專利名稱：除草劑抗性的蕓苔屬植物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及除草劑抗性的蕓苔屬(Brassica)植物和編碼野生型及咪唑啉酮抗性 的蕓苔屬的乙酰羥酸合成酶大亞基蛋白的新型多核苷酸序列、這些植物的種子及這些植物 的使用方法。
背景技術(shù)：
乙酰羥酸合成酶(AHAS ;EC 4. 1. 3. 18，也稱為乙酰乳酸合成酶或ALS)，是第一個 催化支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成的酶(Singh(1999) " Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine 〃 ， Plant Amino Acid， Singh， B. K. ， ed.， Marcel Dekker Inc. New York, New York, pp. 227-247) 。 AHAS是五個結(jié)構(gòu)各異的 除草劑家族的作用位點(diǎn)，所述除草劑家族包括磺酰脲(Tan等人(2005) Pest Manag. Sci.61 :246-57 ;Mallory-Smith禾口 Retzinger(2003)Weed Technology 17 :620-626 ; LaRossa和Falco(1984)TrendsBiotechno1. 2 :158-161)、咪唑啉酮(Shaner等人(1984) Plant Physiol. 76 :545-546)、 三唑嘧 啶 (triazolopyrimidines) (Subr咖anian禾口 Gerwick(1989)〃 Inhibition of acetolactate synthase by triazolopyrimidines， 〃 Biocatalysis inAgricultural Biotechnology, Whitaker， J. R.禾口 So皿et， P. E. . eds.， ACSSymposium Series, American Chemical Society, Washington, D. C. ， pp.277-288)， Tan等人(2005)Pest Manag. Sci. 61 :246—57 ;Mallory-Smith禾P Retzinger(2003)Weed Technology 17 :620-626，磺?；被驶蜻?Tan等人(2005) Pest Manag. Sci. 61 : 246-57 ;Mallory-Smith禾口 Retzinger(2003)Weed Technology 17:620—626)。 由于在 非常低的使用率時的有效性和在動物中相對沒有毒性，咪唑啉酮和磺酰脲除草劑在現(xiàn)代 農(nóng)業(yè)中被廣泛應(yīng)用。通過抑制AHAS活性，這些家族的除草劑防止易感植物包括很多雜
草品種的進(jìn)一步生長和發(fā)育。商售的咪唑啉酮除草劑的幾個例子為pursuit (咪
草煙(imazeth即yr))、 scepter (滅草喹(imaz叫uin))和arsenal (滅草煙 (imaz即yr))。磺酰脲除草劑的例子為氯磺隆(chlorsulfuron)、甲磺隆(metsulfuron methyl)、甲嘧磺隆(sulfometuron methyl)、氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)、噻吩磺 隆(thifensulfuron methyl)、苯橫隆(tribe皿ronmethyl)、節(jié)嘧橫隆(bensulfuron methyl)、煙嘧磺隆(nicosulfuron)、胺苯磺隆(ethametsulfuron methyl)、砜嘧磺隆 (rimsulfuron)、氟胺磺隆(triflusulfuron methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟嘧 磺隆(primisulfuronmethyl)、醚磺隆(cinosulfuron)、酉先嘧磺隆(咖idosulf iuon)、 fluzasulfuron、咪唑磺隆(imazosulfuron)、妣嘧磺隆(pyrazosulfuron ethyl)和氯妣嘧 磺隆(halosulfuron)。
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由于其高效性和低毒性，人們喜歡將咪唑啉酮除草劑噴灑到很大面積的植物的頂 部。能夠在很大范圍的植物頂部噴灑除草劑的能力降低了與建立和保持耕地相關(guān)的成本， 并減少了在使用這類化學(xué)物質(zhì)之前的原地制備需求。在所需的耐藥性品種頂部噴灑，還可 由于沒有了競爭性品種而得到所需品種的潛在的最大化產(chǎn)率。但是，是否能夠使用這樣的 頂部噴灑技術(shù)取決于在所噴灑區(qū)域內(nèi)所需植物中咪唑啉酮抗性品種的存在。
在主要的農(nóng)業(yè)作物中，一些豆科品種例如大豆，由于其快速代謝除草劑化合物 的能力而對咪唑啉酮呈天然抗性(Shaner和Robinson(1985)Weed Sci. 33 :469-471)。 其它作物例如玉米對于咪唑啉酮除草劑有 一 些易感性(Newhouse等人(1992) Plant Physiol. 100 :882886)。對于咪唑啉酮除草劑的不同敏感性取決于特定除草劑的化學(xué)本 性和在每個植物中化合物從毒性到非毒性形式的不同代謝(Shaner等人(1984)Plant Physiol. 76 :545-546 ;Brown等人，(1987)Pestic. Biochem. Physiol. 27 :24-29)。其它的 植物生理區(qū)別例如吸收性和遷移性也在敏感性中起重要作用(Shaner和Robinson(1985) Weed Sci. 33 :469-471)。 已經(jīng)使用種子、小孢子、花粉和愈傷組織誘變在玉米(Zea mays)、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica napus)(艮卩卡諾拉(Canola))、大豆(Glycine max)、煙草(Nicotiana tabacum)和水稻(0ryza sativa)中成功產(chǎn)生了對咪唑啉酮、磺酰 脲和三唑嘧啶呈抗性的植物(Sebastian等人(1989)Crop Sci. 29 :1403-1408 ;Swanson等 人，1989 Theor. Appl. Genet. 78 :525-530 ;Newhouse等人(1991) Theor. Appl. Genet. 83 : 65-70 ;Sathasivan等人(1991)Plant Physiol. 97 :1044-1050 ;Mourand等人(1993) J. Heredity84 :91_96 ;美國專利號5， 545， 822)。在所有的情況下，單一的、部分顯性核基因 賦予抗性。已經(jīng)在小麥(Triticum aestivum L. cv. Fidel)種子誘變后成功地分離出四個咪 唑啉酮抗性小麥植物(Newhouse等人(1992) PlantPhysiol. 100 :882-886)。遺傳研究確定 單一的部分顯性基因賦予抗性?；诘任换蜓芯浚瑤孜蛔髡叩贸鼋Y(jié)論已鑒定的四個株系 中的突變位于相同的基因座。其中一個Fidel栽培變種抗性基因被命名為FS-4(Newhouse 等人(1992) Plant Physiol. 100 :882-886)。 對AHAS抑制劑復(fù)合物的三維構(gòu)象基于電腦的模擬預(yù)測了在提議的抑制劑結(jié)合口 袋中的幾個氨基酸是誘導(dǎo)的突變可能賦予咪唑啉酮選擇性抗性的位點(diǎn)(Ott等人(1996) J. Mol. Biol. 263 :359-368)。在提議的AHAS酶結(jié)合位點(diǎn)中帶有一些此類理論設(shè)計(jì)突變 的小麥植物實(shí)際上已表現(xiàn)出對單一類別的除草劑的特異性抗性(Ott等人(1996)J.Mol. Biol. 263 :359-368)。 已經(jīng)在一些植物中報(bào)道了咪唑啉酮除草劑抗性植物。美國專利號4，761，373， 5， 331， 107，5， 304， 732，6， 211， 438，6， 211， 439和6， 222， 100大體上描述了改變的AHAS基 因在植物中引起除草劑抗性的用途，特別揭示了一些咪唑啉酮抗性玉米系。美國專利號 5， 013， 659揭示了由于在一個或多個保守區(qū)域中至少一個氨基酸的突變而對除草劑表現(xiàn)出 抗性的植物。其中所描述的突變編碼咪唑啉酮和磺酰脲的交叉抗性或磺酰脲的特異性抗 性，但是沒有描述咪唑啉酮的特異性抗性。美國專利號5， 731， 180和美國專利號5， 767， 361 討論了分離的基因，其在野生型單子葉植物的AHAS氨基酸序列中具有一個氨基酸的替換 從而引起對咪唑啉酮的特異性抗性。此外，已經(jīng)通過突變育種以及通過從另一個培養(yǎng)物產(chǎn) 生的水稻植物庫選擇除草劑抗性植物而發(fā)展了對干擾AHAS的除草劑呈抗性的水稻植物。參見美國專利號5， 545， 822， 5， 736， 629， 5， 773， 703， 5， 773， 704， 5， 952， 553和6， 274， 796。
如同在其它所有已經(jīng)檢測過的生物中一樣，在植物中，AHAS酶由兩個亞基組成大亞基(催化作用)和小亞基(調(diào)節(jié)作用)(Duggleby和Pang (2000) J. Biochem. Mol.Biol. 33 :1-36)。 AHAS大亞基(此后也稱作AHASL)在擬南芥和水稻中可由單獨(dú)基因編碼，或者在玉米、卡諾拉和棉花中可由多個基因家族成員所編碼。大亞基中特定的單一核苷酸取代會賦予該酶對于一種或多種類別的除草劑的不敏感性(Chang和Duggleby (1998)Biochem J. 333 :765-777)。 例如，普通小麥即小麥(Triticum aesti權(quán)L.)，含有三個同源乙酰羥酸合成酶大亞基基因。基于在這三個基因中的每一個的突變體的除草劑反應(yīng)和生物化學(xué)數(shù)據(jù)，每個基因均表現(xiàn)出顯著性表達(dá)(Ascenzi等人(2003)InternationalSociety of PlantMolecular Biologists Congress, Barcelona, Spain, Ref. No. S10-17)。所有這三個基因的編碼序列均在核苷酸水平具有高度同源性(W003/014357)。通過對小麥的幾個品種中AHASL基因進(jìn)行測序得知，在大多數(shù)IMI耐藥性(咪唑啉酮耐藥性)品系中，除草劑耐藥性的分子基礎(chǔ)為Ser653(At)Asn突變，這表明在對應(yīng)于擬南芥中653位氨基酸的位置發(fā)生了天冬酰胺取代絲氨酸的替代。這個突變是由于編碼AHASL蛋白的DNA序列中的單核苷多態(tài)現(xiàn)象(SNP)。 在雙子葉植物物種中也已知多種AHASL基因。最近，Kolkman等人((2004)Theor.Appl. Genet. 109 :1147-1159)報(bào)道了來自向日葵的除草劑抗性和野生型基因型的三個AHASL基因(AHASL1，AHASL2和AHASL3)的鑒定、克隆和測序。Kolkman等人報(bào)道除草劑抗性是由于在AHASLl蛋白中的Prol97Leu取代(使用擬南芥AHASL氨基酸位置命名法)或者是由于Ala205Val替換，并且這些替換中每個均提供對于咪唑啉酮和磺酰脲除草劑的雙抗性。 鑒于其高度有效性和低毒性，農(nóng)業(yè)上喜歡使用咪唑啉酮除草劑。但是，能否在特定的作物生產(chǎn)系統(tǒng)中使用咪唑啉酮除草劑取決于目的植物作物中咪唑啉酮抗性品種的可獲得性。為了使農(nóng)民在使用咪唑啉酮和磺酰脲除草劑的種類和比率上具有更高的機(jī)動性，通常需要較強(qiáng)的除草劑耐藥性。同時，發(fā)展除草劑耐藥性品種的植物育種者希望通過突變提供更高的除草劑耐藥性，使其在用于發(fā)展其品種的種質(zhì)背景中具有更高的機(jī)動性。為了產(chǎn)生這樣的咪唑啉酮抗性品種，植物育種者需要發(fā)展其它的育種品系，優(yōu)選為具有更高的咪唑啉酮抗性。因此，需要其它的咪唑啉酮抗性育種品系和植物作物品種，以及生產(chǎn)和使用咪唑啉酮抗性育種品系和品種的方法和組合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了與野生型蕓苔屬植物相比具有增加的除草劑抗性的蕓苔屬植物。特別地，本發(fā)明所述蕓苔屬植物與野生型蕓苔屬植物相比，對至少一種干擾AHAS酶活性的除草劑具有增加的抗性。蕓苔屬植物在其基因組中包含至少一個拷貝的乙酰羥酸合成酶大亞基(AHASL)多核苷酸，其編碼除草劑抗性AHASL多肽，其中該AHASL多肽選自a)在對應(yīng)于SEQ IDN0 :1的653位、SEQ ID NO :2的638位或SEQ ID NO :3的635位上是天冬酰胺的多肽；b)在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的122位、SEQ ID NO :4的107位或SEQ ID NO :5的104位上是蘇氨酸的多肽；c)在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的574位或SEQ ID NO :6的557位上是亮氨
10酸的多肽。 本發(fā)明還提供了增強(qiáng)的除草劑耐藥性，這通過在芥菜(B. jimcea)植物中的不同基因組上組合AHAS突變來實(shí)現(xiàn)。在一個實(shí)施例中，bR(AHASl)突變(位于芥菜的B基因組上)與基因滲入PM2(AHAS3)突變(位于基因滲入到芥菜中的油菜的B基因組上)組合。所得到的除草劑耐藥性顯著增強(qiáng)，具有令人驚奇的協(xié)同效應(yīng)，比在現(xiàn)在商售的組合了 PM1和PM2的產(chǎn)品中觀察到的高。在另一個實(shí)施例中提供了組合了 aR(AHASl)突變(位于芥菜的A基因組上)和A107T突變(位于芥菜的B基因組上)的芥菜植物，其相對于組合了PM1和PM2突變的植物來說，也具有協(xié)同水平的除草劑耐藥性。 在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了除草劑抗性的雙突變蕓苔屬植物，其來自稱為J05Z-07801的蕓苔屬品系。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了除草劑抗性的蕓苔屬植物，其來自稱為J04E-0139的蕓苔屬品系。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了除草劑抗性的蕓苔屬植物，其來自稱為J04E-0130的蕓苔屬品系。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了除草劑抗性的蕓苔屬植物，其來自稱為J04E-0122的蕓苔屬品系。 本發(fā)明所述的除草劑抗性蕓苔屬植物可含有一個、兩個、三個、四個或多個拷貝的編碼本發(fā)明所述的除草劑抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸。本發(fā)明所述的除草劑抗性蕓苔屬植物可含有編碼除草劑抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸，所述AHASL蛋白含有單一的、兩個或更多個突變。本發(fā)明所述蕓苔屬植物還包括種子和子代植物，其包含至少一個拷貝的編碼本發(fā)明所述的除草劑抗性AHASL蛋白的基因或多核苷酸。所產(chǎn)生的種子或子代植物(其包含一個編碼含有單一的、兩個或更多個突變的AHASL多肽的多核苷酸；或者包含兩個或更多個編碼AHASL單一突變多肽的多核苷酸)，相對于單一植物之中的AHASL單一突變多肽所預(yù)測的來說，表現(xiàn)出對于AHAS-抑制性除草劑的出乎意料的高水平耐藥性，所述AHAS-抑制性除草劑例如咪唑啉酮除草劑或磺酰脲除草劑。其植物和子代表現(xiàn)出除草劑耐藥性的協(xié)同效應(yīng)而不是加成效應(yīng)，其中包含多個突變的植物和子代中除草劑耐藥性的水平比包含AHASL單一突變蛋白的植物高。 本發(fā)明提供了在本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的除草劑抗性植物附近控制雜草
的方法。這樣的植物包括例如以上所描述的除草劑抗性蕓苔屬植物和用編碼本發(fā)明所述除
草劑抗性AHASL蛋白的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化的植物。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物在其基因組中包含至少一
個表達(dá)框，該表達(dá)框包含在植物細(xì)胞中驅(qū)動基因表達(dá)的啟動子，其中該啟動子與本發(fā)明所
述AHASL多核苷酸可操作地連接。所述方法包括將有效量的除草劑施用于雜草和除草劑
抗性植物，其中除草劑抗性植物與野生型或未轉(zhuǎn)化的植物相比，對于至少一種除草劑特別
是咪唑啉酮或磺酰脲除草劑具有增加的抗性。本發(fā)明提供了在植物中增加AHAS活性的方
法，以產(chǎn)生除草劑抗性植物，以及在除草劑耐藥性植物中增加除草劑耐藥性。在本發(fā)明的一
些實(shí)施方式中，方法包括使用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多核苷酸構(gòu)建體包含與
啟動子可操作地連接的核苷酸序列，所述啟動子驅(qū)動(所述核苷酸序列)在植物細(xì)胞中的
表達(dá)；并從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中再生出轉(zhuǎn)化的植物。核苷酸序列選自那些編碼本發(fā)明所述
除草劑抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。在其它實(shí)施方式中，方法包括常規(guī)的植物育種方法，
其包括將本發(fā)明所述除草劑抗性植物與另一種植物雜交授粉，還可包括選擇子代植物，所
述子代植物包含親代植物即本發(fā)明所述除草劑抗性植物的除草劑抗性特性。 本發(fā)明進(jìn)一步提供了蕓苔屬AHASL蛋白的分離的多核苷酸分子和分離的多肽。本發(fā)明所述多核苷酸分子包含編碼本發(fā)明所述除草劑抗性AHASL蛋白的核苷酸序列。本發(fā)明所述除草劑抗性AHASL蛋白包含由選自下列的核苷酸序列編碼的多肽a)如SEQ ID NO :13所示的核苷酸序列；b)如SEQID NO :14所示的核苷酸序列；c)如SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列；d)與如SEQ ID NO :13所示的核苷酸序列有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中該蛋白在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的653位、或SEQ ID NO :2的638位或SEQ ID NO :3的635位上是天冬酰胺；e)與如SEQ ID NO :14所示的核苷酸序列有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中該蛋白在對應(yīng)于SEQID NO :1的122位、或SEQ ID NO :4的107位或SEQID NO :5的104位上是蘇氨酸；f)與如SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列有至少90%序列同一性的核苷酸序列，其中該蛋白在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的122位、或SEQ ID NO :4的107位或SEQ ID NO:5的104位上是蘇氨酸。上述AHASL蛋白進(jìn)一步包含至少一個選自下列的突變a)在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的653位、或SEQID NO :2的638位或SEQ ID NO :3的635位上的天冬酰胺；b)在對應(yīng)于SEQID NO :1的122位、SEQ ID NO :4的107位或SEQ ID NO :5的104位上的蘇氨酸；c)在對應(yīng)于SEQ ID NO :1的574位或SEQ ID NO :6的557位上的亮氨酸。 本發(fā)明還提供了包含一個或多個本發(fā)明所述多核苷酸分子的表達(dá)框、轉(zhuǎn)化載體、經(jīng)轉(zhuǎn)化的非人宿主細(xì)胞和經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物、植物部分和種子。


圖1顯示了以下基因的編碼區(qū)域的核苷酸序列的比對來自擬南芥的野生型AHASL基因(AtAHASL， SEQ ID NO : 11)、來自J04E-0044品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlB-S653N基因(J04E-0044， SEQ ID NO : 12)、來自J04E-0139品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlA-S653N基因(J04E-0139， SEQ ID NO :13)、來自J04E-0130品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlB-A122T基因(J04E-0130， SEQ ID NO : 14)、來自J04E-0122品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlA-A122T基因(BjAHASLlA， SEQ IDNO : 15)、來自PM2品系的油菜的除草劑抗性BnAHASLlA-W574L基因(BnAHASLlA， SEQ ID NO :16)、芥菜的野生型BjAHASLlA基因(BjAHASLlA， SEQ ID NO :17)、芥菜的野生型BjAHASLlB基因(BjAHASLlB， SEQ ID NO:18)、油菜的野生型BnAHASLlA基因(BnAHASLlA， SEQ ID NO :19)、油菜的野生型BnAHASLIC基因(BnAHASLIC, SEQ ID NO :20)。使用Fast Algorithm(間隙開口 15，間隙延伸6. 66，間隙分離8，矩陣(matrix)為swgapdnamt)在Vector NTI軟件包中進(jìn)行分析。
圖2顯示了以下基因的氨基酸序列的比對來自擬南芥的野生型AHASL基因(AtAHASL， SEQ ID NO : 1)、來自J04E-0044品系的芥菜的除草劑抗性BJAHASL1B-S653N基因(J04E-0044， SEQ ID NO :2)、來自J04E-0139品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlA-S653N基因(J04E-0139， SEQ IDN0:3)、來自J04E-0130品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlB-A122T基因(J04E-0130， SEQ ID N0:4)、來自J04E-0122品系的芥菜的除草劑抗性BjAHASLlA-A122T基因(BjAHASLlA， SEQ ID NO :5)、來自PM2品系的油菜的除草劑抗性BnAHASLlA-W574L基因(BnAHASLlA， SEQ ID NO :6)、芥菜的野生型BjAHASLlA基因(BjAHASLlA， SEQ ID NO :7)、芥菜的野生型BjAHASLlB基因(BjAHASLlB， SEQ ID NO :8)、油菜的野生型BnAHASLlA基因(BnAHASLlA， SEQ ID NO :9)、油菜的野生型BnAHASLIC基因(BnAHASLIC, SEQ ID NO :10)。使用Fast Algorithm(間隙開口罰分=10，間隙延伸罰分=0. 05，間隙分離罰分=8， blosum 62MT2矩陣)在Vector NTI軟件包中進(jìn)行分析。 圖3為顯示芥菜植物品系的AHAS酶活性分析的柱形圖。 圖4為顯示芥菜植物品系的溫室噴灑結(jié)果的圖。 圖5是顯示對應(yīng)的DNA或蛋白質(zhì)序列的SEQ ID編號的表格。 圖6提供了在100 M甲氧咪草煙(Imazamox)存在下，從純合芥菜品系中分離的
蛋白提取物中的AHAS酶活性，所述純合芥菜品系含有aR、bR、A107T和A104T芥菜突變的組
合，這些突變彼此堆積(stack)并與在芥菜中基因滲入的(introgressed)PM2突變堆積。 圖7提供了在溫室中噴灑35g ai/ha的甲氧咪草煙之后兩周，芥菜F2品系的平
均植物損傷(植物毒性)，所述芥菜F2品系含有不同的接合性(zygosity)和aR與A107T
AHAS突變的組合。 圖8提供了噴灑35g ai/ha等量的甲氧咪草煙(Raptor(D)之后兩周純合芥菜DH品系的平均植物毒性，所述純合芥菜DH品系含有aR、 bR、 A107T和A104T芥菜突變的組合，這些突變彼此堆積并與在芥菜中基因滲入的PM2突變堆積。
發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及與野生型蕓苔屬植物相比具有增加的除草劑抗性的蕓苔屬植物。按照下文詳細(xì)描述產(chǎn)生除草劑抗性的蕓苔屬植物將分離的、野生型(針對除草劑抗性而言)蕓苔屬小孢子暴露于誘變物質(zhì)，在有效量咪唑啉酮除草劑存在的情況下培養(yǎng)所述小孢子，并選擇存活下來的胚芽(embryos)。從存活下來的胚芽中產(chǎn)生單倍體蕓苔屬植物，然后進(jìn)行染色體加倍化以產(chǎn)生可繁殖的雙單倍體蕓苔屬植物，其與野生型蕓苔屬植物相比對咪唑啉酮除草劑表現(xiàn)出增加的抗性。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了按照如下詳細(xì)描述的小孢子誘變所產(chǎn)生的除草劑抗性蕓苔屬品系，將其稱為J04E-0139。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從小孢子誘變所產(chǎn)生的除草劑抗性蕓苔屬品系，將其稱為J04E-0130。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從小孢子誘變所產(chǎn)生的除草劑抗性蕓苔屬品系，將其稱為J04E-0122。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了從芥菜bR突變品系(U. S. 2005/0283858)與PM2突變品系(參見US2004/0142353和US2004/0171027 ;還參見Hattori等人，Mol. Gen. Genet. 246 :419-425， 1995)雜交產(chǎn)生的除草劑抗性蕓苔屬品系，將其稱為J05Z-07801，所述PM2突變品系最初是從油菜中基因滲入芥菜中。
因此，本發(fā)明提供了對抑制AHAS的除草劑具有抗性的芥菜植物。提供了在至少一個AHASL多核苷酸中具有單一突變的芥菜品系，其中單一突變選自在對應(yīng)于擬南芥AHASLl序列的653位置上從G到A的轉(zhuǎn)變和在對應(yīng)于擬南芥AHASLl序列的122氨基酸位置上從G到A的轉(zhuǎn)變。 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，從J04E-0139除草劑抗性芥菜植物和野生型芥菜植物兩者中都分離了乙酰羥酸合成酶大亞基基因(稱作AHASLl)的編碼區(qū)域，并進(jìn)行了測序。通過比較除草劑抗性和野生型蕓苔屬植物的多核苷酸序列發(fā)現(xiàn)來自除草劑抗性蕓苔屬植物的AHASL1多核苷酸序列的編碼區(qū)位于芥菜的A基因組上，其與野生型植物的AHASL1多核苷酸序列有一個核苷酸的差別，即G轉(zhuǎn)變?yōu)锳(圖1)。 AHASLl多核苷酸序列中的這個G到A的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致相對于野生型AHASLl蛋白的氨基酸序列來說，在AHASLl蛋白的預(yù)測氨基酸序列的保守區(qū)域內(nèi)，在635位氨基酸(對應(yīng)于擬南芥AHASLl的653位氨基酸)上，發(fā)生了新型的從Ser到Asn的替換(圖2)。
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通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，從J04E-0130除草劑抗性芥菜植物和野生型芥菜植物兩者中都分離了乙酰羥酸合成酶大亞基基因(稱作AHASL1)的編碼區(qū)域，并進(jìn)行了測序。通過比較除草劑抗性和野生型蕓苔屬植物的多核苷酸序列發(fā)現(xiàn)來自除草劑抗性蕓苔屬植物品系J04E-130的AHASL1多核苷酸序列的編碼區(qū)位于芥菜的B基因組上，其與野生型植物的AHASL1多核苷酸序列有一個核苷酸的差別，即G轉(zhuǎn)變?yōu)锳(圖1) 。AHASL1多核苷酸序列中的這個G到A的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致相對于野生型AHASL1蛋白的氨基酸序列來說，在AHASL1蛋白的預(yù)測氨基酸序列的保守區(qū)域內(nèi)，在107位氨基酸(對應(yīng)于擬南芥AHASL1的122位氨基酸)上，發(fā)生了新型的從Ala到Thr的替換(圖2)。 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，從J04E-0122除草劑抗性芥菜植物和野生型芥菜植物兩者中都分離了乙酰羥酸合成酶大亞基基因(稱作AHASL1)的編碼區(qū)域，并進(jìn)行了測序。通過比較除草劑抗性和野生型蕓苔屬植物的多核苷酸序列發(fā)現(xiàn)來自除草劑抗性蕓苔屬植物品系J04E-122的AHASL1多核苷酸序列的編碼區(qū)位于芥菜的A基因組上，其與野生型植物的AHASL1多核苷酸序列有一個核苷酸的差別，即G轉(zhuǎn)變?yōu)锳(圖1) 。AHASL1多核苷酸序列中的這個G到A的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致相對于野生型AHASL1蛋白的氨基酸序列來說，在AHASL1蛋白的預(yù)測氨基酸序列的保守區(qū)域內(nèi)，在104位氨基酸(對應(yīng)于擬南芥AHASL1的122位氨基酸)上，發(fā)生了新型的從Ala到Thr的替換(圖2)。 本公開還提供了含有至少兩個突變的AHASL多核苷酸的芥菜植物。這樣的植物本文還稱作含有"堆積(stacked)"突變的植物。突變可以位于芥菜植物的相同或不同的基因組上。芥菜植物可含有任意數(shù)量的突變的AHASL多核苷酸和突變的任意組合，包括但不限于對應(yīng)于SEQ ID NO :1的653位、SEQ ID NO :2的638位、SEQ ID NO :3的635位、SEQ IDNO :1的122位、SEQ ID NO :4的107位、SEQ ID NO :5的104位、SEQ ID NO :1的574位或SEQ ID NO :6的557位的突變。 本文還提供了在不同的基因組上具有兩個突變的AHASL多核苷酸的芥菜植物，其中一個突變的AHASL多核苷酸在A基因組上，第二個突變的AHASL多核苷酸在B基因組上。這樣的具有兩個突變的AHASL多核苷酸的芥菜植物包括含有bR突變和PM2突變的芥菜植物。這樣的植物包括芥菜品系J05Z-07801及其種子，和通過與芥菜品系J05Z-07801雜交而獲得的子代和后代。在另一個方面，具有兩個突變的AHASL多核苷酸的芥菜植物包括在子代芥菜品系中組合了 aR突變(例如來自J04E-0139品系)和A122T突變(例如來自J04E-0130品系)的那些。在一個方面，這樣的組合了兩個AHASLl突變的植物與分別含有單獨(dú)突變的芥菜植物的除草劑耐藥水平的加和相比，表現(xiàn)出協(xié)同水平的除草劑耐藥性。[OO37] 按照Swanson等人(Plant Cell R印orts 7:83-87(1989))的描述，使用油菜的小孢子誘變發(fā)展了 PM1和PM2突變。被認(rèn)為位于油菜A基因組上(Rutledge等人Mol. Gen.Genet. 229 :31-40(1991))的PM2突變的特征為，在AHAS3基因的3'末端存在單一核苷酸變化(G到T)，這導(dǎo)致從Trp到Leu的氨基酸變化，Trp556 (Bn) Leu (Hattori等人，Mol.Gen. Genet. 246 :419-425， 1995)。被認(rèn)為是位于油菜的C基因組(Rutledge等人Mol. Gen.Genet. 229 :31-40(1991))上的PM1突變，其特征為在AHAS1基因上存在單一核苷酸變化(G到A)，這導(dǎo)致從Ser到Asn的氨基酸變化，Ser638 (Bn) Asn (參見Sathasivan等人，PlantPhysiol. 97 :1044-1050， 1991，和Hattori等人，Mol. Gen. Genet. 232 :167-173， 1992 ;還參見US2004/0142353和US2004/0171027)。已經(jīng)報(bào)道突變的PM1 (AHAS1)和PM2 (AHAS3)基因以相加的方式作用來提供對于咪唑啉酮除草劑的耐藥性(Swanson等人，Theor.A卯l. Genet. 78 :525-530，1989)。 由于PM2被認(rèn)為是位于油菜的A基因組上，且芥菜和蕪菁(Brassicar即a)均含有 A基因組，所以可通過雜交這些種(基因滲入)并在低除草劑濃度下選擇來實(shí)現(xiàn)將PM2突變 基因從油菜轉(zhuǎn)移入芥菜或蕪菁。由于PM1被認(rèn)為是位于油菜的C基因組上，將此突變從油 菜中基因滲入芥菜(A、B)或蕪菁(A、A)中要困難得多，因?yàn)槠湟蕾囉跇O少發(fā)生的染色體易 位事件(即在油菜的C基因組和芥菜的A或B基因組之間)。這種染色體易位事件經(jīng)常受 到缺乏穩(wěn)定性及不能夠消除連鎖拖動這一問題(使用該方法時經(jīng)常發(fā)生該問題)的牽制。 美國專利號6， 613， 963公開了使用基因滲入方法產(chǎn)生的除草劑耐藥性PM1/PM2芥菜植物。 基于油菜中PM1和PM2提供的加和性耐藥性，可以遇見將這兩個突變，PM1和PM2，基因滲入 進(jìn)入芥菜將提供加和性除草劑耐藥性。 為了克服與"將除草劑耐藥性特性從油菜的C基因組轉(zhuǎn)移進(jìn)入蕪菁和/或芥菜的 A或B基因組"相關(guān)的問題，有利的是直接在所需要的基因組中產(chǎn)生突變。美國專利申請 2005/0283858公開了除草劑耐藥性芥菜AHAS1突變bR，其通過直接誘變在AHAS1基因上產(chǎn) 生SNP，從而在B基因組的AHASL基因上引起Ser638Asn的替換(使用擬南芥AHASL氨基酸 位置命名法則為653位)。 這里所提供的具有兩個或更多個AHASL突變的芥菜植物與單獨(dú)突變的加和水平 的抗性相比，具有增加的除草劑抗性水平。與單獨(dú)突變的AHASL的加和水平的抗性相比，具 有兩個或更多個AHASL突變的植物可具有比其高10 % 、20 % 、25 % 、30 % 、35 % 、40 % 、45 % 、 50%或更高水平的抗性。 抗性的增加可通過任何測定AHAS抗性的方法來測定。例如，可在使用AHAS-抑制 性除草劑處理后10、12、14、16、18、20、22、24、26或28天或更多天的時間段，通過測定芥菜 中抗性的百分率來測定。然后將抗性百分率與分別含有單獨(dú)AHASL突變的植物的抗性百分 率的加和的水平相比較。在一個方面，在植物中使用2x數(shù)量的AHAS-抑制性除草劑處理后 14天測定抗性百分率從而確定抗性。 本發(fā)明還涉及分離的多核苷酸分子，其包含編碼乙酰羥酸合成酶大亞基(AHASL) 蛋白的核苷酸序列，本發(fā)明還涉及這樣的AHASL蛋白。本發(fā)明揭示了從除草劑抗性的蕓苔 屬植物分離編碼除草劑抗性蕓苔屬AHASL1蛋白的多核苷酸，還揭示了所述多核苷酸的核 苷酸序列，所述除草劑抗性蕓苔屬植物是通過對野生型蕓苔屬植物進(jìn)行化學(xué)誘變而產(chǎn)生 的。本發(fā)明所述除草劑抗性AHASL1蛋白在位于A基因組的芥菜AHASL1基因的635位上具 有絲氨酸到天冬酰胺的替代；或在位于B基因組的芥菜AHASL1基因的107位上具有丙氨酸 到蘇氨酸的替代；或在位于A基因組的芥菜AHASL1基因的104位上具有丙氨酸到蘇氨酸的 替代。本發(fā)明還揭示了編碼野生型蕓苔屬AHASL1蛋白的多核苷酸分子的分離和核苷酸序 列。 本發(fā)明提供了編碼來自蕓苔屬特別是芥菜的AHASL1蛋白的分離的多核苷酸分 子。特別地，本發(fā)明提供了包含以下核苷酸序列的分離的多核苷酸分子如SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列，編碼含有如SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列的AHASL1蛋白的核苷 酸序列，如SEQ ID N0:14所示的核苷酸序列，編碼含有如SEQ ID N0:4所示的氨基酸序 列的AHASL1蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO :15所示的核苷酸序列，編碼含有如SEQ IDNO :5所示的氨基酸序列的AHASL1蛋白的核苷酸序列，以及上述核苷酸序列的編碼功能性 AHASLl蛋白的片段和變體。 本發(fā)明所述分離的除草劑抗性AHASL1多核苷酸分子包含編碼除草劑抗性AHASL1 蛋白的核苷酸序列。這樣的多核苷酸分子可用于多核苷酸構(gòu)建體以轉(zhuǎn)化植物特別是農(nóng)作物 植物，從而增強(qiáng)植物對除草劑、特別是對已知抑制AHAS活性的除草劑、更特別的是對咪唑 啉酮除草劑的抗性。這樣的多核苷酸構(gòu)建體可用于表達(dá)框、表達(dá)載體、轉(zhuǎn)化載體、質(zhì)粒等。使 用這樣的多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化之后所獲得的轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出對AHAS-抑制性除草劑例 如咪唑啉酮和磺酰脲除草劑的增加的抗性。 本發(fā)明的組合物包含編碼AHASL1蛋白的核苷酸序列。特別地，本發(fā)明提供了分離 的多核苷酸分子，其包含編碼如SEQ ID N0:3、4或5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；以及 多核苷酸分子的片段和變體，所述片段和變體編碼包含AHAS活性的多肽。本發(fā)明進(jìn)一步提 供了多肽，其具有由本文所描述的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列，所述多核苷酸例如SEQ ID NO :13、 14或15所示的核苷酸序列，以及其片段和變體，所述片段和變體編碼包含AHAS 活性的多肽。 本發(fā)明提供了在本文所描述的蕓苔屬AHASL蛋白的保守區(qū)域內(nèi)的特定氨基酸位 置上具有氨基酸替換的AHASL蛋白。除非本文另外指明，否則特定氨基酸位置是指如SEQ ID NO :1所示的擬南芥AHASL全長氨基酸序列中的氨基酸位置。另外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 將認(rèn)識到，這樣的氨基酸位置將會根據(jù)是否有氨基酸被添加到例如氨基酸序列的N末端或 者有氨基酸從氨基酸序列的N末端被切除而變化。因此，本發(fā)明包括在所述位置或等同位 置上的氨基酸替換(例如，"氨基酸位置653或等同位置")。"等同位置"是指與示例性氨 基酸位置位于相同的保守區(qū)域內(nèi)的位置。例如，SEQ ID N0:1中的122位氨基酸是SEQ ID N0:4中的107位氨基酸的等同位置，也是SEQID NO :5中的104位氨基酸的等同位置。類 似的，具有如SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的擬南芥AHASL蛋白中的氨基酸653位是蕓苔 屬AHASL1B蛋白中的氨基酸638位的等同位置，也是蕓苔屬AHASL1A蛋白中的氨基酸635 位的等同位置，蕓苔屬AHASL1B蛋白和蕓苔屬AHASL1A蛋白分別具有如SEQ ID NO :2和3 所示的氨基酸序列。 本發(fā)明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白組合物。"分離的"或"純化的"多 核苷酸分子或蛋白，或其生物活性部分，基本上或?qū)嵸|(zhì)上不含那些在自然發(fā)生的環(huán)境中通 常伴隨多核苷酸分子或蛋白的成分、或通常與多核苷酸分子或蛋白相互作用的成分。因此， 分離的或純化的多核苷酸分子或蛋白基本上不含其它細(xì)胞材料；或基本上不含培養(yǎng)液，如 果是通過重組技術(shù)生產(chǎn)的話；或者，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)，如果是通過化學(xué) 合成的話。優(yōu)選地，"分離的"核酸不含那些核酸所源自的生物體的基因組DNA中核酸側(cè)翼 序列(優(yōu)選為蛋白編碼序列)(即位于核酸的5'或3'末端的序列)。例如，在各種實(shí)施方 式中，分離的多核苷酸分子可含有少于核酸所源自的細(xì)胞的基因組DNA中的多核苷酸分子 的側(cè)翼序列的約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb、0. lkb的序列?；旧喜缓?xì)胞材料的蛋白 包括那些含有低于污染蛋白的約30%、20%、10%、5%、1%干重的蛋白制備物。當(dāng)本發(fā)明所 述蛋白或其生物活性部分通過重組方式產(chǎn)生時，優(yōu)選地，培養(yǎng)液代表少于化學(xué)前體或非目 的蛋白性化學(xué)物質(zhì)的約30% 、20% 、 10% 、5% 、 1 %的干重。 本發(fā)明提供了包括AHASL1蛋白的分離多肽。分離的多肽包含選自下列的氨基酸
16序列如SEQ ID N0:3、4或5所示的氨基酸序列；由SEQ IDNO : 13、 14或15所示的核苷酸 序列編碼的氨基酸序列；所述氨基酸序列的功能性片段或變體，所述片段或變體編碼包含 AHAS活性的AHASLl多肽。"功能性片段或變體"是指示例性的多肽的片段或變體，其包含 AHAS活性。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，方法包括使用除草劑耐藥性或除草劑抗性植物。"除 草劑耐藥性"或"除草劑抗性"植物是指對在通常將殺死或抑制正?；蛞吧椭参锷L的水 平上的至少一種除草劑具有耐藥性或抗性。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，除草劑耐藥性植 物包含除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL蛋白。"除草劑耐藥性AHASL蛋白"或"除草劑抗 性AHASL蛋白"是指在已知干擾AHAS活性的至少一種除草劑存在且該除草劑的濃度或水 平已知可抑制野生型AHASL蛋白的AHAS活性的情況下，相對于野生型AHASL蛋白的AHAS 活性來說，表現(xiàn)出更高的AHAS活性的AHASL蛋白。此外，這樣的除草劑耐藥性或除草劑抗 性AHASL蛋白的AHAS活性在本文中可被稱為"除草劑耐藥性的"或"除草劑抗性的"AHAS 活性。 對于本發(fā)明，術(shù)語"除草劑耐藥性的"和"除草劑抗性的"可相互替換地使用，其具 有相同的意思和范圍。類似地，術(shù)語"除草劑耐藥性"和"除草劑抗性"可相互替換地使用， 其具有等同的意思和范圍。同樣地，術(shù)語"咪唑啉酮抗性的"和"咪唑啉酮抗性"可分別與 "咪唑啉酮耐藥性的"和"咪唑啉酮耐藥性"相互替換地使用，其具有等同的意思和范圍。
本發(fā)明包括除草劑抗性AHASLl多核苷酸和除草劑抗性AHASLl蛋白。"除草劑抗 性AHASL1多核苷酸"是指編碼含有除草劑抗性AHAS活性的蛋白的多核苷酸。"除草劑抗性 AHASLl蛋白"是指含有除草劑抗性AHAS活性的蛋白或多肽。 此外，應(yīng)認(rèn)識到可通過使用編碼除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL蛋白的核苷酸 序列轉(zhuǎn)化植物或其原種(ancestor)而將除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL蛋白引入植物。 這樣的除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL蛋白由除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL多核苷 酸所編碼?；蛘?，除草劑耐藥性或除草劑抗性AHASL蛋白可以由于自然發(fā)生而在植物中產(chǎn) 生，或者由于在植物或其祖先(progenitor)中的內(nèi)源AHASL基因的誘導(dǎo)的突變而產(chǎn)生。
本發(fā)明提供了植物、植物組織、植物細(xì)胞和宿主細(xì)胞，它們對于至少一種除草劑特 別是干擾AHAS酶活性的除草劑，更特別是咪唑啉酮或磺酰脲除草劑，具有增加的和/或增 強(qiáng)的抗性或耐藥性。術(shù)語"增強(qiáng)的"是指抗性或耐藥性數(shù)量比預(yù)期的要高。優(yōu)選的除草劑的 數(shù)量或濃度為"有效量"或"有效濃度"。"有效量"和"有效濃度"分別是指這樣的數(shù)量和濃 度，其足以殺死或抑制相似的野生型植物、植物組織、植物細(xì)胞、小孢子或宿主細(xì)胞的生長， 但是所述數(shù)量不會殺死或嚴(yán)重抑制本發(fā)明所述除草劑抗性植物、植物組織、植物細(xì)胞、小孢 子或宿主細(xì)胞的生長。通常，除草劑的有效量是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中常規(guī)用于殺死目的雜草 的數(shù)量。這樣的數(shù)量對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是已知的，或者可使用本領(lǐng)域已知技術(shù) 容易地確定。此外，還應(yīng)該認(rèn)識到，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)系統(tǒng)中所使用的除草劑有效量可能與植物培養(yǎng) 系統(tǒng)例如小孢子培養(yǎng)系統(tǒng)中所使用的除草劑的有效量是實(shí)質(zhì)上不同的。
本發(fā)明所述除草劑是那些干擾AHAS酶活性的除草劑，以致在該除草劑存在的情 況下，AHAS酶的活性被降低。這樣的除草劑在本文中也可被稱為"AHAS-抑制性除草劑"或 簡單稱作"AHAS抑制劑"。本文中所用的"AHAS-抑制性除草劑"或"AHAS抑制劑"不是限 定于干擾AHAS酶的單一除草劑。因此，除非另有指明或上下文有證據(jù)表明，否則"AHAS-抑制性除草劑"或"AHAS抑制劑"可以是一種除草劑或兩種、三種、四種或更多種除草劑的混 合物，其中每種除草劑均干擾AHAS酶的活性。"相似的野生型植物、植物組織、植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞"是指缺少除草劑抗性特性 和/或本文中所揭示的本發(fā)明特定多核苷酸的植物、植物組織、植物細(xì)胞或宿主細(xì)胞。因 此，術(shù)語"野生型"的使用不是指植物、植物組織、植物細(xì)胞或其它宿主細(xì)胞在其基因組中缺 少重組DNA和/或不具有不同于本文所描述的除草劑抗性特性。 除非另外清晰指明，否則本文所用的術(shù)語"植物"是指處于任何發(fā)育階段的植物， 以及植物的任何部分，所述部分可以附著于或分離于整個完整植物。這樣的植物的部分 包括但不限于植物的器官、組織和細(xì)胞，包括植物愈傷組織、植物團(tuán)塊(clumps)、植物原生 質(zhì)體和植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物，植物可從所述這些部分再生。特別的植物部分的例子包括 莖、葉、根、花序、花、小花(floret)、果實(shí)、花梗(pedicle)、花序梗(peduncle)、雄蕊、花 藥、柱頭、花柱、子房、花瓣、萼片、心皮、根尖、根冠、根毛、葉毛、種毛、花粉粒、小孢子、胚芽 (embryos)、胚珠、子葉、胚軸、上胚軸、木質(zhì)部、韌皮部、薄壁組織、胚乳、伴胞、保衛(wèi)細(xì)胞以及 任何已知的植物器官、組織和細(xì)胞。此外，應(yīng)該認(rèn)識到種子是植物。 本發(fā)明所述植物既包括非轉(zhuǎn)基因植物也包括轉(zhuǎn)基因植物。"非轉(zhuǎn)基因植物"是指在 其基因組中缺少重組DNA的植物。"轉(zhuǎn)基因植物"是指在其基因組中含有重組DNA的植物。 這樣的轉(zhuǎn)基因植物可通過將重組DNA引入植物的基因組中來產(chǎn)生。當(dāng)這樣的重組DNA被引 入轉(zhuǎn)基因植物的基因組中時，植物的子代也會含有重組DNA。含有至少一個祖先轉(zhuǎn)基因植物 的重組DNA的至少一部分的子代植物也是轉(zhuǎn)基因植物。 本發(fā)明提供了除草劑抗性蕓苔屬品系，本文中稱為J04E-0122。已經(jīng)于2006年10 月19日將蕓苔屬J04E-0122品系的至少2500個種子保藏于專利保藏機(jī)構(gòu)美國模式培養(yǎng) 物保藏中心(ATCC) (Mansassas， VA 20110 USA) ， ATCC專利保藏號為PTA_7944。本發(fā)明提 供了除草劑抗性蕓苔屬品系，本文中稱為J04E-0130。已經(jīng)于2006年10月19日將蕓苔屬 J04E-0130品系的至少2500個種子提交保藏，并被分配了 ATCC專利保藏號PTA_7945。本發(fā) 明提供了除草劑抗性蕓苔屬品系，本文中稱為J04E-0139。已經(jīng)于2006年10月19日將蕓 苔屬J04E-0139品系的至少2500個種子提交保藏，并被分配了 ATCC專利保藏號PTA_7946。 本發(fā)明提供了除草劑抗性雙突變蕓苔屬品系，本文中稱為J04Z-07801。已經(jīng)于2007年4月 2日將蕓苔屬J04Z-07801品系的至少625個種子提交保藏，其余1875個種子于2008年1 月15日提交保藏，并被分配了ATCC專利保藏號PTA-8305。保藏將在國際承認(rèn)用于專利程 序的微生物保存布達(dá)佩斯條約下保持。蕓苔屬品系J04E-0122、 J04E-0130、 J04E-0130和 J05Z-07801將持續(xù)至少30年以及ATCC收到最新的提供保藏樣品需求之后至少5年。另 外，申請人滿足了 37C.F.R. § § 1.801-1. 809的所有要求，包括提供樣品存活性的指征。
本發(fā)明所述單一突變除草劑抗性蕓苔屬品系J04E-0122、 J04E_0130、 J04E-0139 是通過突變育種產(chǎn)生的。將野生型蕓苔屬小孢子暴露于誘變物質(zhì)特別是化學(xué)誘變物質(zhì)，更 特別是乙基亞硝基脲(ENU)，而進(jìn)行誘變。但是，本發(fā)明不限于通過包括化學(xué)誘變物質(zhì)ENU 在內(nèi)的誘變方法而產(chǎn)生的除草劑抗性蕓苔屬植物。任何本領(lǐng)域已知的誘變方法均可用于 產(chǎn)生本發(fā)明所述除草劑抗性蕓苔屬植物。這樣的誘變方法可包括，例如，使用下列任何一 個或多個誘變物質(zhì)射線例如X射線、y射線(例如鈷60或銫137)、中子(例如原子反 應(yīng)器中鈾235核裂變產(chǎn)物)、13射線(例如從放射性同位素例如磷32或碳14中發(fā)射出)和紫外線(優(yōu)選為250至290nm);和化學(xué)誘變物質(zhì)例如甲磺酸乙酯(EMS)、堿類似物(例 如5-溴尿嘧啶)、相關(guān)化合物(例如8-乙氧基咖啡因)、抗生素(例如鏈黑菌素)、烷基 化試劑(例如硫芥、氮芥、環(huán)氧化物、乙撐胺(ethylenamine)、硫酸鹽、磺酸鹽、砜、內(nèi)酯)、 疊氮化物、羥胺、亞硝酸或吖啶。還可通過使用組織培養(yǎng)方法來選擇含有除草劑抗性突變 的植物細(xì)胞然后從中再生出除草劑抗性植物來產(chǎn)生除草劑抗性植物。參見，例如美國專利 號5，773，702和5，859，348，二者通過參考方式全文引入本文?？梢栽?Principals of Cultivar Development"Fehr， 1993Macmillan Publishing Company中找至lj突變育禾中的進(jìn) 一步的細(xì)節(jié)，該文獻(xiàn)通過參考方式引入本文。 對蕓苔屬植物J04E-0139品系的AHASL1基因的分析揭示出一個突變，該突變在A
基因組上芥菜AHASL基因的氨基酸635位引起從絲氨酸到天冬酰胺的替換，并且賦予對除
草劑的增加的抗性。因此，本發(fā)明揭示了，在635位(對應(yīng)于擬南芥AHASL1的653位氨基
酸)用另一種氨基酸替換絲氨酸可引起蕓苔屬植物對除草劑特別是咪唑啉酮和/或磺酰脲
除草劑產(chǎn)生增加的抗性。本發(fā)明所述除草劑抗性蕓苔屬植物包括但不限于這樣的蕓苔屬植
物，其在基因組中含有至少一個拷貝的編碼除草劑抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所
述除草劑抗性AHASL1蛋白在氨基酸635位或等同位置上包含天冬酰胺。 對蕓苔屬植物J04E-0130品系的AHASL1基因的分析揭示出一個突變，該突變在
B基因組上芥菜AHASL基因的氨基酸107位引起從丙氨酸到蘇氨酸的替換，并且賦予對除
草劑的增加的抗性。因此，本發(fā)明揭示了，在107位(對應(yīng)于擬南芥AHASL1的122位氨基
酸)用另一種氨基酸替換丙氨酸可引起蕓苔屬植物對除草劑特別是咪唑啉酮和/或磺酰脲
除草劑產(chǎn)生增加的抗性。本發(fā)明所述除草劑抗性蕓苔屬植物包括但不限于這樣的蕓苔屬植
物，其在基因組中含有至少一個拷貝的編碼除草劑抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所
述除草劑抗性AHASL1蛋白在氨基酸107位或等同位置上包含蘇氨酸。 對蕓苔屬植物J04E-0122品系的AHASL1基因的分析揭示出一個突變，該突變在
A基因組上芥菜AHASL基因的氨基酸104位引起從丙氨酸到蘇氨酸的替換，并且賦予對除
草劑的增加的抗性。因此，本發(fā)明揭示了，在104位(對應(yīng)于擬南芥AHASL1的122位氨基
酸)用另一種氨基酸替換丙氨酸可引起蕓苔屬植物對除草劑特別是咪唑啉酮和/或磺酰脲
除草劑產(chǎn)生增加的抗性。本發(fā)明所述除草劑抗性蕓苔屬植物包括但不限于這樣的蕓苔屬植
物，其在基因組中含有至少一個拷貝的編碼除草劑抗性AHASL1蛋白的AHASL1多核苷酸，所
述除草劑抗性AHASL1蛋白在氨基酸104位或等同位置上包含蘇氨酸。 本發(fā)明所述蕓苔屬植物還包括這樣的植物，其相對于野生型AHASL1蛋白來說，在
氨基酸653位(擬南芥命名法)上包含天冬酰胺，在氨基酸122位(擬南芥命名法)上包
含蘇氨酸，以及相對于野生型AHASL1蛋白來說，在AHASL1蛋白上具有一個或多個另外的氨
基酸取代，其中這樣的蕓苔屬植物與野生型蕓苔屬植物相比，對于至少一種除草劑具有增
加的抗性。 本發(fā)明提供了植物、制備AHAS除草劑抗性的蕓苔屬植物的方法、具有對AHAS除 草劑增加的耐藥性的蕓苔屬植物、以及這樣的植物的種子。因此，這里所示例的植物可用 于育種項(xiàng)目以發(fā)展另外的除草劑抗性芥菜植物，例如芥菜的商業(yè)品種。根據(jù)這些方法，可 將第一蕓苔屬親代植物與第二蕓苔屬親代植物雜交，其中第一或第二蕓苔屬植物中的至 少一種含有至少一個AHAS除草劑抗性突變。此方法的一個應(yīng)用為生產(chǎn)&雜交植物。此方法的另一個重要方面為用于發(fā)展新的親代植物，雙單倍體或近交(inbred)系。例如， 本文所描述的蕓苔屬品系可與任何第二植物雜交，所得到的雜交子代每個自花授精和/ 或同胞交配(sibbed)約5至7或更多代，因此提供很多的不同的親代品系。然后將這些 親代品系與其它品系雜交，分析所得到的雜交子代的有益特性。根據(jù)這種方法，可以鑒 定賦予了所需要特性的新的品系。在該方法中可使用各種育種方式，包括單倍體化、譜 系育禾中(pedigree breeding)、單粒傳(single—seed descent)、改進(jìn)的單粒傳、輪回選擇 (recurrent selection)以及回交。 可通過天然或機(jī)械方法進(jìn)行蕓苔屬品系的雜交?？赏ㄟ^控制轉(zhuǎn)移到柱頭上的花粉 類型或者通過手工傳粉來實(shí)現(xiàn)機(jī)械授粉。 可通過任何方法來評價后代和/或子代蕓苔屬植物以確定突變的AHASL多核苷酸 或多肽的存在。這樣的方法包括表型評價、基因型評價或其組合?？梢栽谧哟|苔屬植物 的后續(xù)傳代中評價除草劑抗性和其它所需要的特性?？赏ㄟ^將植物暴露于一種或多種合適 的AHAS-抑制性除草劑并評價除草劑損傷來評價對于AHAS-抑制劑除草劑的抗性。 一些特 性，例如抗倒性和植株高度，可通過目視調(diào)查來評價；而早熟則可通過目視調(diào)查莢果(pod) (長角果)內(nèi)的種子來評價。其它的特性，例如種子中的含油百分率、蛋白質(zhì)百分率和總芥 子油苷(glucosinolate)可使用近紅外光譜技術(shù)和/或液相色譜和/或氣相色譜來評價。
對蕓苔屬植物的基因型評價包括使用以下技術(shù)例如同工酶電泳、限制性酶切片 斷多樣性(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、隨意引物聚合酶鏈反應(yīng)(AP-PCR) 、 DNA擴(kuò)增 指紋(DAF)、序列特異性擴(kuò)增區(qū)(SCAR)、擴(kuò)增片斷多樣性(AFLP)、簡單重復(fù)序列(SSR)(也稱 為微衛(wèi)星)。這里所提供的用于分析蕓苔屬植物基因型的另外的組合物和方法包括在美國 專利申請
發(fā)明者D·梅爾斯, D·波茨, K·姚 申請人:巴斯夫歐洲公司;維特拉公司