本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組弱毒腸炎沙門氏菌。

技術(shù)背景

傳染性法氏囊病(Infection bursal disease,IBD)是由雞傳染性法氏囊病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種高度接觸性傳染病。發(fā)病率高，病程短。該病主要侵害3-12周齡的雛雞與青年雞，破壞法氏囊的B淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致不同程度的免疫抑制，并可誘發(fā)多種疫病或使多種疫苗免疫失敗，從而使病雞增加對(duì)并發(fā)和繼發(fā)性病毒和細(xì)菌感染的易感性，是近幾年來(lái)嚴(yán)重威脅我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。

目前，在IBD的防制中，主要使用傳統(tǒng)活疫苗和滅活疫苗。傳統(tǒng)的滅活疫苗經(jīng)歷了一個(gè)由弱毒疫苗向強(qiáng)毒疫苗、由單一毒株疫苗向多毒株疫苗發(fā)展的過(guò)程。采用中毒力或強(qiáng)毒力毒株研制疫苗盡管可以提高雞體的IBD抗體滴度，但易損傷靶器官法氏囊組織導(dǎo)致免疫機(jī)能低下、免疫抑制，進(jìn)而對(duì)其它疫病的易感性增高或?qū)ζ渌呙绲拿庖邞?yīng)答能力降低，易繼發(fā)其它疫??；多毒株疫苗，從理論上忽略了Ⅰ型疫苗毒對(duì)同是Ⅰ型的超強(qiáng)毒及變異株的交叉保護(hù)作用，忽略了不同毒株同時(shí)在相同靶細(xì)胞中增殖時(shí)發(fā)生重組的可能性，忽略了由此產(chǎn)生的對(duì)生態(tài)安全的危害，疫苗的研發(fā)中應(yīng)該避開(kāi)這些誤區(qū)。滅活疫苗多由雞胚或細(xì)胞適應(yīng)毒制備，成本較高，制約了它的使用。因此發(fā)展廣譜、高效、實(shí)用的新型疫苗成為迫切需要。

在新型疫苗的研究使用中，發(fā)現(xiàn)直接應(yīng)用克隆表達(dá)的抗原蛋白作為疫苗的免疫保護(hù)效果還不理想。這是因?yàn)樾滦鸵呙缰械目扇苄钥乖庖咴暂^弱，無(wú)法激起有效地粘膜免疫。解決這一問(wèn)題最成功的策略是使用疫苗載體來(lái)運(yùn)送抗原到達(dá)粘膜表面，而在疫苗載體中，沙門氏菌憑借自身的優(yōu)勢(shì)獲得了廣泛的研究和應(yīng)用。但目前存在著缺少穩(wěn)定的沙門氏菌弱毒株，不能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，從而引起有效的免疫反應(yīng)等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種弱毒腸炎沙門氏菌，以及用該弱毒腸炎沙門氏菌作為宿主所構(gòu)建的重組腸炎沙門氏菌弱毒株，可用于制備疫苗。

本發(fā)明首先提供一種弱毒腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)rSD株，于2016年11月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)：CGMCC NO.13346。

本發(fā)明所提供的弱毒腸炎沙門氏菌用于制備重組疫苗株；

所述的重組疫苗株，是將外源的免疫抗原基因轉(zhuǎn)入到上述的弱毒腸炎沙門氏菌中制備的；

作為本發(fā)明實(shí)施例的優(yōu)選，所述的免疫抗原基因?yàn)镮BDV的VP2基因；

本發(fā)明另一個(gè)方面提供一種重組腸炎沙門氏菌活載體疫苗株，其基因組中包含IBDV的VP2基因。

上述的重組腸炎沙門氏菌活載體疫苗株命名為腸炎沙門氏菌(Salmonella Enteritidis)△VP2(salmonella)株，于2016年11月10日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所；保藏編號(hào)：CGMCC NO.13251。

本發(fā)明提供的重組沙門氏菌活載體疫苗菌株可用于制備疫苗。

本發(fā)明提供的弱毒腸炎沙門氏菌作為宿主所構(gòu)建的重組疫苗株遺傳穩(wěn)定性好，在普通培養(yǎng)基連續(xù)傳代20代，插入的外源基因沒(méi)有發(fā)生任何突變；重組菌不含任何抗性，這符合現(xiàn)代細(xì)菌活疫苗的發(fā)展趨勢(shì)，安全性好，不用考慮抗生素殘留。重組菌生長(zhǎng)繁殖性能良好，沒(méi)有因?yàn)橥庠椿虻牟迦攵绊懠?xì)菌的增殖。

附圖說(shuō)明

圖1野生菌株SD株、弱毒菌株rSD株與重組菌株△VP2(salmonella)的生長(zhǎng)曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明篩選獲得了腸炎沙門氏菌弱毒株，用該弱毒株來(lái)構(gòu)建弱毒沙門氏菌疫苗株，構(gòu)建的重組弱毒沙門氏菌疫苗株不僅毒力弱，安全性好，而且穩(wěn)定，表達(dá)效率高，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體可有效地提供免疫保護(hù)作用；從而促成了本發(fā)明。

實(shí)施例1、腸炎沙門氏菌弱毒株的篩選

申請(qǐng)人將從臨床分離的疑似沙門氏菌進(jìn)行生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和測(cè)序鑒定后，確定為腸炎沙門氏菌，命名為SD株。在經(jīng)過(guò)傳代篩選后獲得了腸炎沙門氏菌重組菌株rSD株。通過(guò)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定發(fā)現(xiàn)基因缺失后沒(méi)有影響細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，通過(guò)雛雞攻毒試驗(yàn)等確定其為弱毒株。將rSD株作為母本菌株進(jìn)行下一步的研究。

本發(fā)明的弱毒腸炎沙門氏菌rSD株，于2016年11月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)：CGMCC NO.13346。

實(shí)施例2、VP2基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒pkD3中Cat基因的序列和克隆載體pBluescript KS(+/-)的多克隆酶切位點(diǎn)，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)Cat基因的特異性引物：上游引物pKD3-II P1:CACGGATCCgtgtaggctggagctgcttc加入了BamH I酶切位點(diǎn)；下游引物pKD3-II P2:CAGGAATTCcatatgaatatcctccttag加入了EcoR I酶切位點(diǎn)。以質(zhì)粒pkD3為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用DNA純化回收試劑盒回收目的基因?；厥盏哪康幕蚱闻c載體pBluescript KS(+/-)一起進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，核酸電泳，用DNA純化回收試劑盒回收目的基因后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，測(cè)序鑒定，并命名為pBlu-pKD3。

PCR擴(kuò)增VP2基因，上游引物：VP2-P1：CAGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAACCC加入了EcoR I酶切位點(diǎn)，下游引物：VP2-P2：GACAAGCTTTTACCTTATGGCCCGGAT加入了HindⅢ酶切位點(diǎn)?；厥漳康幕颍c質(zhì)粒pBlu-pKD3一起進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，1％瓊脂糖凝膠電泳，用DNA純化回收試劑盒回收目的基因后，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接獲得重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109，測(cè)序鑒定，并命名為pBKV。

實(shí)施例3、打靶片段的制備

用于同源重組的引物由兩部分組成，5'端大寫的50nt的序列與靶基因兩翼序列同源，3'端小寫的20nt的序列與轉(zhuǎn)移載體cat抗性基因或目的基因兩側(cè)序列同源。上游引物：VP2-D1：AGTGGACTAACAACATCGGTGATGCCAACACCATCGGCACCCGTCCGGACgtgtaggctggagctgcttc；下游引物：VP2-D2：CAGAGCAAAAAACCCCGCGACGCGGGGTTTTTTATCAGACGGAAACTTAAttaccttatggcccggat。以重組質(zhì)粒pBKV為模板，PCR擴(kuò)增打靶片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收目的條帶，回收產(chǎn)物用Dpn I消化處理。1％瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的條帶，測(cè)定DNA濃度。

實(shí)施例4、感受態(tài)細(xì)胞的制備

將質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化至氯化鈣法制備的弱毒沙門氏菌感受態(tài)中，于氨芐青霉素平板上30℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于含氨芐的LB培養(yǎng)基30℃震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取400ul培養(yǎng)物接種10mL含Amp的LB培養(yǎng)基，220rpm振蕩培養(yǎng)至OD600＝0.6，冰浴10min，4℃、4000rpm離心10min收集細(xì)菌，沉淀用冰浴預(yù)冷的10％甘油洗3遍，用40uL預(yù)冷的10％甘油重懸，即為感受態(tài)細(xì)胞。

實(shí)施例5、電擊轉(zhuǎn)化及抗性基因的消除

取2uL打靶片段(約100ng)與40uL感受態(tài)細(xì)胞混合，轉(zhuǎn)入1mm的BioRad電極杯，冰浴2min，在2KV的參數(shù)下電擊5ms，立即加入1mL普通LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入15mL試管，120rpm 37℃振蕩培養(yǎng)3h，取200uL涂布于含氯霉素(Cm)的LB平板上37℃培養(yǎng)過(guò)夜，篩選Cm^R轉(zhuǎn)化子。挑取單克隆43℃培養(yǎng)，進(jìn)行Amp抗生素試驗(yàn)篩選輔助質(zhì)粒pKD46丟失株，獲得只有氯霉素抗性的突變株，命名為△V P2：Cat(salmonella)。

將質(zhì)粒pCP20電轉(zhuǎn)至△V P2：Cat(salmonella)，取200ul涂布于含Amp和Cm雙抗性的LB平板，30℃培養(yǎng)篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。挑取單個(gè)克隆43℃培養(yǎng)，篩選無(wú)抗性的重組菌，命名為△V P2(Salm onella)。

實(shí)施例6、生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

挑取野生菌株SD株、母本菌株rSD株及重組菌株的單個(gè)菌落分別接種于液體LB培養(yǎng)基，在37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將細(xì)菌懸液用10mL液體LB調(diào)節(jié)OD600＝0.1，37℃220rpm振蕩培養(yǎng)，每隔1h測(cè)定菌液的OD600，連續(xù)測(cè)定8h，繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

結(jié)果顯示，野生菌株、重組菌株與母本菌株的生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異，證明對(duì)野生菌株進(jìn)行基因改造、在減毒沙門氏菌基因組中插入VP2基因沒(méi)有影響細(xì)菌的生長(zhǎng)(圖1)。

實(shí)施例7、體外穩(wěn)定性試驗(yàn)

挑取弱毒菌rSD株和重組菌△V P2(salmonella)株的單個(gè)克隆分別接種于15mL試管，于37℃振蕩培養(yǎng)12h，將上述培養(yǎng)物再按1:1000的量接種于普通LB液體中培養(yǎng)12h，如此連續(xù)傳代20次。取400ul連續(xù)傳20代后的菌液，煮沸裂解法提取DNA。PCR分別擴(kuò)增rSD株基因缺失的部分，以及△V P2(salmonella)株基因插入和缺失的部位。1％瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，連接pMD 19-T載體，鑒定后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，兩株細(xì)菌中，缺失基因的部位沒(méi)有發(fā)生基因回復(fù)，插入目的基因的部位也沒(méi)有發(fā)生任何基因的突變、缺失等。表明構(gòu)建的兩株重組菌都是穩(wěn)定的。

實(shí)施例8、細(xì)菌的體外增殖試驗(yàn)

三株細(xì)菌(SD株，rSD株以及△V P2(salmonella)株)，分別挑取單個(gè)克隆接種于15mL試管，于37℃振蕩培養(yǎng)12h，分別將上述培養(yǎng)物再按1:1000的量接種于20mL普通LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。各取100uL菌液倍比稀釋至10^-8后，分別用10^-6、10^-7和10^-8三個(gè)稀釋度的菌液各取100uL涂板計(jì)數(shù)，測(cè)定細(xì)菌含量，每種菌株重復(fù)3次。結(jié)果顯示，過(guò)夜培養(yǎng)的三株細(xì)菌，每毫升含菌量沒(méi)有差異，均是約為8×10⁹CFU，這與生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果一致。

實(shí)施例9、野生菌SD株、弱毒菌rSD株及重組菌△V P2(salmonella)的攻毒試驗(yàn)

三株沙門氏菌在LB平板上37℃靜置培養(yǎng)12h，各挑取單個(gè)菌落接種于15mL試管，搖菌過(guò)夜，分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌液濃度。

1日齡SPF雞隨機(jī)分成3大組，三株菌的攻毒組各一個(gè)大組。每個(gè)大組再分為4個(gè)小組，其中3個(gè)小組為試驗(yàn)組攻毒，1個(gè)小組為對(duì)照組，每小組8只。攻毒組每只小雞各口服0.5mL菌液，分為10¹¹CFU、10¹⁰CFU和10⁹CFU三個(gè)梯度的劑量進(jìn)行攻毒。陰性對(duì)照組每只雞口服0.5mL的液體LB。連續(xù)觀察兩周。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，弱毒菌rSD株及重組菌△V P2(salmonella)試驗(yàn)組中，在兩周的觀察期內(nèi)，小雞沒(méi)有死亡，沒(méi)有出現(xiàn)拉稀、羽毛被亂、活動(dòng)異常等不良反應(yīng)，攻毒組與對(duì)照組小雞的狀態(tài)無(wú)差異；而野生菌SD株試驗(yàn)組中，接種10¹¹CFU、10¹⁰CFU和10⁹CFU劑量的小組各死亡7只、4只和3只小雞，剩余存活的小雞生長(zhǎng)發(fā)育不良，拉稀，消瘦等，而對(duì)照組沒(méi)有任何死亡或發(fā)病癥狀。這證明經(jīng)過(guò)改造的弱毒菌rSD株和重組菌△V P2(salmonella)株對(duì)SPF雞是安全的。

實(shí)施例10、重組腸炎沙門氏菌△V P2(salmonella)株的雛雞免疫試驗(yàn)

1日齡SPF雞隨機(jī)分為三組，兩組免疫組，一組陰性對(duì)照組，每組8只。過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)后，調(diào)整菌液濃度。免疫組中，第一組每只口服0.5mL(10⁹CFU)的重組菌△V P2(salmonella)株，第二組每只口服相同劑量的弱毒沙門氏菌rSD株，對(duì)照組口服相同劑量的LB。分別在免疫后一周、二周、三周和四周采血，分離血清。采用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定抗體，檢測(cè)抗原為原核表達(dá)的VP2蛋白。

結(jié)果顯示，重組菌△V P2(salmonella)株免疫組一周后即可產(chǎn)生抗體，二周后100％的小雞都能產(chǎn)生抗體，四周后抗體水平逐漸開(kāi)始下降；弱毒菌rSD株免疫組和LB免疫組均不能產(chǎn)生抗體。

表1：重組菌△V P2(salmonella)株免疫組抗體水平監(jiān)測(cè)

實(shí)施例11、免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)

免疫方法和劑量同實(shí)施例10，兩組免疫組和一組對(duì)照組均為8只。免疫3周后對(duì)雞滴鼻、點(diǎn)眼接種本室分離的強(qiáng)毒IBDV WF株(10⁵TCID50/0.2mL)。對(duì)照組、免疫組隔離飼養(yǎng)，每天觀察小雞的狀態(tài)，死亡雞只進(jìn)行解剖觀察。

結(jié)果顯示，LB和弱毒菌rSD株免疫組在攻毒第三天開(kāi)始發(fā)病，羽毛被亂，采食量減少，不愿走動(dòng)，排奶油狀稀便，LB組在第四天死亡2只，第五天死亡3只，第六天死亡2只；弱毒菌rSD株免疫組在第四天死亡2只，第五天死亡3只，第六天死亡1只。免疫重組菌△V P2(salmonella)株的雞只表現(xiàn)正常，沒(méi)有出現(xiàn)拉稀、死亡。解剖法氏囊發(fā)現(xiàn)，重組菌△V P2(salmonella)免疫組法氏囊沒(méi)有腫大、出血現(xiàn)象，而其它兩組雞只法氏囊均出現(xiàn)腫大、出血，有的出現(xiàn)紫葡萄樣病變。結(jié)果表明，△V P2(salmonella)可以對(duì)IBDV的侵染提供很好的保護(hù)作用。