本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白、多克隆抗體及Gα蛋白ELISA檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

G蛋白廣泛存在于細(xì)胞膜上，并且參與胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮中重要的生理作用，激素、神經(jīng)遞質(zhì)、氣味、趨化因子等胞外信號(hào)首先刺激細(xì)胞膜上的相應(yīng)的GPCRs，被激活的GPCRs再與G蛋白偶聯(lián)，激活相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)通路，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。最新研究發(fā)現(xiàn)G蛋白及其偶聯(lián)的雌激素受體介導(dǎo)了環(huán)境雌激素在生物體內(nèi)的非基因組效應(yīng)，這為利用G蛋白作為生物標(biāo)志物進(jìn)行環(huán)境雌激素效應(yīng)的檢測(cè)提供了可能性。雙齒圍沙蠶（P. aibuhitensis）隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門、多毛綱、沙蠶目，是一種棲息于潮間帶地區(qū)沉積質(zhì)中的底棲生物。與海洋魚類不同，沙蠶作為一種底棲生物，其食腐殖質(zhì)的食性和不易遠(yuǎn)距離遷徙的生活習(xí)性，使得該物種極易接觸到環(huán)境污染物，國(guó)內(nèi)部分學(xué)者已開始利用該生物作為生態(tài)監(jiān)測(cè)指示生物進(jìn)行相關(guān)研究。

酶聯(lián)免疫法亦稱ELISA法，是采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定，具有方法簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)。然而，由于目前關(guān)于G蛋白體外表達(dá)的報(bào)道多集中在無(wú)脊椎動(dòng)物昆蟲的G蛋白表達(dá)或是病毒G蛋白的表達(dá)，而對(duì)于雙齒圍沙蠶Gα蛋白的體外誘導(dǎo)表達(dá)及多克隆抗體的制備還未見報(bào)道，以至于無(wú)法采用ELISA法深入研究雙齒圍沙蠶在環(huán)境雌激素污染下的分子水平轉(zhuǎn)錄機(jī)制。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體及Gα蛋白ELISA檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白，其特征在于依次按照如下方法制備：

a. 提取雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；

b. 以雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的上游引物及下游引物的DNA序列分別如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

c. 對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物1061bp切膠回收，將回收目的片段與pMD18-T連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T-Gα，將克隆質(zhì)粒pMD18-T-Gα切膠回收后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克?。?/p>

d. 將單克隆轉(zhuǎn)到5ml Amp 100μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm 震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒pMD18-T-Gα；

e. 用限制性內(nèi)切酶BamH和Xho 分別消化重組質(zhì)粒pMD18-T-Gα和質(zhì)粒pET-28a，并切膠回收Gα目的片段與質(zhì)粒pET-28a，將回收的Gα目的片段與質(zhì)粒pET-28a按照摩爾比2.25：1的比例，以T4 DNA連接酶，16℃連接14h；切膠回收重組質(zhì)粒pET-28a-Gα后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克?。?/p>

f. 將單克隆轉(zhuǎn)到5ml Amp 100μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm 震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，抽提重組質(zhì)粒pET-28a-Gα；

g. 將重組質(zhì)粒pET-28a-Gα轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，挑取平板中單一圓滑菌落于5ml Kan 40μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，震蕩培養(yǎng)12~16h，從培養(yǎng)好的菌液中吸取4ml加入到200ml滅菌的Kan 40μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)至OD600nm在0.5~0.6；加入IPTG，使IPTG的終濃度為1.0mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃，200rpm繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4h，收集菌液；菌液于4℃，12000rpm離心5min，收集菌體；將所收集的菌體用PBS按照體積比5:1的比例清洗，4℃，12000rpm離心5min，共清洗2次，收集菌體；然后用含有1%Triton X-100的PBS對(duì)菌體進(jìn)行重懸，重懸后進(jìn)行超聲波破碎，破碎后4℃，12000rpm離心30min棄去上清，沉淀用15ml PBS重懸，4℃保存；

h. 按照每100ml培養(yǎng)基所得菌體加入15ml洗滌液重懸沉淀，洗滌5min，4℃，12000rpm離心20min，共洗滌2次；再按照每100ml培養(yǎng)基所得菌體加入10ml變性液重懸沉淀，于4℃冰箱中過(guò)夜反應(yīng)，直至變性液澄清，4℃，12000rpm離心20min，取上清于-20℃保存；

所述洗滌液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，2M尿素，PH7.9；

所述變性液：0.5 M NaCl，20mM Tris-HCl，8M尿素，PH7.9；

i. 選用Ni-NAT預(yù)裝柱采用咪唑梯度純化的方式對(duì)所得上清進(jìn)行純化，用1.5ml離心管收集洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白，所用試劑的配制體系如下：

結(jié)合緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

漂洗緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，80mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，100mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

洗脫緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，8M尿素，PH7.9；

j. 將純化的蛋白收集起來(lái)，利用透析袋，采用梯度復(fù)性的方法進(jìn)行蛋白復(fù)性：將裝有純化蛋白的透析袋放入2L復(fù)性緩沖液中，復(fù)性緩沖液按尿素濃度的不同，共設(shè)置5個(gè)濃度梯度，緩沖液的體系為： 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，尿素6M，4M，2M，1M，0M，PH7.9， 4℃磁力攪拌，透析8h；一個(gè)梯度透析之后再放入到下一梯度的透析緩沖液中透析，直到透析完成，收集蛋白4℃，12000g離心15min，收集上清棄去沉淀。

一種以上述雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白制備的雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，其特征在于按照如下方法制備：以40ug/kg的抗原劑量免疫新西蘭兔，每隔3周免疫一次，共免疫4次；初次免疫所用抗原是將雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻，后續(xù)3次免疫所用抗原是將雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混勻；第4次免疫后7天采血，血液4 ℃靜置直至分層，取血清，獲得雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體。

一種以上述雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體進(jìn)行Gα蛋白ELISA檢測(cè)方法，其特征在于依次按照如下步驟進(jìn)行：

將被測(cè)蛋白用ELISA包被液稀釋后，以每孔100ul加入到96孔板中，4℃包被過(guò)夜，倒掉包被液每孔100ul PBST洗滌3次；每孔加入200ul 3%牛血清蛋白37℃封閉4h，棄掉封閉液，每孔100ul PBST洗滌3次；每孔加入100 ul 1:4000稀釋的雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，37℃孵育1h，棄掉雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，PBST清洗3次；每孔加入100 ul 1:4000稀釋的羊抗兔IgG，37℃孵育1h，棄掉羊抗兔IgG，PBST清洗3次；每孔100ul ELISA顯色液，室溫避光顯色10min后，加入50ul終止液，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

本發(fā)明通過(guò)在Gα開放閱讀框兩端設(shè)計(jì)引物獲得了Gα的開放閱讀框全長(zhǎng)片段，構(gòu)建了Gα蛋白的大腸桿菌原核表達(dá)體系，首次在體外誘導(dǎo)表達(dá)了雙齒圍沙蠶Gα蛋白，從而首次獲得了雙齒圍沙蠶Gα多克隆抗體，并建立了雙齒圍沙蠶Gα蛋白的ELISA檢測(cè)方法，利用方法簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)的ELISA技術(shù)測(cè)定雙齒圍沙蠶在環(huán)境雌激素污染下Gα蛋白的變化情況，可為環(huán)境雌激素對(duì)雙齒圍沙蠶毒性效應(yīng)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)及依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例雙齒圍沙蠶總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例雙齒圍沙蠶Gα基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例質(zhì)粒pMD18-T-Gα經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例質(zhì)粒pMD18-T-Gα及質(zhì)粒pET-28a雙酶切經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例重組質(zhì)粒pET-28a-Gα經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例Gα蛋白表達(dá)情況經(jīng)SDS-PAGE電泳圖。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例溶解后的包涵體Gα重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳圖。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例Gα重組蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳圖。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例Gα重組蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖10為本發(fā)明實(shí)施例Gα多克隆抗體的Western Blot 檢測(cè)結(jié)果示意圖。

圖11為本發(fā)明實(shí)施例雙齒圍沙蠶Gα蛋白的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖12為本發(fā)明實(shí)施例雙齒圍沙蠶Gα蛋白的ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)不同濃度雙酚A誘導(dǎo)雌性沙蠶體壁Gα蛋白表達(dá)量示意圖。

圖13為本發(fā)明實(shí)施例雙齒圍沙蠶Gα蛋白的ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)不同濃度雙酚A誘導(dǎo)雄性沙蠶體壁Gα蛋白表達(dá)量示意圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：

本發(fā)明的雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白，依次按照如下方法制備：

a. 剪取雙齒圍沙蠶體壁組織于液氮中研磨，使用RNAiso Plus提取沙蠶RNA，使用Takara Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H -）試劑盒合成cDNA第一鏈；所提取的雙齒圍沙蠶總RNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1所示：圖1中M為DL2000 DNA marker，1-3號(hào)泳道為雙齒圍沙蠶總RNA提取結(jié)果。

b.根據(jù)Gα基因全長(zhǎng)（Gene Bank：JQ914104）在開放閱讀框兩端（206bp-1267bp）設(shè)計(jì)合成特異性引物，上游引物5’端加入BamH 酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，DNA序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物5’端加入Xho 酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基，DNA序列如SEQ ID NO:2所示，以雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。雙齒圍沙蠶Gα基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示：圖2中M為DL2000 DNA marker，1號(hào)泳道為Gα開放閱讀框擴(kuò)增產(chǎn)物；

c. 使用TIANGEN^?瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收片段，將回收目的片段（1061bp）與pMD18-T連接，構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T-Gα，將克隆質(zhì)粒pMD18-T-Gα切膠回收后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克??；對(duì)單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gα目的片段序列一致。pMD18-T-Gα質(zhì)粒經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示：圖3中M為DL5000 DNA marker，1號(hào)泳道為pMD18-T-Gα質(zhì)粒提取結(jié)果；

d. 將單克隆轉(zhuǎn)到5ml Amp 100μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200rpm 震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，使用TIANGEN?普通質(zhì)粒小提試劑盒抽提重組質(zhì)粒pMD18-T-Gα

e. 用限制性內(nèi)切酶BamH 和Xho 分別消化重組質(zhì)粒pMD18-T-Gα和質(zhì)粒pET-28a，并切膠回收Gα目的片段與質(zhì)粒pET-28a，將回收的Gα目的片段與質(zhì)粒pET-28a按照摩爾比2.25：1的比例，以T4 DNA連接酶，16℃連接14h；切膠回收重組質(zhì)粒pET-28a-Gα后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，挑取單克隆；對(duì)所挑取的單克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Gα目的片段序列一致。質(zhì)粒pMD18-T-Gα及質(zhì)粒pET-28a雙酶切經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖4所示：圖4中M為DL5000 DNA marker，1號(hào)泳道為pET-28a質(zhì)粒雙酶切結(jié)果，2號(hào)泳道為重組質(zhì)粒pMD18-T-Gα雙酶切結(jié)果。重組質(zhì)粒pET-28a-Gα經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳圖如圖5所示：圖5中M為DL5000 DNA marker，1-2號(hào)泳道為pET-28a-Gα重組質(zhì)粒提取結(jié)果；

f. 將所挑取的單克隆轉(zhuǎn)到5ml Amp 100μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃200rpm 震蕩過(guò)夜培養(yǎng)，使用TIANGEN?普通質(zhì)粒小提試劑盒抽提重組質(zhì)粒pET-28a-Gα；

g. 將重組質(zhì)粒pET-28a-Gα轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，挑取平板中單一圓滑菌落于5ml Kan 40μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm，震蕩培養(yǎng)12~16h，從培養(yǎng)好的菌液中吸取4ml加入到200ml滅菌的Kan 40μg/mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm震蕩培養(yǎng)至OD600nm在0.5~0.6；加入IPTG，使IPTG的終濃度為1.0mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃，200rpm/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4h，收集菌液；菌液于4℃，12000rpm離心5min，收集菌體；將所收集的菌體用PBS按照體積比5:1的比例清洗，4℃，12000rpm離心5min，共清洗2次，收集菌體；然后用含有1%Triton X-100的PBS對(duì)菌體進(jìn)行重懸，重懸后進(jìn)行超聲波破碎，破碎后4℃，12000rpm離心30min棄去上清，沉淀用15ml PBS重懸，4℃保存。

分別取空白對(duì)照菌液和誘導(dǎo)表達(dá)后菌液的全菌、上清和沉淀各20μl于PCR管中，加入5μl 5×SDS Loading buffer，混合均勻，沸水中煮10min，恢復(fù)到室溫后于聚丙烯凝膠上樣SDS-PAGE電泳圖如圖6所示：圖6中，M為蛋白Marker，1號(hào)泳道為誘導(dǎo)后破碎全菌蛋白表達(dá)情況，2號(hào)泳道為破碎上清蛋白表達(dá)情況，3號(hào)泳道為破碎沉淀蛋白表達(dá)情況。

經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色后判斷重組蛋白Gα大量表達(dá)于沉淀中，以包涵體的形式存在。

h. 按照每100ml培養(yǎng)基所得菌體加入15ml洗滌液重懸沉淀，洗滌5min，4℃，12000rpm離心20min，共洗滌2次；再按照每100ml培養(yǎng)基所得菌體加入10ml變性液重懸沉淀，于4℃冰箱中過(guò)夜反應(yīng)，直至變性液澄清，4℃，12000rpm離心20min，取上清（溶解的變性蛋白）于-20℃保存；

所述洗滌液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，2M尿素，PH7.9；

所述變性液：0.5 M NaCl，20mM Tris-HCl，8M尿素，PH7.9。

溶解后的包涵體Gα重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳圖如圖7所示：M為蛋白Marker，1號(hào)泳道為溶解后上清，2號(hào)泳道為溶解后沉淀；

i. 選用Ni-NAT預(yù)裝柱采用咪唑梯度純化的方式對(duì)所得上清（變性的溶解蛋白）進(jìn)行純化，用1.5ml離心管收集洗脫緩沖液洗脫的目的蛋白，所用試劑的配制體系如下：

結(jié)合緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

漂洗緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，80mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，100mM咪唑，8M尿素，PH7.9；

洗脫緩沖液：0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，1M咪唑，8M尿素，PH7.9。

所收集的蛋白純化后經(jīng)SDS-PAGE電泳圖如圖8所示：M為蛋白Marker，1號(hào)泳道為純化前蛋白樣品，2號(hào)泳道為漂洗前收集液，3-4號(hào)泳道為80mM咪唑漂洗，5-6號(hào)泳道為100mM咪唑漂洗，7號(hào)泳道為1M咪唑洗脫。

j. 將純化的蛋白收集起來(lái)，利用透析袋，采用梯度復(fù)性的方法進(jìn)行蛋白復(fù)性：將裝有純化蛋白的透析袋放入2L復(fù)性緩沖液中，復(fù)性緩沖液按尿素濃度的不同，共設(shè)置5個(gè)濃度梯度，緩沖液的體系為： 0.5M NaCl，20mM Tris-HCl，尿素6M，4M，2M，1M，0M，PH7.9， 4℃磁力攪拌，透析8h；一個(gè)梯度透析之后再放入到下一梯度的透析緩沖液中透析，直到透析完成，收集蛋白4℃，12000g離心15min，收集上清棄去沉淀。

使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定所收集的上清中蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白濃度到1mg/ml，測(cè)定蛋白濃度所用標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9。

實(shí)施例2：

一種以上述雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白制備的雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，按照如下方法制備：以40ug/kg的抗原劑量免疫新西蘭兔，每隔3周免疫一次，共免疫4次；初次免疫所用抗原是將雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白與等體積弗氏完全佐劑混勻，后續(xù)3次免疫所用抗原是將雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白與等體積弗氏不完全佐劑混勻；第4次免疫后7天采血，血液4 ℃靜置直至分層，取血清，獲得雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體。

Western Blot檢測(cè)雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體的特異性：使用RIPA裂解液提取雙齒圍沙蠶的總蛋白，取20μl總蛋白加入5μl 5×SDS Loading buffer，混勻后沸水中煮10min，之后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，120V轉(zhuǎn)膜35min，完成后用3%BSA，4℃封閉過(guò)夜，加入1：4000稀釋的本發(fā)明實(shí)施例2的雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，37℃孵育1h，TBS清洗3次，加入1：4000稀釋的羊抗體IgG，37℃孵育1h，TBS清洗3次，DAB試劑盒顯色5-10min，ddH2O清洗3次，干燥后觀察顯色情況。

結(jié)果如圖10所示：圖10中M為蛋白Marker，1號(hào)泳道為Western Blot鑒定結(jié)果。

結(jié)果表明：目的條帶所處位置出現(xiàn)顯色條帶，表明所制備的抗體與沙蠶體內(nèi)Gα蛋白可以有效結(jié)合，證明所制備的多克隆抗體可以用來(lái)檢測(cè)沙蠶體內(nèi)G蛋白的存在。

實(shí)施例3：

本發(fā)明的Gα蛋白ELISA檢測(cè)方法，依次按照如下步驟進(jìn)行：

將被測(cè)蛋白用ELISA包被液稀釋后，以每孔100ul加入到96孔板中，4℃包被過(guò)夜，刺入倒掉包被液每孔100ul PBST洗滌3次；每孔加入200ul 3%牛血清蛋白37℃封閉4h，棄掉封閉液，每孔100ul PBST洗滌3次；每孔加入100 ul 1:4000稀釋的雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，37℃孵育1h，棄掉雙齒圍沙蠶Gα蛋白的多克隆抗體，PBST清洗3次；每孔加入100 ul 1:4000稀釋的羊抗兔IgG，37℃孵育1h，棄掉羊抗兔IgG，PBST清洗3次；每孔100ul ELISA顯色液，室溫避光顯色10min后，加入50ul終止液，酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光值。

實(shí)驗(yàn)例1：按照本發(fā)明實(shí)施例3的方法，將按濃度梯度稀釋的本發(fā)明實(shí)施例Gα重組蛋白直接包被到96孔板中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀下測(cè)定OD450的值。以凈吸光值（陽(yáng)性O(shè)D450-陰性O(shè)D450）為橫坐標(biāo)，各Gα重組蛋白濃度的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制Gα重組蛋白的間接ELISA測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖11所示。其中，蛋白濃度為6.25ng/ml時(shí)，其吸光值不在線性范圍內(nèi)，所以舍棄該組數(shù)據(jù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線R²=0.9903，具有良好的線性關(guān)系，Gα的測(cè)定范圍為12.5~400ng。

實(shí)驗(yàn)例2：利用環(huán)境雌激素雙酚A分別誘導(dǎo)雌性、雄性雙齒圍沙蠶，分別在4d、7d、14d時(shí)提取沙蠶體壁總蛋白，利用本發(fā)明實(shí)施例3的方法進(jìn)行Gα蛋白含量的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖12~13所示。圖12~13中**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(p<0.01)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(p<0.05)

結(jié)果顯示不同濃度雙酚A均能導(dǎo)致沙蠶體內(nèi)Gα蛋白含量出現(xiàn)顯著變化，表明本發(fā)明實(shí)施例3方法可以及時(shí)的反應(yīng)出機(jī)體對(duì)環(huán)境雌激素的響應(yīng)機(jī)制。

序 列 表

<110> 大連海洋大學(xué)

<120> 雙齒圍沙蠶Gα重組蛋白、多克隆抗體及Gα蛋白ELISA檢測(cè)方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游引物

<400> 1

TTGGATCCATGGCTTGCTGTCTGAG 25

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 下游引物

<400> 2

CGCTCGAGCACTAAGTTGTACTCTTTCAG 29