本發(fā)明涉及環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種適合于海洋環(huán)境的石油降解菌Oil 2-3、石油降解菌Oil 2-3分離純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程的加快，海上交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展和海洋油氣資源的進(jìn)一步勘探開發(fā)，海上溢油事故也不斷地增多。海上溢油污染是各種海洋污染類型中發(fā)生頻率最高、分布面積最廣、危害程度最大的一種。目前，海上溢油應(yīng)急處理方法有物理法如圍油欄圍控、吸油氈吸附等，化學(xué)法如噴灑化學(xué)分散劑等。然而，物理法對(duì)于海況要求較高且只能回收總溢油量的10-15％；而化學(xué)分散劑雖然可在一定程度上將海面的溢油分散成極微小的顆粒，但不能實(shí)現(xiàn)溢油真正的消除，另外化學(xué)分散劑存在二次污染，會(huì)給海洋帶來新的污染。因此，亟待研制新型海上溢油應(yīng)急處理方法。

微生物降解已被證明是一種非常有效的石油污染清除技術(shù)，其具有無污染、成本低、效果好等優(yōu)點(diǎn)，較適合海上溢油應(yīng)急處理的實(shí)際應(yīng)用，因此，有必要篩選出高效降解石油的菌株來進(jìn)行海上溢油應(yīng)急處理的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于上述狀況，有必要提供一種生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、環(huán)境耐受性強(qiáng)、降解效率高、適用于海洋環(huán)境的石油降解菌，以應(yīng)用于海上溢油應(yīng)急處理。

本發(fā)明提供一種石油降解菌Oil 2-3，其分類命名為耐堿海旋菌Thalassospira alkalitolerans，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其保藏編號(hào)為：CGMCC No.13079。

進(jìn)一步地，所述石油降解菌Oil 2-3的菌落呈奶油白色，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣規(guī)則。

進(jìn)一步地，所述石油降解菌Oil 2-3的pH耐受范圍為pH值4-11。

本發(fā)明還提供一種石油降解菌Oil 2-3的分離純化方法，所述分離純化方法為：取3mL受石油污染的海水水樣接種至已經(jīng)滅菌的100mL富集培養(yǎng)液中，并加入石油0.5mL，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)結(jié)束后挑選液體混濁、石油層消失的培養(yǎng)液，進(jìn)行新一輪富集，重復(fù)5輪富集，每輪富集培養(yǎng)液中加入的石油量比上一輪多0.5mL，完成石油降解菌的富集馴化；將經(jīng)過富集馴化的培養(yǎng)液在石油平板上進(jìn)行劃線分離，25℃培養(yǎng)1天，石油平板上長(zhǎng)出清晰的菌落，挑選生長(zhǎng)良好且噬油圈清晰的菌落，再次在石油平板上進(jìn)行劃線分離，反復(fù)多次劃線分離，直至分離篩選出生長(zhǎng)良好、菌落單一的菌株。

進(jìn)一步地，所述富集馴化培養(yǎng)基配方為：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵12mg，酵母粉0.2，海水1L，pH 7.6-8.0。

進(jìn)一步地，所述石油平板培養(yǎng)基配方為：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵12mg，酵母粉0.2g，瓊脂20g，海水1L，pH 7.6-8.0，在劃線分離前在平板表面均勻涂覆200μL已滅菌石油。

本發(fā)明還提供一種石油降解菌Oil 2-3在石油降解中的應(yīng)用，所述石油降解菌Oil 2-3對(duì)石油降解率大于84.6％。

本發(fā)明還提供一種石油降解菌Oil 2-3在石油降解中的應(yīng)用方法，所述應(yīng)用方法為：用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌株Oil 2-3菌落，接種至已滅菌的100mL種子液體培養(yǎng)基中，25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)3天，該菌株Oil 2-3培養(yǎng)液作為種子液待用；按照3％的量將菌株Oil 2-3種子液添加到100mL已滅菌且添加營(yíng)養(yǎng)鹽的含石油海水中，28℃、180rpm振蕩處理7天，以添加等同量營(yíng)養(yǎng)鹽但不添加耐堿海旋菌Oil 2-3的含石油海水作為空白；將經(jīng)處理7天后的添加石油降解菌Oil 2-3的含石油海水及空白分別全部移入分液漏斗中，并向分液漏斗中移入40mL石油醚，充分振蕩后靜置，取上層油相0.1mL，移入到棕色25mL容量瓶中，并用石油醚定容至25mL，利用紫外可見分光光度計(jì)在225nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定石油醚定容液和空白的OD值，并計(jì)算得到耐堿海旋菌Oil 2-3的石油降解率。

進(jìn)一步地，所述營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量為氯化銨0.12g/1L含石油海水、磷酸氫二鉀0.02g/1L含石油海水、檸檬酸鐵0.02g/1L含石油海水、酵母粉0.02g/1L含石油海水。

進(jìn)一步地，所述種子液體培養(yǎng)基配方為：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵0.2g，酵母粉0.2g，海水1L，pH 7.6-8.0。

本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明從受石油污染的海水水樣中篩選到石油降解菌Oil 2-3菌株，并通過遺傳學(xué)分類鑒定，確定該菌株為耐堿海旋菌；通過對(duì)石油降解以及對(duì)其環(huán)境耐受性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)石油降解率大于84.6％，該菌株的pH耐受范圍為pH值4-11，該菌株適合在海上溢油環(huán)境生存，可利用并降解海水中石油，實(shí)現(xiàn)海上溢油的微生物降解。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的石油降解菌Oil 2-3的石油平板培養(yǎng)圖。

圖2是經(jīng)處理7天后的空白和添加石油降解菌Oil 2-3的含石油海水的對(duì)比圖。

其中：1：處理7天后的空白；2：處理7天后的添加石油降解菌Oil 2-3的含石油海水。

圖3是pH耐受測(cè)試液接種石油降解菌Oil 2-3培養(yǎng)7天后的對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施例作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

1、菌株的富集、分離及純化

自青島膠州灣采集受石油污染的海水水樣，取3mL水樣接種至已經(jīng)滅菌的100mL富集馴化培養(yǎng)液中，并加入石油0.5mL，將其放入振蕩培養(yǎng)箱中28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)7天，培養(yǎng)結(jié)束后，挑選液體混濁、石油層消失的培養(yǎng)液，進(jìn)行新一輪富集馴化。重復(fù)上述步驟(富集馴化)5輪，每輪培養(yǎng)液中加入石油量比上一輪多0.5mL，完成石油降解菌的富集馴化。

富集馴化培養(yǎng)基配方：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵12mg，酵母粉0.2，海水1L，pH 7.6-8.0。

將經(jīng)過富集馴化的培養(yǎng)液在石油平板上進(jìn)行劃線分離，25℃培養(yǎng)1天，石油平板上長(zhǎng)出清晰的菌落，挑選生長(zhǎng)良好且噬油圈清晰的菌落，再次在石油平板上進(jìn)行劃線分離，如此反復(fù)多次劃線分離，直至分離篩選出生長(zhǎng)良好、菌落單一的菌株，命名為Oil 2-3。圖1是本發(fā)明的石油降解菌Oil 2-3的石油平板培養(yǎng)圖，參見圖1所示，菌株Oil 2-3在石油平板培養(yǎng)基上，菌落呈奶油白色，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣規(guī)則。

石油平板培養(yǎng)基配方：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵12mg，酵母粉0.2g，瓊脂20g，海水1L，pH 7.6-8.0。在劃線分離前在平板表面均勻涂覆200μL已滅菌石油。

2、菌株的鑒定

對(duì)篩選到的菌株Oil 2-3進(jìn)行細(xì)菌分子遺傳學(xué)分類鑒定：采用16S rDNA序列測(cè)定和分析的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。利用細(xì)菌通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向引物為27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)，反向引物為1492R(5’-GGTTACCT TGTTACGACTT-3’)，產(chǎn)物經(jīng)電泳、純化后測(cè)定其全序列，將菌株Oil 2-3的測(cè)序結(jié)果提交至GenBank進(jìn)行注冊(cè)，獲得基因序列號(hào)為KX881509，將序列結(jié)果與基因庫中已登陸的16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較。利用Mega 6.0軟件的鄰接法Neighbor-Joining分析比對(duì)結(jié)果和參考菌株序列的發(fā)育關(guān)系，用bootstrap方法進(jìn)行1000次重抽樣，估計(jì)系統(tǒng)樹中關(guān)節(jié)點(diǎn)的置信值，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在系統(tǒng)發(fā)育樹中，該菌與Thalassospira alkalitolerans(NR114386)聚成一個(gè)分支，相似度為100％。因此，可以判定該菌株為耐堿海旋菌Thalassospira alkalitolerans，命名為耐堿海旋菌Oil 2-3。

耐堿海旋菌Oil 2-3的基因序列為：

AGTCGTACGAGAAGGTTCCTTCGGGAACTGGAGAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTGGGGACCTACCTTTTAGTGGGGGATAACGGTTGGAAACGACCGCTAATACCGCATACGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGCTAAGAGATGGACCCGCGTTGGATTAGATAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGTCTTCGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGATGTGAAGATGATGACGGTAGCATCAGAAGAAGCCCCGGCTAATTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAAGGGGCAAGCGTTGTTCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGCACGCAGGCGGTCTTGCCAGTCAGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTCTGATACTGCAGGACTAGAGACTAGGAGAGGGTGGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGCCACCTGGACTAGATCTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGTTGTCGGGACTTCGGTTTCGGTGACGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCCCTATCGCGATTACCAGAGATGGTTTTCATCAGTTCGGCTGGATAGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAGGAAGGCGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAACTACAGAGGGCTGCTTCTTGGCAACAAGTGGCGAATCCCAAAAAGTTATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTTACCCGAATGACGGTGGGCTAACCAGATTTA。

將篩選到的菌株耐堿海旋菌Oil 2-3進(jìn)行菌種保藏，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2016年10月12日；保藏編號(hào)為：CGMCC No.13079。

3、菌株對(duì)石油的降解

用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌株Oil 2-3菌落，接種至已滅菌的100mL種子液體培養(yǎng)基中，25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)3天，該菌株Oil 2-3培養(yǎng)液作為種子液待用。其中，種子液體培養(yǎng)基采用250mL三角瓶進(jìn)行承裝。種子液體培養(yǎng)基配方：氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵0.2g，酵母粉0.2g，海水1L，pH7.6-8.0。

按照3％的量將菌株Oil 2-3種子液添加到100mL已滅菌且添加營(yíng)養(yǎng)鹽的含石油海水中，28℃、180rpm振蕩處理7天。其中，添加的營(yíng)養(yǎng)鹽及營(yíng)養(yǎng)鹽的添加量為氯化銨0.12g/1L含石油海水、磷酸氫二鉀0.02g/1L含石油海水、檸檬酸鐵0.02g/1L含石油海水、酵母粉0.02g/1L含石油海水。以添加等同量營(yíng)養(yǎng)鹽但不添加耐堿海旋菌Oil 2-3的含石油海水作為空白。圖2是經(jīng)處理7天后的空白和添加石油降解菌Oil 2-3的含石油海水的對(duì)比圖，參見圖2所示，添加菌株Oil2-3的含石油海水液體混濁，無明顯油層，而空白對(duì)照中的油層與水層分層明顯，說明菌株Oil 2-3對(duì)石油降解效果明顯。

為了測(cè)定菌株Oil 2-3對(duì)石油的降解效率，將經(jīng)處理7天后的添加石油降解菌Oil 2-3的含石油海水及空白分別全部移入250mL分液漏斗中，并向分液漏斗中移入40mL石油醚(60-90℃)，充分振蕩后靜置。取上層油相0.1mL，移入到棕色25mL容量瓶中，并用石油醚(60-90℃)定容至25mL。利用紫外可見分光光度計(jì)，在225nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定石油醚(60-90℃)定容液和空白的OD值。

測(cè)試得到OD值經(jīng)計(jì)算后得到菌株Oil 2-3對(duì)石油降解率數(shù)值，具體參見表1，結(jié)果表明菌株Oil 2-3對(duì)石油降解非常好，石油降解率大于84.6％，石油降解率平均為88.7％。

表1菌株Oil 2-3對(duì)石油降解的情況

4、菌株Oil 2-3對(duì)pH的耐受性

用無菌接種環(huán)挑取純化后的菌株Oil 2-3菌落，接種至已滅菌的100mL種子液體培養(yǎng)基中，25℃、180rpm振蕩培養(yǎng)3天。上述菌株Oil 2-3培養(yǎng)液作為種子液待用。其中，種子液體培養(yǎng)基采用250mL三角瓶進(jìn)行承裝。種子液體培養(yǎng)基配方:氯化銨1.2g，磷酸氫二鉀0.2g，檸檬酸鐵0.2g，酵母粉0.2g，海水1L，pH7.6-8.0。

按照3％的接種量將菌株Oil 2-3種子液分別接種到pH值為4、5、6、7、8、9、10、11的100mLpH耐受測(cè)試液中，28℃、180rpm振蕩培養(yǎng)7天。

pH耐受測(cè)試液配方：氯化銨0.12g，磷酸氫二鉀0.02g，檸檬酸鐵0.02g，酵母粉0.02g，海水100mL。將上述組分溶解配制成溶液，利用0.01mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液，將溶液的pH值分別調(diào)整至不同pH值(pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11)。向不同pH值的溶液中加入已滅菌的石油0.5mL，pH耐受測(cè)試液配制完成。

圖3是pH耐受測(cè)試液接種石油降解菌Oil 2-3培養(yǎng)7天后的對(duì)比圖，參見圖3所示，培養(yǎng)7天后，pH值4-11的pH耐受測(cè)試液中，液體混濁，靜置后無明顯油層，因此，可以說明在pH值4-11酸度范圍菌種Oil 2-3均能生長(zhǎng)繁殖，且能夠降解石油。

本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案帶來的有益效果是：本發(fā)明從受石油污染的海水水樣中篩選到石油降解菌Oil 2-3菌株，并通過遺傳學(xué)分類鑒定，確定該菌株為耐堿海旋菌；通過對(duì)石油降解以及對(duì)其環(huán)境耐受性試驗(yàn)，結(jié)果表明，該菌株對(duì)石油降解率大于84.6％，該菌株的pH耐受范圍為pH值4-11，該菌株適合在海上溢油環(huán)境生存，可利用并降解海水中石油，實(shí)現(xiàn)海上溢油的微生物降解。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制，雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭露如上，然而并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容做出些許更動(dòng)或修飾為等同變化的等效實(shí)施例，但凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。