個(gè)100mm培養(yǎng)皿的293T細(xì)胞需加入的包裝質(zhì)粒如下：試劑劑量pWPXLd-CAR-eGFP質(zhì)粒4.5μgpMD2.G輔助質(zhì)粒1.5μgpsPAX26μg質(zhì)粒加入至500μLopti-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，混勻；其中，pWPXLd-CAR-eGFP質(zhì)粒包括：pwpxld-19.28z-eGFP、pwpxld-19-H.28z-eGFP、pwpxld-Meso.28z-eGFP、pwpxld-Meso-H.28z-eGFP、pwpxld-PSCA.28z-eGFP、pwpxld-PSCA-H.28z-eGFP；(3)36μgPEI加入至另一500μLopti-MEM培養(yǎng)基內(nèi)，混勻，室溫靜置5min；(4)將質(zhì)粒與PEI混合，吹打混勻，室溫靜置25-30min；(5)將1mL混合物均勻加入至1個(gè)100mmdish的293T細(xì)胞上；(6)包裝后6h更換培養(yǎng)基(含有1％胎牛血清的DMEM)，6mL/100mm培養(yǎng)皿；(7)病毒包裝后24h、48h、72h收取病毒上清，并補(bǔ)加6mL新鮮培養(yǎng)基；(8)1000g離心10min，0.45um濾器過(guò)濾，4℃保存待用。實(shí)施例3：CART細(xì)胞的構(gòu)建(1)人體T細(xì)胞的分離純化：采用Ficoll(GE公司)密度梯度離心法從全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)；PBMC再經(jīng)T細(xì)胞磁珠分選試劑盒(美天旎公司)分選出T細(xì)胞；T細(xì)胞采用T細(xì)胞活化試劑盒(美天旎公司)激活72h；(2)慢病毒轉(zhuǎn)染T細(xì)胞：T細(xì)胞激活后72h，去磁珠，用含10％胎牛血清，300IU/mLIL2，的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入實(shí)施例2制備的病毒上清，每106細(xì)胞加入1mL病毒上清，聚凝胺8μg/mL，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h后，用含300IU/mLIL-2的新鮮培養(yǎng)基重懸，每106個(gè)細(xì)胞加入1mL培養(yǎng)基。實(shí)施例4：CART(19-H.28zT和19.28zT)細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)CART細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞密度需維持在0.5-1×106個(gè)/ml培養(yǎng)基，每2天補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度。每2-3天進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)采用流式檢測(cè)CART細(xì)胞百分比，CAR分子后帶有GFP標(biāo)簽，因此流式檢測(cè)GFP百分比即可代表CART細(xì)胞百分比，同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8直到體外培養(yǎng)結(jié)束，一般15-20天。19-H.28zT和19.28zT細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果如圖2，圖3(A)-圖3(B)和圖4(A)-圖4(B)所示，可以看出，從圖2顯示19-H.28zT細(xì)胞百分比由3％上升至40.7％，19.28zT細(xì)胞百分比由8％培養(yǎng)后為7.4％，從圖3(A)-圖3(B)顯示，19.28zT細(xì)胞與GFPT細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量恒定，19-H.28zT細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為19.28zT細(xì)胞的2倍，從圖4(A)-圖4(B)顯示，19-H.28zT細(xì)胞增加的主要是CD4+CART細(xì)胞，而19.28zT細(xì)胞中的CD4+和CD8+CART細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定。實(shí)施例5：CART(Meso-H.28zT和Meso.28zT)細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)CART細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞密度需維持在0.5-1×106個(gè)/ml培養(yǎng)基，每2天補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度。每2-3天進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)采用流式檢測(cè)CART細(xì)胞百分比，CAR分子后帶有GFP標(biāo)簽，因此流式檢測(cè)GFP百分比即可代表CART細(xì)胞百分比，同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8直到體外培養(yǎng)結(jié)束，一般15-20天。Meso-H.28zT和Meso.28zT細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果如圖2，圖5(A)-圖5(B)和圖6(A)-圖6(B)所示，可以看出，從圖2顯示Meso-H.28zT細(xì)胞百分比由34％上升至74.3％，Meso.28zT細(xì)胞百分比由33.1％培養(yǎng)后為34.9％，從圖5(A)-圖5(B)顯示，Meso.28zT細(xì)胞與GFPT細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量恒定，Meso-H.28zTT細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為Meso.28zT細(xì)胞的1.5倍，從圖6(A)-圖6(B)顯示，Meso-H.28zT細(xì)胞增加的主要是CD4+CART細(xì)胞，而Meso.28zT細(xì)胞中的CD4+和CD8+CART細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定。實(shí)施例6：CART(PSCA-H.28zT和PSCA.28zT)細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)CART細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞密度需維持在0.5-1×106個(gè)/ml培養(yǎng)基，每2天補(bǔ)充一次新鮮培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度。每2-3天進(jìn)行一次細(xì)胞計(jì)數(shù)，同時(shí)采用流式檢測(cè)CART細(xì)胞百分比，CAR分子后帶有GFP標(biāo)簽，因此流式檢測(cè)GFP百分比即可代表CART細(xì)胞百分比，同時(shí)檢測(cè)CD3、CD4、CD8直到體外培養(yǎng)結(jié)束，一般15-20天。PSCA-H.28zT和PSCA.28zT細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果如圖2，圖7(A)-圖7(B)和圖8(A)-圖8(B)所示，可以看出，從圖2顯示PSCA-H.28zT細(xì)胞百分比由4.7％上升至31.1％，PSCA.28zT細(xì)胞百分比由3.4％培養(yǎng)后為3.8％，從圖7(A)-圖7(B)顯示，PSCA.28zT細(xì)胞與GFPT細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量恒定，PSCA-H.28zT細(xì)胞擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)約為19.28zT細(xì)胞的2倍，從圖8(A)-圖8(B)顯示，PSCA-H.28zT細(xì)胞增加的主要是CD4+CART細(xì)胞，而PSCA.28zT細(xì)胞中的CD4+和CD8+CART細(xì)胞在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中保持穩(wěn)定。綜上所述，本發(fā)明通過(guò)向CAR分子結(jié)構(gòu)中引入IgG4-CH3鉸鏈區(qū)，在體外培養(yǎng)過(guò)程中能夠特異性的提高CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率，且主要促進(jìn)CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增，無(wú)需將CD4和CD8T細(xì)胞分開單獨(dú)培養(yǎng)，在混合體系中就能完成，增加了CD4+CART細(xì)胞的擴(kuò)增效率，提供一種新的增加CD4+CART細(xì)胞擴(kuò)增的方法。申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的詳細(xì)方法，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)方法才能實(shí)施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>廣東昭泰體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司<120>一種嵌合抗原受體及其應(yīng)用<130>2017<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>351<212>DNA<213>人工合成序列<400>1ggcggaggtagctctggcggtggatccggcgggcagccccgagaaccacaggtgtacacc60ctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaa120ggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaac180tacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctc240accgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgag300gctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa351<210>2<211>66<212>DNA<213>人工合成序列<400>2atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg60atccca66<210>3<211>809<212>DNA<213>人工合成序列<400>3atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg60atcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacaga120gtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcag180aaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtc240ccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctg300gagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttc360ggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatct420ggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcg480ccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggt540gtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggt600agtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaac660tccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttac720tactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaagga780acctcagtcaccgtctcctcagcggccgc809<210>4<211>801<212>DNA<213>人工合成序列<400>4tagaattcctgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagacgtccataccgtaata60gtaagtcatcattcctcttgcacagtaatacacagccgtgtcctcgggagtcacagagtt120cagctgcagggagaactggttcttggatgtgtctgggttgatgctcattcgacttttcac180agatactgcatagtcgttataccacttggacctgtagtatgtccttcccagccactcaag240gcctctcgatggggactgcctgatccagttccaagtagcactgttgctagagacactgtc300cccggagatggcacaggtgagtgagagggtctgcgagggcgtcacgagtcctggacctga360ctgctgcagctgtacctggctggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccgga420ggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagca480tcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatac540tggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactca600gataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggcc660aatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgt720atgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctcc780ggaattctagaacaacagggt801<210>5<211>750<212>DNA<213>人工合成序列<400>5gacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcacc60atcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccagga120aaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctagg180ttcagtggctccgggtctgggacagacttcaccctcaccattagcagtctgcagccggaa240gatttcgccacctattactgtcagcagtggagtagtagcccattcacgttcggacagggg300accaaggtggagataaaaggcagtactagcggcggtggctccggaggcggctccggaggt360ggcggcagctcagaggttcagctggtggagtctgggggtggccttgtgcagccagggggc420tcactccgtttgtcctgcgcagcttctggcttcaacattaaagactactatatacactgg480gtgcgtcaggcccctggtaagggcctggaatgggttgcatggattgatcctgagaatggt540gacactgaatttgtcccgaagttccagggccgtgccactataagcgcagacacatccaaa600aacacagcctacctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggacactgccgtctattattgt660aaaacgggggggttctggggtcaaggaaccctggtcaccgtctcgagcgagcccaaatct720tgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgc750<210>6<211>321<212>DNA<213>人工合成序列<400>6attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatc60catgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttt120tgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcc180tttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaac240atgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgc300gacttcgcagcctatcgctcc321<210>7<211>336<212>DNA<213>人工合成序列<400>7agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctc60tataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggc120cgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaat180gaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgc240cggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacc300tacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc336當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3