本發(fā)明涉及一種具有抗血栓活性的貽貝多肽的制備方法。
背景技術(shù)：
：海洋生物資源豐富、種類繁多、生物鏈健全及再生能力強，海洋生物約占全球生物總量的一半。多變的生活環(huán)境、漫長的進化歷程使這些生物具有與陸生生物不同的生理性狀，并產(chǎn)生許多結(jié)構(gòu)新穎、作用特殊的生物活性物質(zhì)，是新型生物活性物的巨大來源，具有很大的開發(fā)潛力。生物活性肽是指具有優(yōu)化機體代謝環(huán)境、有益于機體健康的一類多肽。一般由蛋白質(zhì)酶解制得，通常含有3-20個氨基酸殘基，它在原蛋白質(zhì)序列上沒有生物活性，但是通過酸、堿或酶水解釋放后具有生物活性，其活性取決于它們的氨基酸組成及其排列順序。海洋生物是開發(fā)生物活性肽的良好資源，近年來人們已從海洋生物、海洋加工的副產(chǎn)物中提取出許多不同種類的生物活性肽。隨著消費者在飲食與健康方面意識的提高，對功能性食品成分和保健營養(yǎng)品的認知和需求也逐漸增加，來源于海洋生物和海洋加工副產(chǎn)物的生物活性肽，因為其具有安全、無毒副作用、價格競爭力強等優(yōu)點在功能性食品的開發(fā)中極具潛力。血栓是指血液成分在血液流動過程中，在血管或心臟內(nèi)膜表面形成的一種半凝塊狀物質(zhì)。血栓性疾病包括動脈血栓形成、靜脈血栓形成、微血栓形成、血栓栓塞性疾病等。正常情況下體內(nèi)凝血與抗凝血是處于一種動態(tài)平衡之中，當凝血異常形成血栓時，應(yīng)用抗凝血藥物抑制凝血以及使用溶栓藥物增強纖溶系統(tǒng)作用，這些是在疾病發(fā)生后采取措施糾正體內(nèi)的失衡。其實從體內(nèi)凝血狀態(tài)異常到最終血栓形成引發(fā)疾病，其間有比較長的病理過程。通過對患者凝血狀態(tài)指標變化的監(jiān)測中獲得疾病發(fā)生發(fā)展的信息，就可以早期預(yù)防血栓的形成，對己經(jīng)發(fā)生血栓者的治療預(yù)后也可以做出指導和評估。血栓性疾病嚴重危害中老年人的健康，近年來隨著生活節(jié)奏的加快，血栓性疾病患者數(shù)量明顯增加，因而人們越來越關(guān)注血栓的預(yù)防及其治療。凝血是機體重要的生理防御過程，但病理性血栓嚴重危害著人類健康。當前，心腦血管血栓性疾病發(fā)病率逐年上升。為了預(yù)防血栓形成或阻止己形成血栓的發(fā)展，均應(yīng)使用抗凝血藥物?？寡耗瘷C制為加入的物質(zhì)可阻止凝血酶原形成凝血酶，從而抑制纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化；纖維蛋白溶解機理是通過加入纖溶酶原激活物激活纖溶酶原生成纖溶酶，纖溶酶誘導纖維蛋白轉(zhuǎn)化為纖維蛋白降解產(chǎn)物；抗血小板聚集機理是通過加入杭血小板聚集物質(zhì)減少附著存纖維蛋白骨架上的血小板。抗凝血藥通常都是通過對凝血過程中某一關(guān)鍵的凝血因子(如組織因子、因子X和凝血酶)的抑制作用而阻斷凝血過程的進行。臨床上抗凝血藥物大多圍繞對凝血酶及其他凝血因子的抑制而達到抗凝血作用。二十一世紀是海洋的世紀，海洋是未來食品、藥品和保健品的主要原料基地。開發(fā)海洋，充分利用海洋資源是當今科技發(fā)展的重要方向。貽貝作為一種海洋資源，集高蛋白、保健、防病于一體具有很高的食療與藥用功效。因適應(yīng)性強，產(chǎn)量高等特點，容易大量人工繁殖。不僅蛋白質(zhì)含量高，氨基酸模式更接近人體需要。經(jīng)酶解處理可以釋放出具有各種活性多肽。目前海洋生物活性肽的提取方法主要有3種：溶劑萃取、微生物發(fā)酵和酶水解。由于酶水解法沒有有機溶劑及有毒的化學品的殘留已成為食品和制藥工業(yè)的首選方法。酶法制備生物活性肽是通過適當?shù)牡鞍酌杆獾鞍讈碇苽渖锘钚噪牡囊环N方法。將具有抗凝血效果的生物活性肽用于預(yù)防血栓形成、溶栓治療和介入治療后的維護治療具有廣闊的應(yīng)用前景。主要是采用合成方法制備抗凝血肽和從生物分泌物中提取抗凝血肽。目前國內(nèi)外臨床使用的主要抗凝血藥物是普通肝素、低分子肝素、華法林等，這些藥物存在導致血小板減少、出血等副作用或起效較慢等缺點。而多肽類抗凝血藥物具有起效快、副作用較低等突出優(yōu)點，是今后抗凝血藥的重點發(fā)展方向。Sarmientos從水蛭中分離得到抗凝血多肽。Lu等從蝎子毒液中提取到活性肽（scorpionvenompeptides,SVP），SVP能抑制老鼠血小板聚集和血栓形成，并能提高溶纖活性。Barbouche等從毒蛇Viperalebetina的毒液中分離得到Lebetins1和Lebetins2兩組多肽，它們能抑制血小板的凝聚。但是它們也都存在一些問題，由于它們是從水蛙的唾液或者毒蛇、蝎子的毒液中得到，它們本身就是水蛙的唾液或者毒蛇、蝎子的毒液的有效成分，所以它具有這些物質(zhì)的副作用，如引起大面積出血。來源于食品的抗凝血活性肽，由于其來源于食品，它在人的腸胃內(nèi)可能就被消化且吸收，在人體的抗凝系統(tǒng)中發(fā)揮作用，如Hartmann從新生兒血清中分離得到腸胃消化K-酪蛋白C-端部分產(chǎn)生的具有抑制血小板聚集和抑制纖維蛋白原結(jié)合到血小板表面受體上具活性的肽片段。因此可以預(yù)見來源于食品的抗凝血肽安全性高。而目前從食品原料通過酶解得到抗凝血效果的生物活性肽的研究鮮見報道，分析原因是沒有找到合適的酶解底物，二是從事醫(yī)學研究的科研人員更重視溶栓藥物的開發(fā)。從一定程度上講，預(yù)防血栓的發(fā)生比發(fā)生血栓后溶栓治療更有意義。研究貽貝蛋白水解物的抗凝血酶活性，從而開發(fā)出一種具有抗凝血活性的功能性成分應(yīng)用到保健食品和藥品中，有廣闊應(yīng)用前景?？鼓淖鳛橐环N清除血栓的藥物在已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，目前市場上的抗凝血藥物提取率低，副作用大，或價格昂貴。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明從上述影響抗凝血活性的機理及目前存在的問題入手，最大程度的保留貽貝中的抗凝血肽，并將其濃縮富集。本發(fā)明旨在選用不同種類的蛋白酶水解食源性的貽貝蛋白，即采用定向酶水解技術(shù)，制備具有抗凝血活性的多肽粉末，并對活性肽進行提純濃縮，該法條件溫和，成本低，副產(chǎn)物少，活性高。相對于化學合成或其他來源的抗凝血藥物，該產(chǎn)品消化吸收性強，不會對人體產(chǎn)生副作用，對凝血有較強的預(yù)防作用。本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種具有抗血栓活性的貽貝多肽的制備方法，其步驟如下：（1）前處理：新鮮市售貽貝自來水沖洗三遍，去除雜質(zhì)及鹽分。（2）勻漿：將沖洗干凈的貽貝去殼，將貝肉剪碎，加3-10倍體積去離子水混勻后用勻漿機進行勻漿處理（5000-8000rpm，5-10min），得到貽貝勻漿液。（3）酶解：選用胰蛋白酶、中性蛋白酶分別對貽貝勻漿液進行酶解，酶解過程中以0.5mo1/LNaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值并維持其穩(wěn)定。酶解條件按表1操作。表1：酶解條件酶種類溫度/℃pH酶解時間/min加酶量/(u/g)胰蛋白酶25-557.0~9.020-1801000~5000中性蛋白酶30-506.5~8.520-1801000~5000（4）滅酶、離心：將酶解液置于95-100℃水浴鍋中加熱8-15min使酶失活，待冷卻至室溫后離心（5000-10000rpm，10-30min），得酶解多肽上清液。（5）超濾：采用1000-3000Da的濾膜對酶解液進行膜截留，保留流出液部分，即可獲得分子量低于1000Da-3000Da的多肽液體。（6）序列鑒定：將超濾多肽用MALDI-TOF-MS(基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜)確定其分子量分布，并采用Q-Tof測定其多肽序列。（7）抗凝血活性確定酶水解物抗凝血肽與凝血酶標準品反應(yīng)混合，用酶標儀測定不同酶解條件下OD值，計算出多肽的凝血酶抑制率，以此為指標分析其抗凝效果。（8）濃縮、干燥：蒸發(fā)濃縮的方式進行噴霧干燥前的產(chǎn)品濃縮操作，可以采用單效蒸發(fā)也可采用多效蒸發(fā)，以固形物在20%-45%之間為宜。將濃縮后的液體由進料泵勻速送入噴霧干燥塔內(nèi)進行噴霧干燥，此時出風溫度為75℃-85℃，進風溫度為138℃-146℃，進料速度的控制工作電壓為44V-70V；將噴霧干燥處理后的產(chǎn)品送入多級旋風分離器進行氣粉分離，將氣粉分離后的產(chǎn)品在配有除濕器的恒溫干燥室內(nèi)收集得成品粉末。也可進行冷凍干燥，漿料厚度為3mm-7mm，工藝條件為：工作壓力35-80Pa、冷凍溫度-10℃--30℃、冷凍時間5h-12h、升華溫度10-50℃、解析溫度10-50℃，制得干燥物。將干燥物用真空冷凍干燥粉碎機進行粉碎，過60目-80目篩，所得粉末即為干燥的貽貝抗凝血活性肽粉末，低溫干燥保存。本發(fā)明的有益效果為:（1）以貽貝為原料開發(fā)抗凝血肽的技術(shù)，目前并未見相關(guān)專利文獻，本發(fā)明所述的酶解制備方法有效填補該領(lǐng)域空白，經(jīng)鑒定，根據(jù)本發(fā)明所述酶解制備方法制備的抗凝血活性肽不同于目前報道的同類產(chǎn)品。（2）采用定向酶解技術(shù)，對肽段的切割位點把握更為精準，有利于活性肽的分離及活性鑒定。酶解后的貽貝多肽液抗凝血活性較高，該1mg抗凝血貽貝多肽粉的抗凝血酶活性單位為90ATU/mg——150ATU/mg。（3）采用貽貝作為原料，來源廣泛，價格低廉，可進行地、中、高規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)，滿足各種規(guī)格工廠的加工需要，對貽貝產(chǎn)品的深加工及其在功能性食品、保健食品或藥品中的開發(fā)利用具有重要的指導性意義。（4）將獲得的具有較高抗凝血活性的多肽進行富集濃縮及干燥成粉，提升抗凝血活性的同時便于儲存，并且該產(chǎn)品粉末具有顯著抗凝血活性。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步解釋說明。1）前處理：新鮮市售貽貝自來水沖洗三遍，去除雜質(zhì)及鹽分。2）勻漿：將沖洗干凈的貽貝去殼，將貝肉剪碎，加3-10倍體積去離子水混勻后用勻漿機進行勻漿處理（5000-8000rpm，5-10min），得到貽貝勻漿液。3）酶解：選用胰蛋白酶、中性蛋白酶分別對貽貝勻漿液進行酶解，酶解過程中以0.5mo1/LNaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值并維持其穩(wěn)定。酶解條件按表1操作。表1：酶解條件酶種類溫度/℃pH酶解時間/min加酶量/(u/g)胰蛋白酶25-557.0~9.020-1801000~5000中性蛋白酶30-506.5~8.520-1801000~5000（4）滅酶、離心：將酶解液置于95-100℃水浴鍋中加熱8-15min使酶失活，待冷卻至室溫后離心（5000-10000rpm，10-30min），得酶解多肽上清液。（5）超濾：采用1000-3000Da的濾膜對酶解液進行膜截留，保留流出液部分，即可獲得分子量低于1000Da-3000Da的多肽液體。（6）抗凝血活性確定酶水解物抗凝血肽與凝血酶標準品反應(yīng)混合，用酶標儀測定不同酶解條件下OD值，計算出多肽的凝血酶抑制率，以此為指標分析其抗凝效果。（7）濃縮、干燥：蒸發(fā)濃縮的方式進行噴霧干燥前的產(chǎn)品濃縮操作，可以采用單效蒸發(fā)也可采用多效蒸發(fā)，以固形物在20%-45%之間為宜。將濃縮后的液體由進料泵勻速送入噴霧干燥塔內(nèi)進行噴霧干燥，此時出風溫度為75℃-85℃，進風溫度為138℃-146℃，進料速度的控制工作電壓為44V-70V；將噴霧干燥處理后的產(chǎn)品送入多級旋風分離器進行氣粉分離，將氣粉分離后的產(chǎn)品在配有除濕器的恒溫干燥室內(nèi)收集得成品粉末。本發(fā)明所得到的貽貝蛋白抗凝血活性肽粉具有顯著抗凝血活性的特點，相關(guān)的研究方法如下：（1）多肽含量的測定采用BCA方法對最終多肽混合物粉末進行測定。具體操作步驟如下：配制標準品和工作液：A.梯度稀釋牛血清蛋白（BSA）標準品B.按實驗所需工作液的體積，將BCA試劑盒中的A液與B液按照50:1的比例進行混合。室溫下貯存。蛋白含量測定a.取25μL已稀釋的梯度濃度的BSA和待測蛋白質(zhì)樣品，加入到96孔板中。b.每個試管中加入200μL工作液，使其充分混勻。c.密封96孔板，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min。d.將96孔板冷卻至室溫。使用酶標儀測量在波長562nm處樣品的吸光值。數(shù)據(jù)分析：以在波長562nm處BSA標準品的吸光值為縱坐標，BSA標準品濃度為橫坐標，制作標準曲線，以此計算待測樣品蛋白質(zhì)的濃度。（2）抗凝血活性（凝血酶抑制率）測定方法采用酶標儀法，設(shè)置酶標儀溫度為37℃，測定波長405nm。纖維蛋白原溶液和凝血酶溶液均以Tris-HCl緩沖液(0.05mo1/L,pH=7.4)配制。向酶標板中加入140μL1mg/ml(W/V)纖維蛋自原溶液和40μL樣品溶液，混勻后讀數(shù)(ASB)。再加入10μL凝血酶溶液(12U/mL)開始反應(yīng)，37℃預(yù)熱10min后讀數(shù)(AS)。取40μLTris-HCL緩沖液代替樣品溶液，其他操作同樣品管，測得吸光值(ACB）和AC。定義凝血酶抑制活性為每毫克貽貝蛋白的抗凝血酶活力，單位：ATU/mg。凝血酶抑制活性=Ce*Y*Ve/(Ch*Vh*m)Ve——標準凝血酶加樣體積/微升Ce——標準凝血酶活性U/mlY——抑制率%Ch——樣品濃度，mg/mlVh——樣品加樣體積/微升m——貽貝蛋白含量，mgY=[(AC-ACB)-(AS-ASB)]/(AC-ACB)*100%(3)水解度測定方法采用pH-stat法測定貽貝蛋白的水解度，加入蛋白酶后開始計時，在水解過程中加入0.5mol/L的NaOH維持pH恒定，每20min記錄一次耗堿量，直到水解結(jié)束。通過下式計算水解度。DH(%)=VNaOH*NNaOH/(α*Mp*Htot)*100式中：a=10pH-pK/(1+10pH-pK)pK=7.8+2400*(298-t)/298TT=273.15+tVNaOH：滴定消耗的堿體積（mL）C：滴定消耗的堿當量濃度（mol/L）Mp：蛋白質(zhì)質(zhì)量(g)α：α-氨基的平均解離度t：反應(yīng)環(huán)境的溫度（4）水分測定方法根據(jù)GB50093-2010中的水分測定方法進行測定：①實驗前將鋁稱量瓶、離心管在105℃烘箱中干燥過夜，稱重前在干燥器中冷卻1-2h，稱量瓶的重量記為m1。②向勻漿機中加入100mL提前預(yù)熱到30℃的去離子水，再加入3滴消泡劑，然后將4g（精確至0.001g）樣品加入其中，將攪拌器轉(zhuǎn)速慢慢調(diào)節(jié)到1500rpm，攪拌10min。③立刻取5mL混合液于三個鋁稱量瓶中，稱重記為m2。將其放入105℃烘箱中直至恒重，稱重記為m3。按下列公式進行計算：水分含量M%=（m3-m1）/（m2-m1）×100%（5）蛋白質(zhì)測定方法采用自動凱氏定氮儀法進行測定。稱取0.2g貽貝，精確至0.001g。按照儀器說明書的要求進行檢測。計算的時候氮的換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)為6.25。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。經(jīng)上述檢測得到本產(chǎn)品貽貝抗凝血活性多肽粉的基本成分為：總蛋白含量≥60%，其中小于1000-3000Da的多肽含量大于50%、胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解液水解2小時的水解度分別為15.67%和12.76%、灰分0.1%-0.5、水分≤4%。經(jīng)檢測1mg貽貝胰蛋白酶和中性蛋白酶酶解液干粉的抗凝血酶活性單位分別為135.63ATU/mg和91.44ATU/mg。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3