本發(fā)明屬于功能性寡糖制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖制備方法。

背景技術(shù)：

唾液酸寡糖在生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。在糖蛋白分子中，唾液酸寡糖常常聚集在肽鏈的一個(gè)區(qū)段，對大分子構(gòu)象以及物理性質(zhì)都有明顯的影響。另外，唾液酸寡糖也是動(dòng)物細(xì)胞表面負(fù)電荷的主要來源，它的存在有利于細(xì)胞與帶正電的物質(zhì)的結(jié)合，參與調(diào)節(jié)滲透壓、細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程。唾液酸寡糖在醫(yī)療領(lǐng)域作為抗菌劑的開發(fā)潛力是非常大的。另外,唾液酸寡糖與腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)聯(lián)。人們越來越認(rèn)識(shí)到唾液酸寡糖在人體生命活動(dòng)中起到的重要作用，不斷有人開始從事唾液酸寡糖的研究與開發(fā)，因此，唾液酸化寡糖的合成以及相關(guān)的生物活性研究在化學(xué)和生物學(xué)界形成了一個(gè)熱點(diǎn)。

羥乙酰唾液酸是唾液酸中的一種，目前，羥乙酰唾液酸寡糖研究較少，在市場上主要用于治療神經(jīng)性疾病和老年癡呆癥，也可用作嬰兒食品配料和營養(yǎng)增補(bǔ)劑等。但是目前國內(nèi)的羥乙酰唾液酸寡糖主要依靠進(jìn)口，國內(nèi)還沒有出現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)廠家。由于起步較晚，沒有掌握生產(chǎn)羥乙酸唾液酸寡糖的核心技術(shù)，而且國內(nèi)生產(chǎn)的唾液酸在質(zhì)量和價(jià)格上也與進(jìn)口的產(chǎn)品有一定的差距。本發(fā)明以乳果糖為母體進(jìn)行α-2,3羥乙酰唾液酸糖苷化，得到的新型α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖是很有潛力的活性寡糖，對它們的功能性研究具有非常重要的科學(xué)和民生意義。正是根據(jù)市場的需求，經(jīng)過不斷實(shí)驗(yàn)和探索，我們發(fā)明了一種α-2,3唾液酸化乳果糖制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服了用化學(xué)方法對乳果糖進(jìn)行羥乙酰唾液酸糖基化比較困難的問題。這是因?yàn)橥僖核崽擒栈磻?yīng)條件較一般糖苷化反應(yīng)苛刻，立體選擇性通常較差，端基碳的立體構(gòu)型較難控制，唾液酸糖苷化反應(yīng)產(chǎn)率差，很難制備。利用最近發(fā)展的酶法對乳果糖進(jìn)行羥乙酰唾液酸糖基化修飾，利用高效的酶法合成制備技術(shù)，能夠成功的制備出一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

(1)N-羥乙酰甘露糖(ManNGc)的合成：N-乙酰-氨基-甘露糖(ManNAc)5g溶于20mL 2.5M HCl，混合物在60℃～70℃(油浴)反應(yīng)1～2小時(shí)，除去溶劑，殘留物真空干燥，得甘露糖胺鹽酸鹽(ManNH2-HCl)。稱2.16g甘露糖胺鹽酸鹽，加入50mL無水甲醇，固體K₂CO₃ 6.91g?；旌衔飻嚢?0min，然后逐滴加入2.73g(2.15mL)乙酰氧基乙酰氯(蓋蓋，接上針頭套氣球)，當(dāng)反應(yīng)完成后(TLC檢測，用乙酸乙酯:甲醇:水＝6:2:1的溶液作為展開劑)，將反應(yīng)完成的溶液置于離心機(jī)中以3000rpm離心30min，將離心后的上層液放在40℃的恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無水滴滴下，加入適量硅膠粉吸附，再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)；將反應(yīng)混合物濃縮并采用硅膠柱純化(二氯甲烷:甲醇＝10:1)，得到N-乙酰-羥乙酰甘露糖(ManNGcAc，產(chǎn)率80％左右)。然后稱取N-乙酰-羥乙酰甘露糖1g，丙酮酸鈉1.5g，甲醇20ml，甲醇鈉(100～200mg，使反應(yīng)體系pH為9)反應(yīng)過夜，加酸性離子樹脂中和，過濾，濃縮，硅膠柱層析梯度洗脫純化，梯度洗脫液采用乙酸乙酯:甲醇:水＝5:2:1和乙酸乙酯:甲醇:水＝4:2:1。再通過TLC檢測，收集N-羥乙酰甘露糖部分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮、冷凍干燥，作為制備一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖的原料。

(2)一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖的制備方法，其特征在于：N-羥乙酰甘露糖(即ManNGc)60～150重量份，丙酮酸鈉120～200重量份，乳果糖60～100重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)150～250重量份，溶于4000～8000重量份超純水中，用4摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入500～1000重量份1摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl；加入50～100重量份2摩爾/升的MgCl₂；加入1～1.5重量份醛縮酶(Pm-aldolase)，2.6～3.5重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS)；3～4重量份的α-2,3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmST₁)。然后將混合物 放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)10～18小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測反應(yīng)程度，TLC展開溶劑采用正丙醇︰甲醇︰水＝5︰2︰1。待反應(yīng)液展開不再顯示乳果糖斑點(diǎn)，即乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過生物膠(Bio-gel P-2)層析柱純化。通過TLC檢測，收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。采用質(zhì)譜和核磁共振鑒定純品的分子量以及結(jié)構(gòu)，通過質(zhì)譜鑒定分子量(見附圖1)，附圖1中橫坐標(biāo)(m/z)是質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)(relative abundance)是相對豐度，能夠鑒定出本發(fā)明制備出的純品分子量為648.30，與一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖分子量648相同，說明本發(fā)明制備出的純品是一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖；通過核磁共振鑒定分子結(jié)構(gòu)(見附圖2和附圖3)，附圖2和附圖3中橫坐標(biāo)f1(ppm)是化學(xué)位移，縱坐標(biāo)是吸收峰的強(qiáng)度，附圖2分析結(jié)果是¹H-NMR譜(600MHz,D2O)δ4.55(d,J＝7.8Hz,0.7H),4.45(d,J＝7.8Hz,0.3H),4.20–3.43(m,23H),2.67(dd,J＝12.0and 4.8Hz,1H),1.71(t,J＝12.0Hz,1H)¹³C NMR(151MHz,D₂O)；附圖3分析結(jié)果是13C-NMR譜(150MHz,D2O)δ175.73,173.83,100.32,99.77,98.02,77.24,75.61,75.12,72.53,71.81,69.19,68.05,67.96,67.48,66.55,66.03,63.87,62.91,62.48,61.09,60.94,60.47,51.35,39.71，能夠鑒定出本發(fā)明制備出的純品分子結(jié)構(gòu)為一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖，說明本發(fā)明的一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖制備成功。一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖的結(jié)構(gòu)見附圖4。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖質(zhì)譜圖。

圖2為本發(fā)明的一種一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖核磁共振¹H譜圖。

圖3為本發(fā)明的一種一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖核磁共振¹³C譜圖。

圖4一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖的結(jié)構(gòu)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

N-羥乙酰甘露糖(即ManNGc)60重量份，丙酮酸鈉120重量份，乳果糖60重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)150重量份，溶于4000重量份超純水中，用4摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入500重量份1摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl；加入50重量份2摩爾/升的MgCl₂；加入1重量份醛縮酶(Pm-aldolase)，2.6重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS)；3重量份的α-2,3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmST₁)。然后將混合物放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)10～18小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測反應(yīng)程度，TLC展開溶劑采用正丙醇︰甲醇︰水＝5︰2︰1。待反應(yīng)液展開不再顯示乳果糖斑點(diǎn)，即乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過生物膠(Bio-gel P-2)層析柱純化。通過TLC檢測，收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。最后得到的一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例2

N-羥乙酰甘露糖(即ManNGc)150重量份，丙酮酸鈉200重量份，乳果糖100重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)250重量份，溶于8000重量份超純水中，用4摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入1000重量份1摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl；加入100重量份2摩爾/升的MgCl₂；加入1.5重量份醛縮酶(Pm-aldolase)，3.5重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS)；4重量份的α-2,3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmST₁)。然后將混合物放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)10～18小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測反應(yīng)程度，TLC展開溶劑采用正丙醇︰甲醇︰水＝5︰2︰1。待反應(yīng)液展開不再顯示乳果糖斑點(diǎn)，即乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過生物膠(Bio-gel P-2)層析柱純化。通過TLC檢測，收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。最后得到的一種α-2,3羥乙酰唾液酸乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例3

N-羥乙酰甘露糖(即ManNGc)100重量份，丙酮酸鈉150重量份，乳果糖75重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)185重量份，溶于6000重量份超純水中，用4摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入800重量份1摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl；加入80重量份2摩爾/升的MgCl₂；加入1.2重量份醛縮酶(Pm-aldolase)，3重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS)；3.4重量份的α-2,3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmST₁)。然后將混合物放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)10～18小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測反應(yīng)程度，TLC展開溶劑采用正丙醇︰甲醇︰水＝5︰2︰1。待反應(yīng)液展開不再顯示乳果糖斑點(diǎn)，即乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過生物膠(Bio-gel P-2)層析柱純化。通過TLC檢測，收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。最后得到的一種α-2,3羥乙酰唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。

實(shí)施例4

N-羥乙酰甘露糖(即ManNGc)115重量份，丙酮酸鈉180重量份，乳果糖90重量份，三磷酸胞苷鈉(CTP)230重量份，溶于7000重量份超純水中，用4摩爾/升的NaOH調(diào)pH8.5，加入900重量份1摩爾/升的pH8.5的Tris-HCl；加入90重量份2摩爾/升的MgCl₂；加入1.35重量份醛縮酶(Pm-aldolase)，3.2重量份的CMP-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(NmCSS)；3.7重量份的α-2,3唾液酸苷轉(zhuǎn)移酶(PmST₁)。然后將混合物放入37℃氣浴振蕩器中，反應(yīng)10～18小時(shí)。采用硅膠薄層層析(TLC)檢測反應(yīng)程度，TLC展開溶劑采用正丙醇︰甲醇︰水＝5︰2︰1。待反應(yīng)液展開不再顯示乳果糖斑點(diǎn)，即乳果糖反應(yīng)完全后，往反應(yīng)液中加等體積95％乙醇，混合均勻，放入4℃冰箱中靜置30min，然后在7000轉(zhuǎn)/分下離心30min，上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。濃縮液過生物膠(Bio-gel P-2)層析柱純化。通過TLC檢測，收集純化后的溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，并冷凍干燥即為純品。最后得到的一種α-2,3羥乙酰唾液酸化乳果糖純品采用質(zhì)譜和核磁鑒定結(jié)構(gòu)。