專利名稱：使用轉(zhuǎn)化酵母的人神經(jīng)酰胺的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請主張基于2007年6月5日申請的日本國專利申請2007-149657的優(yōu)先權(quán)。本發(fā)明涉及在酵母細(xì)胞內(nèi)等的細(xì)胞內(nèi)制造人神經(jīng)酰胺的方法。
背景技術(shù)：
皮膚的最外層存在著具有保持水分的保濕功能和保護(hù)肌膚不受外界刺激的屏障功能的稱為角質(zhì)層的組織。角質(zhì)層由角質(zhì)細(xì)胞、天然保濕因子及細(xì)胞間脂質(zhì)構(gòu)成，其中，特別是約占細(xì)胞間脂質(zhì)一半的神經(jīng)酰胺對上述功能起著極為重要的作用。例如，特應(yīng)性皮炎、 老年性干皮病共通的特征是保濕功能顯著降低，已知其主要原因是由于脂代謝酶異常而引起的神經(jīng)酰胺量的減少，并且也已證實(shí)神經(jīng)酰胺具有增強(qiáng)屏障功能、美白作用、抑制黑素生成的作用。神經(jīng)酰胺是可從外界補(bǔ)充的物質(zhì)。J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991 (非專利文獻(xiàn) 1)、Arch DermatolRes. 283 219-223，1991 (非專利文獻(xiàn)2)中公開了《特應(yīng)性皮炎、老年性干皮病中神經(jīng)酰胺量的減少》，J Dermatol Sci. 1 :79_83，1990 (非專利文獻(xiàn) 3)、Acta Derm Venereol. 74 337-340，1994(非專利文獻(xiàn)4)中公開了《神經(jīng)酰胺量的減少與脂代謝酶異?！罚珻ontact Dermatitis. 45 280-285, 2001 ( # # ^lJ ^； K 5) > J Eur Acad Dermatol Venereol. 16 587-594，2002 (非專利文獻(xiàn)6)中公開了《利用神經(jīng)酰胺恢復(fù)屏障功能》，且Cell Signal 14 :779-785，2002(非專利文獻(xiàn)7)中公開了《利用神經(jīng)酰胺抑制黑素生成》。近年來，其作為針對干燥敏感肌膚帶來的皮膚疾病的治療藥物或化妝品、美容健康食品的材料受到極大關(guān)注。實(shí)際上，作為化妝品、食品/營養(yǎng)補(bǔ)助食品等配合了神經(jīng)酰胺的大量產(chǎn)品已在市售，且神經(jīng)酰胺原料市場的規(guī)模有持續(xù)擴(kuò)大的趨勢。作為神經(jīng)酰胺的原料，至今為止所使用的是來自牛等動(dòng)物的原料，但因被指出有傳染病的問題，所以目前以米、小麥、大豆、薯類等的植物性神經(jīng)酰胺為主流。最近的基礎(chǔ)研究[J. Clin. Invest. 112 1372-1382，2003 (非專利文獻(xiàn)8)]已證實(shí)，神經(jīng)酰胺的結(jié)構(gòu)對皮膚保濕、屏障功能極為重要，而與人的神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)不同的植物性神經(jīng)酰胺是否是功能性強(qiáng)的脂質(zhì)還留有疑問。而且，因動(dòng)植物中存在的神經(jīng)酰胺為微量難于提取、精制，生產(chǎn)率低、成本高，所以，強(qiáng)烈希望開發(fā)出可克服這些缺點(diǎn)的新的生產(chǎn)技術(shù)。如圖1所示，已知在神經(jīng)鞘脂類合成·代謝途徑中，二氫神經(jīng)鞘氨醇(DHS)生物合成之后的反應(yīng)在包括人在內(nèi)的高等動(dòng)物細(xì)胞和酵母之間有很大差異。此外，在神經(jīng)鞘脂類合成·代謝途徑中，對于各個(gè)過程中起作用的各種酶蛋白質(zhì)及編碼該蛋白質(zhì)的基因，也已獲得了一定程度的認(rèn)識[Biochemistry. 41 :15105-15114. 2002 (非專利文獻(xiàn) 9) J Biol Chem. 277 :25512-25518，2002(非專利文獻(xiàn) 10) ；Yeast 9 :267_277，1993 (非專利文獻(xiàn) 11)； J Biol Chem 272 :29704_29710，1997 (非專利文獻(xiàn) 12) J Biol Chem275 :31369_31378， 2000 (非專利文獻(xiàn) 13) J Biol Chem 275 :39793_39798，2000 (非專利文獻(xiàn) 14)]。非專利文獻(xiàn)1 J Invest Dermatol. 96 :523_526，1991非專利文獻(xiàn)2 =Arch Dermatol Res. 283 :219_223，1991
非專利文獻(xiàn)3 J Dermatol Sci. 1 :79_83，1990非專利文獻(xiàn)4 =Acta Derm Venereol. 74 :337_340，1994非專利文獻(xiàn) 5 =Contact Dermatitis. 45 :280_285，2001非專利文獻(xiàn) 6 J Eur Acad Dermatol Venereol. 16 :587_594，2002非專利文獻(xiàn)7:Cell Signal 14 :779_785，2002非專利文獻(xiàn)8 J.Clin· Invest. 112 1372-1382，2003非專利文獻(xiàn)9 =Biochemistry. 41 :15105_15114· 2002非專利文獻(xiàn)10 J Biol Chem. 277 :25512_25518，2002非專利文獻(xiàn)11 Yeast 9 :267_277，1993非專利文獻(xiàn)12 J Biol Chem 272 :29704_29710，1997非專利文獻(xiàn)13 J Biol Chem 275 :31369_31378，2000非專利文獻(xiàn)14 J Biol Chem 275 :39793_39798，2000

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題植物性神經(jīng)酰胺不僅與人的神經(jīng)酰胺結(jié)構(gòu)不同，而且生產(chǎn)率低。為了克服這些問題，人們迫切希望開發(fā)出能用酵母細(xì)胞等細(xì)胞來制造人神經(jīng)酰胺的新生產(chǎn)技術(shù)。解決課題的方法本發(fā)明者為了解決上述問題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果想到了本發(fā)明。本發(fā)明開發(fā)一種系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過巧妙地控制基因重組技術(shù)和真核生物的神經(jīng)酰胺合成、代謝以及運(yùn)送系統(tǒng)來高效地生產(chǎn)功能性高的人神經(jīng)酰胺。因此，將基因操作較容易、且在傳統(tǒng)的食品制造中應(yīng)用的芽殖酵母作為宿主使用。具體而言，將存在于人的角質(zhì)層、且在其中分布量最多的被認(rèn)為對皮膚的保濕、屏障功能極為重要的神經(jīng)酰胺NS作為目標(biāo)。神經(jīng)酰胺的結(jié)構(gòu)由細(xì)胞所具有的酶的種類來決定，因生物種不同而不同。作為宿主使用的芽殖酵母不具有合成高等動(dòng)物的主要神經(jīng)酰胺即神經(jīng)酰胺NS的酶。取而代之，宿主中具有宿主特有的合成神經(jīng)酰胺的酶。因此，為了在酵母中合成神經(jīng)酰胺NS，必須抑制來自宿主的神經(jīng)酰胺合成途徑，并且要向酵母中導(dǎo)入必要的酶。具體地說，如圖1所示，在神經(jīng)鞘脂類合成·代謝途徑中，二氫神經(jīng)鞘氨醇(DHS) 生物合成之后的反應(yīng)，在包括人在內(nèi)的高等動(dòng)物細(xì)胞和酵母之間有很大差異。即因芽殖酵母(酵母屬)中不存在鞘脂類Δ4-去飽和酶基因(DESl)，所以不能合成DHS的C-4位上具有雙鍵的人鞘氨醇堿(鞘氨醇)(圖2)。取而代之，通過二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因 (SUR2)所編碼的酶，DHS的C-4位被羥基化從而合成植物鞘氨醇(PHS)?；蛘撸ㄟ^鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)所編碼的酶使DHS磷酸化從而合成二氫神經(jīng)鞘氨醇1磷酸。如果能夠高效合成鞘氨醇堿，則可期待轉(zhuǎn)化為神經(jīng)酰胺。本發(fā)明者考慮到，首先為了在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人神經(jīng)酰胺，重要的是1)需要使酵母細(xì)胞內(nèi)不存在的鞘脂類△ 4-去飽和酶在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；2)完全或部分地阻斷二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶的酶活性；以及3)完全或部分地阻斷鞘氨醇堿磷酸化酶的活性。因此，想到首先通過酵母的轉(zhuǎn)化，制作上述SUR2基因、LCB4基因阻斷株，在該突變株中導(dǎo)入人DESl基因。由此首次使以往不可能的人神經(jīng)酰胺在酵母細(xì)胞內(nèi)的制造變成了可能。在本發(fā)明中，人神經(jīng)酰胺是指具有如圖2的“目的產(chǎn)物”中所示的結(jié)構(gòu)式的神經(jīng)酰胺NS。與此相對，作為酵母神經(jīng)酰胺的植物神經(jīng)酰胺的不同之處為，人神經(jīng)酰胺的4位的雙鍵部分被羥基取代(圖3)。進(jìn)而，為了構(gòu)建高效生產(chǎn)人神經(jīng)酰胺NS的系統(tǒng)，將本發(fā)明的制造方法進(jìn)行了最佳化。作為具體方法，通過酵母的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行以下4)的工序，成功地更加高效地制造出了人神
經(jīng)酰胺。4)為使神經(jīng)酰胺NS不被羥化而使酵母神經(jīng)鞘脂類α _羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。因此，本發(fā)明通過將上述1)-3)作為必要條件，將4)作為優(yōu)選方式的追加條件而進(jìn)行，提供在酵母細(xì)胞內(nèi)簡便且高效地制造人神經(jīng)酰胺的方法。本發(fā)明優(yōu)選包括以下方式。(方式1)一種制造方法，其為在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人神經(jīng)酰胺的方法，包括1)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入鞘氨醇類Δ 4-去飽和酶基因(DESl)；2)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失；以及3)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)的表達(dá)缺失。(方式2)根據(jù)方式1所述的方法，其中，酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)編碼具有序列號10的氨基酸序列或序列號10中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列、且具有鞘氨醇堿磷酸化活性的蛋白質(zhì)。(方式3)根據(jù)方式1或2所述的方法，其中，鞘氨醇類Δ 4-去飽和酶基因(DESl)編碼具有序列號2的氨基酸序列或序列號2中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列、且具有鞘氨醇類Δ4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)。(方式4)根據(jù)方式1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因 (SUR2)編碼具有序列號6的氨基酸序列或序列號6中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列、且具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。(方式δ)根據(jù)方式1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括4)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化， 使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。(方式6)根據(jù)方式1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因 (SCS7)編碼具有序列號8的氨基酸序列或序列號8中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列、且具有神經(jīng)鞘脂類α "羥化酶活性的蛋白質(zhì)。(方式7)根據(jù)方式1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母選自酵母屬的酵母。(方式8)
根據(jù)方式1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，1)導(dǎo)入鞘氨醇類Δ 4-去飽和酶基因 (DESl)時(shí)，使用含有各不相同的選擇性標(biāo)記的2種以上的DESl表達(dá)載體。鞘脂類Δ 4-去飽和酶基因(DESl)本發(fā)明的方法包括作為構(gòu)成要素1)，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入鞘脂類Δ4-去飽和酶基因(DESl)。雖然沒有限定，但DESl優(yōu)選編碼具有序列號2的氨基酸序列或序列號2中1個(gè)或 1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列、且具有鞘脂類△ 4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)?？捎糜诒景l(fā)明的基因(核酸)，包括基因組DNA (也包括與其對應(yīng)的cDNA)、化學(xué)合成的DNA、通過PCR擴(kuò)增的DNA及這些的組合。DESl優(yōu)選具有序列號1的堿基序列。其是編碼具有序列號2的氨基酸序列的人鞘脂類Δ 4-去飽和酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如已在GenBanK :accession number AF466375 中公開。1個(gè)以上的密碼子有時(shí)編碼同一氨基酸，稱為遺傳密碼的簡并。因此，與序列號1 不完全一致的DNA序列可編碼具有與序列號2完全相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。這樣的突變體DNA序列可從沉默(silent)突變(例如，PCR擴(kuò)增中發(fā)生)中產(chǎn)生或也可以是有目的地對天然序列進(jìn)行誘變的產(chǎn)物。DESl優(yōu)選編碼序列號2中記載的氨基酸序列，但并不限于此，也可以具有1個(gè)或 1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有鞘脂類Δ4-去飽和酶活性，可包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號2具有同等功能的氨基酸序列，并不限于序列號2?！鞍被嵬蛔儭笨梢詾? 多個(gè)，優(yōu)選1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，最優(yōu)選 1 5個(gè)。由DESl編碼的氨基酸序列與序列號2中記載的氨基酸序列具有至少約70%、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。氨基酸的同一性百分?jǐn)?shù)，可通過視覺檢查及數(shù)學(xué)計(jì)算確定。或者2個(gè)蛋白質(zhì)序列的同一性百分?jǐn)?shù)可根據(jù) Needl eman, S. B.及 Wunsch，C. D. (J. Mol. Biol. ,48 :443_453， 1970)的算法，并通過使用從威斯康星大學(xué)遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(UWGCG)獲得的GAP計(jì)算機(jī)程序比較序列信息來確定。GAP程序的優(yōu)選默認(rèn)值中包括(1)如Henikoff，S及Henikoff， J.G. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,89 10915-10919，1992)中記載的打分矩陣、blosum62 ； (2) 12的空位加權(quán)；(3)4的長空位加權(quán)；及(4)對末端空位無罰分。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的序列比較的其他程序。同一性的百分?jǐn)?shù)，可使用例如 Altschul (Nuc 1. Acids. Res. 25.，p. 3389-3402，1997)中記載的 BLAST 程序， 與序列信息比較而確定。該程序可在因特網(wǎng)上在NationalCenter for Biotechnology Information(NCBI)、或 DNA Data Bank of Japan (DDBJ)的網(wǎng)站利用。利用 BLAST 程序的同源性檢索的各種條件(參數(shù))在同網(wǎng)站有詳細(xì)記載，可適當(dāng)變更一部分設(shè)定，但檢索通常使用默認(rèn)值進(jìn)行。本發(fā)明的方法中，優(yōu)選鞘脂類Δ4-去飽和酶具有序列號2或與序列號2至少有 70%同一性的氨基酸序列，且具有鞘脂類Δ 4-去飽和酶活性。即使是具有同一功能的蛋白質(zhì)，由于其來源品種不同，其氨基酸序列也可存在不同，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的事實(shí)。只要具有鞘脂類Δ 4-去飽和酶活性，DESl也可包含如序列號1的堿基序列的同源體、突變體。已知除編碼序列號2的人鞘脂類Δ 4-去飽和酶蛋白質(zhì)以外，還存在例如編碼在小鼠(M. musculus)、黑腹果蠅(D. melanogaster)、線蟲(C. elegans)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等中顯示同樣活性的蛋白質(zhì)的基因(非專利文獻(xiàn)10)。如圖2或圖3中所示，“具有鞘脂類Δ 4-去飽和酶活性”是指在二氫神經(jīng)鞘氨醇的 C-4位導(dǎo)入雙鍵，合成鞘氨醇的活性?；蛑冈诙渖窠?jīng)酰胺的C-4位導(dǎo)入雙鍵，合成神經(jīng)酰胺NS的活性。通過DESl的導(dǎo)入，在轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行通過酵母天然代謝途徑無法合成的鞘氨醇和/或神經(jīng)酰胺NS的合成。本發(fā)明的優(yōu)選鞘脂類Δ 4-去飽和酶基因還包括可與序列號1的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交，且具有鞘氨醇類Δ4-去飽和酶活性的核酸?！皣?yán)謹(jǐn)條件下”是指在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交。具體地說，中度嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如根據(jù)DNA的長度，可由具有普通技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定?；緱l件包括使用如 Sambrook 等，Molecular Cloning ALaboratory Manual,第 3 版,第 6-7 章，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2001中所示且與硝酸纖維素膜有關(guān)的5X SSC、0. 5 % SDS、1. OmMEDTA (pH8. 0)的預(yù)洗滌溶液，約 40_50°C下、約 50% 甲酰胺、2XSSC-6XSSC[或約 42°C下的約50%甲酰胺中的Stark溶液(Stark's solution)等其他同樣的雜交溶液]的雜交條件，以及例如約40°C -60°C、0. 5-6XSSC、0. 1% SDS的洗滌條件。優(yōu)選中度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括約50°C、6XSSC的雜交條件(及洗滌條件)。高嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如也可根據(jù)DNA的長度， 由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。一般情況下，這樣的條件包括在比中度嚴(yán)謹(jǐn)條件更高的溫度和/或低的鹽濃度下的雜交(例如，約65°C、6XSSC 0. 2父55(，優(yōu)選6\55(，更優(yōu)選2\55(，最優(yōu)選0. 2 X SSC 的雜交)和/或洗滌，例如，定義為如上所述的雜交條件及同時(shí)伴隨約65°C -68
0. 2XSSC、0. 1% SDS的洗滌。雜交及洗滌的緩沖液中，可用SSPE(IXSSPE是0. 15M NaCl, IOmM NaH2PO4 及 1. 25mM EDTA、pH7. 4)代替 SSC (1 X SSC 是 0. 15M NaCl 及 15mM 檸檬酸鈉)， 洗滌在雜交結(jié)束后進(jìn)行15分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所周知并如以下進(jìn)一步所記載的那樣，應(yīng)如下理解為了通過應(yīng)用控制雜交反應(yīng)和雙鏈穩(wěn)定性的基本原理來達(dá)到所需程度的嚴(yán)謹(jǐn)性，可將洗滌溫度和洗滌鹽濃度根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整(例如，希望參照Sambrook等、2001)。使核酸與未知序列的目標(biāo)核酸雜交時(shí)，雜交的長度可假定為雜交核酸的長度。使已知序列的核酸雜交時(shí)，雜交的長度可通過聯(lián)配核酸的序列，鑒定具有最佳序列互補(bǔ)性的單數(shù)或多數(shù)區(qū)域來確定。預(yù)測為不足50個(gè)堿基對長度的雜交體的雜交溫度，必須比雜交體的解鏈溫度(Tm)低5-25°C，Tm則由以下公式確定。對于長度不足18個(gè)堿基對的雜交體，STmCC) = 2(A+T堿基數(shù))+4(G+C 堿基數(shù))。對于長度超過18個(gè)堿基對的雜交體，為Tm = 81. 5°C +16. 6 (Iog10 [Na+])+41 (摩爾分?jǐn)?shù)[G+C])-0. 63(%甲酰胺)-500/n，在此，N為雜交體中的堿基數(shù)，且[Na+]為雜交緩沖液中的鈉離子濃度(IX SSC的[Na+] = 0. 165M)。優(yōu)選這樣雜交的核酸分別有至少8個(gè)核苷酸(或更優(yōu)選為至少15個(gè)核苷酸、或至少20個(gè)核苷酸、或至少25個(gè)核苷酸、或至少30 個(gè)核苷酸、或至少40個(gè)核苷酸、或最優(yōu)選為至少50個(gè)核苷酸)、或具有其雜交的核酸長度的至少(更優(yōu)選為至少25%、或至少50%、或至少70%、且最優(yōu)選為至少80% )的長度， 與其雜交的核酸至少有50% (更優(yōu)選為至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%、至少97. 5%、或至少99%、且最優(yōu)選為至少99. 5% )的序列同一性。此處的序列同一性如上述詳細(xì)記載，通過比較以重復(fù)部分和同一性最大化、另外序列空位最小化的方式進(jìn)行聯(lián)配的雜交的核酸序列來確定。核酸同一性的百分?jǐn)?shù)可通過視覺檢查及數(shù)學(xué)計(jì)算來確定?；蛘?，2個(gè)核酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)，可通過目測檢查和數(shù)學(xué)計(jì)算來確定、或者更優(yōu)選該比較通過使用計(jì)算機(jī)程序比較序列信息來進(jìn)行。代表性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序?yàn)檫z傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(GCG ；威斯康星州麥迪遜)的威斯康星軟件包、10. 0版程序“GAP” (Devereux等、1984、Nucl. Acids Res. 12 387)。通過使用該“GAP”程序，除進(jìn)行2個(gè)核酸序列的比較以外，還可進(jìn)行2個(gè)氨基酸序列的比較、核酸序列和氨基酸序列的比較。在此，“GAP”程序的優(yōu)選默認(rèn)值中包含(1)對于核苷酸的(包括同一物為1、及非同一物為0的值)一元(unary)比較矩陣的GCG實(shí)行和Schwartz及Dayhoff監(jiān)修“多肽序列及結(jié)構(gòu)圖譜(Atlas ofPolyp印tide Sequence及 Structure) ”國立生物醫(yī)學(xué)研究財(cái)團(tuán)、353-358頁、1979記載的Gribskov及Burgess，Nucl. Acids Res. 14 :6745，1986的加權(quán)氨基酸比較矩陣；或其他可比較的比較矩陣；(2)對氨基酸的各空位追加30的罰分和對各空位中的各記號追加1的罰分；或?qū)塑账嵝蛄械母骺瘴蛔芳?0的罰分和對各空位中的各記號追加3的罰分；(3)對終端空位無罰分及(4)無對長空位的最大罰分。本領(lǐng)域技術(shù)人員所使用的其他序列比較程序中，例如，可使用通過國立醫(yī)學(xué)文庫的網(wǎng)站http//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/bl2seq/bls. html 的 BLASTN 禾呈 2. 7 版、或可使用WU-BLAST2. 0算法。對于WU-BLAST2. 0的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值的設(shè)定，在以下因特網(wǎng)網(wǎng)站http://blast. wustl. edu中有記載。且BLAST算法使用BL0SUM62氨基酸打分矩陣，可使用的選擇參數(shù)如下所示(A)包括用于將具有低組成復(fù)雜性的查詢序列的片段[由 Wootton 及 Federhen 的 SEG 程序(Computers and Chemistry, 1993)確定；也希望參照Wootton及Federhen，1996《序列數(shù)據(jù)庫中組成偏向區(qū)域的分析》(Analysis of compositionallybiased regions in sequence databases)Methods Enzymol. 266 544-71]、或短周期性的內(nèi)部重復(fù)組成的片段[Claverie及States由(Computers andChemistry,1993)的XNU程序確定]屏蔽的過濾，及⑶根據(jù)用于報(bào)告對數(shù)據(jù)庫序列的一致性的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性閾值、或根據(jù)E-分?jǐn)?shù)(Karlin及Altschul，1990)的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型，單純偶然發(fā)現(xiàn)的一致性的預(yù)期概率；源于某種一致性的統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異比E-分?jǐn)?shù)閾值大時(shí)，此一致性不被報(bào)告；優(yōu)選E-分?jǐn)?shù)閾值的數(shù)值為0. 5、或按優(yōu)選度增加的順序?yàn)?0.25,0.1,0.05,0.01,0.001,0.0001、le_5、le_10、le_15、le_20、le_25、le_30、le_40、 le-50、le-75、或 Ie-IOO0同樣，本發(fā)明的鞘脂類Δ4-去飽和酶基因(DESl)中包括因1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入或取代，而與序列號1的堿基序列不同，但編碼具有鞘脂類Δ4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)的核酸。只要編碼具有鞘脂類△ 4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)，對缺失、插入或取代的堿基數(shù)量無特別限制，但優(yōu)選為1個(gè) 幾千個(gè)、更優(yōu)選為1個(gè) 1千個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè) 500個(gè)、更進(jìn)一步優(yōu)選為1個(gè) 200個(gè)、最優(yōu)選為1個(gè) 100個(gè)。也可以通過例如具有同樣的物理化學(xué)特性的殘基來取代規(guī)定的氨基酸。在這種保守性取代的例子中，包括使1個(gè)脂肪族殘基相互取代，例如將lie、Val, Leu或Ala相互取代；Lys及Arg、Glu及Asp、或從Gln及Asn之間的1個(gè)極性殘基向其他殘基的取代；或用芳香族殘基的其他殘基取代，例如將Phe、Trp或Tyr相互取代。其他保守性取代，眾所周知的例如具有同樣疏水性特性的區(qū)域的全體取代。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過周知的基因工程的方法，使用Sambrook等(2001)(上述)等中記載的，例如定點(diǎn)誘變法，實(shí)施所需的缺失、插入或取代。酵母二氫神經(jīng)鞘M醇C4-羥某因(SUR2)本發(fā)明的方法包括作為構(gòu)成要素2)，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失。雖然沒有限制，但SUR2優(yōu)選編碼具有序列號6的氨基酸序列或序列號6中1個(gè)或 1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。SUR2優(yōu)選具有序列號5的堿基序列。其是編碼具有序列號6的氨基酸序列的酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http//www. yeastRenome. ors/)中公開。SUR2優(yōu)選編碼序列號6中記載的氨基酸序列，但并不限于此，也可具有1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號6具有同等功能的氨基酸序列，不限于序列號6?！鞍被嵬蛔儭睘? 多個(gè)，優(yōu)選1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，最優(yōu)選1 5 個(gè)。例如圖2或圖3所示，“具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性”是指，在二氫神經(jīng)鞘氨醇的C-4位導(dǎo)入羥基，合成植物鞘氨醇的活性，或者是指在二氫神經(jīng)酰胺的C-4位導(dǎo)入羥基，合成植物神經(jīng)酰胺的活性。本發(fā)明中，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通過使SUR2的表達(dá)部分或完全缺失，可部分或完全地抑制通過酵母天然代謝途徑合成的植物鞘氨醇和/或植物神經(jīng)酰胺的合成。通過SUR2基因表達(dá)的抑制和DESl基因的表達(dá)，可高效合成鞘氨醇和/或神經(jīng)酰胺NS。由SUR2編碼的氨基酸序列，與序列號6中記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選約80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)還包括可與序列號 5的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交，且具有酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性的核酸。同樣，在本發(fā)明的酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)中包括因1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入或取代，而與序列號5的堿基序列不同，但編碼具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)的核酸。對“氨基酸和/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸和/或堿基的同一性百分?jǐn)?shù)”、 雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共同事項(xiàng)，如在上述DESl中所述。鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)本發(fā)明的方法包括作為構(gòu)成要素3)，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)的表達(dá)缺失。
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如圖1-圖2所示，LCB4編碼具有鞘氨醇堿的磷酸化活性的蛋白質(zhì)。LCB4活性促進(jìn)鞘氨醇堿的磷酸化，使鞘氨醇堿在細(xì)胞內(nèi)的量減少。為了更加高效地生產(chǎn)人神經(jīng)酰胺，有效的方法是阻斷LCB4基因，而使鞘氨醇堿在細(xì)胞內(nèi)的量增加。所以，本發(fā)明包括使LCB4的表達(dá)缺失。雖然沒有限定，但LCB4優(yōu)選編碼具有序列號10的氨基酸序列或在序列號10中1 個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，并且具有鞘氨醇堿磷酸化活性的蛋白質(zhì)。LCB4優(yōu)選具有序列號9的堿基序列。其為編碼具有序列號10的氨基酸序列的酵母鞘氨醇堿磷酸化酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如已在S⑶(Saccharomyces Genome Database, http://www. yeastgenome. org/)中公開。LCB4優(yōu)選編碼序列號10記載的氨基酸序列。但是并不限定于此，也可具有1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有鞘氨醇堿磷酸化活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號10具有同等功能的氨基酸序列，并不限于序列號10。“氨基酸突變”為1 多個(gè)，優(yōu)選1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，最優(yōu)選1 5 個(gè)。如圖1-圖3所示，“具有鞘氨醇堿磷酸化活性”是指，具有將二氫神經(jīng)鞘氨醇進(jìn)行磷酸化從而合成二氫神經(jīng)鞘氨醇1磷酸的活性。在本發(fā)明中，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使LCB4 的表達(dá)部分或完全缺失，從而抑制不優(yōu)選的二氫神經(jīng)鞘氨醇的磷酸化。由LCB4編碼的氨基酸序列，與序列號10記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選約 80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)還包括與序列號9的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下可進(jìn)行雜交，并且具有酵母鞘氨醇堿磷酸化活性的核酸。同樣，本發(fā)明的酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)中包括因1個(gè)或多數(shù)堿基的缺失、插入或取代，而與序列號9的堿基序列不同，但編碼具有鞘氨醇堿磷酸化活性的蛋白質(zhì)的核酸。對于“氨基酸/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸和/或堿基的同一性百分?jǐn)?shù)”、 雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共同事項(xiàng)，如上述DESl中所述。酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因(SCS7)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括作為構(gòu)成要素4)，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。SCS7具有如下活性，即在與圖2或圖3的植物神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的鞘氨醇堿以酰胺鍵結(jié)合的脂肪酸α位的碳上附加羥基，合成各自的Cer (AP)、Cer (ASa)、Cer (AS)的活性。由于SCS7活性的存在，即使合成了所需二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS，但也會被進(jìn)一步羥化。因此，本發(fā)明優(yōu)選包括使SCS7 的表達(dá)缺失。雖然沒有限制，但SCS7優(yōu)選編碼具有序列號8的氨基酸序列或序列號8中1個(gè)或 1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶活性的蛋白質(zhì)。SCS7優(yōu)選具有序列號7的堿基序列。其是編碼具有序列號8的氨基酸序列的酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶蛋白質(zhì)的堿基序列，例如，已在S⑶(Saccharomyces Genome Databas e, http //www. yeastRenome. ors/)中公開。SCS7優(yōu)選編碼序列號8記載的氨基酸序列，但并不限于此，也可具有1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列。只要具有神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶活性，包括所有的同源蛋白質(zhì)。只要編碼與序列號8具有同等功能的氨基酸序列，不限于序列號8?！鞍被嵬蛔儭睘? 多個(gè)、優(yōu)選1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、最優(yōu)選1 5個(gè)。如圖7所示，“具有神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶活性”是指，具有在與植物神經(jīng)酰胺、二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的鞘氨醇堿以酰胺鍵結(jié)合的脂肪酸α位的碳上附加羥基，合成各自Cer(AP)、Cer (ASa)、Cer (AS)的活性。本發(fā)明中，優(yōu)選通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，通過使SCS7 的表達(dá)部分或完全地缺失，來抑制二氫神經(jīng)酰胺、神經(jīng)酰胺NS的不優(yōu)選的羥化。由SCS7編碼的氨基酸序列與序列號8中記載的氨基酸序列有至少約70%、優(yōu)選約 80%以上、更優(yōu)選90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選95%以上、最優(yōu)選98%以上的同一性。本發(fā)明的優(yōu)選酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)還包括可與序列號7的堿基序列在嚴(yán)謹(jǐn)條件下，例如在中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行雜交，且具有酵母神經(jīng)鞘脂類 α-羥化酶活性的核酸。同樣，在本發(fā)明的酵母神經(jīng)鞘脂類α _羥化酶基因(SCS7)中包括因1個(gè)或多個(gè)堿基發(fā)生缺失、插入或取代，而與序列號7的堿基序列不同，但編碼具有神經(jīng)鞘脂類α _羥化酶活性的蛋白質(zhì)的核酸。對于“氨基酸和/或堿基的缺失、附加、取代”、“氨基酸和/或堿基的同一性百分?jǐn)?shù)”、雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)條件下”等共同事項(xiàng)，如上述DESl中的記述。通過酵母轉(zhuǎn)化的基因的導(dǎo)入及表達(dá)方法在本發(fā)明中，酵母細(xì)胞內(nèi)的DES1表達(dá)不受限定，可使用公知方法進(jìn)行。優(yōu)選包括用包含DESl的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主酵母細(xì)胞，且在可使核酸表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。本發(fā)明的方法中可利用的酵母，雖然沒有限定，但優(yōu)選來自酵母屬 (Saccharomyces)的酵母。更優(yōu)選為釀酒酵母、巴斯德酵母、貝酵母、克魯維酵母。包括酵母屬的芽殖酵母在基因水平上的神經(jīng)酰胺的合成、代謝分析發(fā)展最快，因此，可使本發(fā)明的人神經(jīng)酰胺的制造方法迅速達(dá)到最佳化。并且因酵母細(xì)胞容易培養(yǎng)，還可用于傳統(tǒng)的食品制造，可確立簡便、安全、廉價(jià)地大量提取、精制神經(jīng)酰胺的方法。在本發(fā)明中為了進(jìn)行基因的導(dǎo)入、表達(dá)，可使用公知的酵母表達(dá)載體。本發(fā)明的實(shí)施例中，使用了公知的酵母用基因表達(dá)載體pRSseries(p4XX) (Mumberg et al.，Gene，156， 119，1995)及 pYE22m(Ashikariet al. ，Appl Microbiol Biotechnol，30，515，1989)。作為導(dǎo)入酵母時(shí)使用的載體，可使用多拷貝型(YEp型)、單拷貝型(YCp型)、染色體整合型(YIp 型)中的任一個(gè)。例如，YEp 型載體 YEp24(J. R. Broachet al. ,Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York, 83,1983)、YCp 型載體 YCp50 (M. D. Rose et al.，gene，60，237，1987)、YIp 型載體 YIp5 (K. Struhl et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76，1035，1979)等的多數(shù)酵母用表達(dá)載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知， 均可用于本發(fā)明的方法中。表達(dá)載體除各基因以外，一般在宿主中增殖，所以可包含在含有可選擇性標(biāo)記及復(fù)制起點(diǎn)的載體內(nèi)。進(jìn)一步優(yōu)選將來自酵母的適合的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控序列與所期望的本發(fā)明的核酸連接包含在載體中。調(diào)控序列的一例中，包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄及翻譯開始及終止的適合的序列。核苷酸序列在調(diào)控序列與該DNA序列功能性相關(guān)時(shí)，以可發(fā)揮功能的方式連接。因此，對于啟動(dòng)子核苷酸序列，如果該啟動(dòng)子核苷酸序列調(diào)節(jié)DNA序列的轉(zhuǎn)錄，以可發(fā)揮功能的方式與DNA序列連接。在宿主細(xì)胞中賦予復(fù)制能力的復(fù)制起點(diǎn)、及鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇基因通常加在表達(dá)載體中。作為選擇性標(biāo)記，可根據(jù)常法使用常用的標(biāo)記。例如四環(huán)素、氨芐青霉素、或卡那霉素或新霉素、潮霉素或壯觀霉素等的抗生素抗性基因及HIS3、TRPl等的營養(yǎng)缺陷型基因寸。在本法明的優(yōu)選方式中，1)導(dǎo)入鞘氨醇類Δ4-去飽和酶基因(DESl)時(shí)，也可使用含有各不相同的選擇性標(biāo)記的2種以上的DESl表達(dá)載體。例如在本說明書中的實(shí)施例 7中，使用含有尿嘧啶、色氨酸、賴氨酸3種不同的營養(yǎng)缺陷型選擇性標(biāo)記的3種表達(dá)載體時(shí)，發(fā)現(xiàn)酵母轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的生產(chǎn)量約增加至2倍。多數(shù)選擇性標(biāo)記并不限定于營養(yǎng)缺陷型基因，可將所期望的公知的選擇性標(biāo)記適當(dāng)組合使用。酵母載體經(jīng)常含有來自2μ酵母質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)序列、自主復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng)子區(qū)域、用于多聚腺苷化的序列、用于轉(zhuǎn)錄終止的序列、及可選擇的標(biāo)記基因。載體，可通過使用常法將所需基因連接到在本技術(shù)領(lǐng)域方便獲得的重組用載體 (例如，質(zhì)粒DNA等)中來制備。作為在質(zhì)粒等載體中整合基因的DNA片段的方法，例如可
Sambrook, J. ,and Russell,D. W. (2001). Molecular Cloning :A Laboratory Manual, 3rd ed. (New York :Cold SpringHarbor Laboratory Press)中所記載的方法等。簡便的方法，也可使用市售的連接試劑盒(例如，寶酒造制等)。作為將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，一般可例舉Sambrook，J.等(2001)(上述)中記載的磷酸鈣法或氯化鈣/氯化銣法、電穿孔法、電子注射法、PEG等化學(xué)處理的方法、使用基因槍等的方法等。通過酵母轉(zhuǎn)化的各基因的缺失方法本發(fā)明的方法包括，通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，2)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失；以及3)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)的表達(dá)缺失。本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括在優(yōu)選方式中，4)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。本發(fā)明中，使各基因的表達(dá)缺失是指由各基因編碼的蛋白質(zhì)的活性不能發(fā)揮。阻斷酵母細(xì)胞基因組上的各基因、抑制基因的轉(zhuǎn)錄、抑制從基因向蛋白質(zhì)的翻譯、蛋白質(zhì)即使被翻譯也抑制其活性發(fā)揮等，其結(jié)果由基因編碼的蛋白質(zhì)活性不能發(fā)揮時(shí)，因?yàn)檫_(dá)到了本發(fā)明方法中的目的，所以包含于本發(fā)明的范圍內(nèi)。缺失可以是部分缺失，也可以是完全缺失。典型的方法是阻斷母細(xì)胞基因組上的各基因，使基因部分或完全缺失。SUR2、LCB4、SCS7的各基因的表達(dá)缺失可通過公知的方法進(jìn)行。例如在本說明書的實(shí)施例中，通過使用連接了各基因的上游和下游的堿基序列、及選擇性標(biāo)記的DNA片段，與酵母天然基因組序列的同源重組，使各基因缺失?；虻淖钄?，可通過使參與靶基因中基因產(chǎn)物的表達(dá)的區(qū)域，例如編碼區(qū)域、啟動(dòng)子區(qū)域的內(nèi)部附加或缺失單一或多個(gè)堿基，或使這些區(qū)域的全體缺失來進(jìn)行。此種基因阻斷的方法可參照公知文獻(xiàn)[例如，參照Yeast 10,1793(1994)、Yeast 15,1541(1999)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76,4951 (1979), Methods in Enzymology, 101,202(1983)等]。除基因阻斷以外，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，作為抑制各基因表達(dá)的方法還可例舉反義法(例如參照平島及井上新生化學(xué)實(shí)驗(yàn)講座2核酸IV基因的復(fù)制和表達(dá)(日本生化學(xué)會編，東京化學(xué)同人)PP. 319-347,1993等)、RNAi法(參照日本特表2002-516062 號公報(bào)；美國專利公開公報(bào)第 2002/086356A 號；Nature Genetics, 24 (2)，180-183，2000 等)、酶性核酸的方法(參照 FEBS Lett. 228 :228，1988 ；FEBS Lett. 239 :285，1988 ；Nucl. Acids. Res. 17 :7059，1989 等)、共抑制法(例如參照 Smyth DR :Curr. Biol. 7 :R793，1997、 Martienssen R :Curr. Biol. 6 :810，1996 等)等。神經(jīng)酰胺合成的確認(rèn)方法根據(jù)本發(fā)明的方法制造出的人神經(jīng)酰胺(神經(jīng)酰胺NS)可使用公知方法提取、精制。本發(fā)明的方法因使用酵母細(xì)胞，所以可進(jìn)行大量的培養(yǎng)，可簡便且迅速地提取、精制神經(jīng)酰胺。經(jīng)精制的神經(jīng)酰胺，可使用公知的用于鞘氨醇類分析的方法來確認(rèn)。分析方法包括例如圖4所示的TLC、HPLC、質(zhì)譜(例如LC-MS、LC-MS/MS、FT-MS)等。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明的使用轉(zhuǎn)化酵母的神經(jīng)酰胺制造方法，可廉價(jià)地制造人體皮膚中功能性強(qiáng)的人神經(jīng)酰胺。


圖1表示酵母及高等動(dòng)物細(xì)胞中神經(jīng)鞘脂類的合成代謝途徑。圖2概略表示在酵母細(xì)胞內(nèi)制造本發(fā)明的人神經(jīng)酰胺的方法的優(yōu)選方式。圖3表示酵母及高等動(dòng)物的鞘氨醇類及神經(jīng)酰胺的分子種類及其結(jié)構(gòu)式。圖4模式化地表示從酵母菌體培養(yǎng)到TLC及HPLC分析的工序。圖5表示使用氚(3H)標(biāo)記的D-赤式-二氫神經(jīng)鞘氨醇的酵母的神經(jīng)酰胺的TLC 分析結(jié)果和使用生物影像分析儀(BAS)的放射能標(biāo)記神經(jīng)酰胺的定量結(jié)果。標(biāo)記時(shí)間為23 小時(shí)，溫度為250C ο從左開始，試樣1-3如以下所述。1. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3) +空載體2. SUR2/SCS7雙重阻斷(實(shí)施例3)+DESl基因表達(dá)3. SUR2/SCS7/LCB4三重阻斷(實(shí)施例4)+DESl基因表達(dá)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例以下根據(jù)實(shí)施例具體說明本發(fā)明，但這些并不限定本發(fā)明的技術(shù)范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本說明書的記載容易地對本發(fā)明加以修飾、變更，這些均包含于本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
I -.Kmmmm Δ 4-去飽,和_某因(DESl)表汰裁體的制各以已公開的數(shù)據(jù)庫中的人鞘氨醇類Δ 4-去飽和酶(sphingoid Δ 4-desaturase) 基因(DESl)的堿基序列(GenBanK :accession numberAF466375)(序列號 23、其中的 CDS 為序列號1)為參考，制備引物deslF(序列號11)及deslR(序列號12)。序列號11 5’ -CCTTCTCTAGAGGATCCATGGGGAGCCGCGTCTCGCGGGAAGAC-3，序列號12 5’ -CCTTCGAATTCCCCGGGCCAGGGGAGCTTCTGAGCATCACTGGTC-3’利用上述引物對，以人cDNA文庫為模板進(jìn)行PCR。利用所得到的PCR產(chǎn)物(約 1. Ikb)的BamHI和SmaI位點(diǎn)，克隆到酵母用基因表達(dá)載體pKOll (由Kamei et al.， J. Biol. Chem.，273，28341，1998 ；Dr. K. Tanaka 提供)上。根據(jù)雙脫氧測序法進(jìn)行堿基序列確定，確認(rèn)出克隆的堿基序列與數(shù)據(jù)庫一致。利用BamHI和Xhol位點(diǎn)，亞克隆到酵母用基因表達(dá)載體pRSseries (p4XX) (Mumberg et al.， Gene, 156，119，1995)上。t施例2 酵母二氡』神經(jīng)鞘M醇C4-羥某因(SUR2)陽斷株的制各以已公開的酵母基因組數(shù)據(jù)庫[SGD (Saccharomyces Genome Database, http //www, yeastgenome. org/) 1 中的酵母二S神經(jīng)鞘氨醇 C4-輕化酶(sphinganine C4-hydroxylase)基因(SUR2)的堿基序列(序列號5)和包含其上游及下游區(qū)域的序列(序列號3)為參考，制備引物sur2F(序列號13)及sur2R(序列號14)。序列號13 5 ’ -CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTCCGCACCAATTTTCACAGGAATTCCCGGGGATCCG G-3，序列號14:5’ -GGATAATAAATACAAACGTGGGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAGCAAGCTAGCTTGGCTGCA GG-3，利用上述引物對，以質(zhì)粒pYDp-L (Berben et al. , Yeast, 7,475,1991)為模板進(jìn)行 PCR,獲得了由SUR2基因上游295bp、選擇性標(biāo)記及SUR2基因下游75bp相連接的PCR產(chǎn)物。 使用此 PCR 產(chǎn)物，根據(jù)通常方法進(jìn)行 13 株(MATa，ura3，his3，leu2，lys2，trpl，barl-l) 的轉(zhuǎn)化，用營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2基因阻斷株。使用以使正常基因與阻斷基因擴(kuò)增的片段長度不同而設(shè)計(jì)的確認(rèn)用引物(序列號15及16)，通過PCR法進(jìn)行SUR2基因阻斷的確認(rèn)。序列號15 5，-CTCCGGCTTCTGCGGTTTTTCTTAGTCTTTC-3，序列號16 5’ -GGAAGTCGGAGACATTGCCTTTACCCAG-3，實(shí)施例3 酵母SUR2及酵母神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶基因(SCS7)雙重阻斷株的制備以公開的酵母基因組數(shù)據(jù)庫(S⑶)中的酵母神經(jīng)鞘脂類α _羥化酶 (Sphingolipid alpha-hydroxylase)基因(SCS7)的堿基序列(序列號7)和包含其上游及下游區(qū)域的序列(序列號4)為參考，制備引物SCS7up280F(序列號17)及SCS7up280R_ G418(序列號 18)、scs7down280F_G418(序列號 19)及 scs7down280R(序列號 20)。序列號17 5， -CGAATTCAGCCGAAAACAGTCTTGCTT-3，序列號18 5’ -CTCCATGTCGCTTACCACCGCTTTTAGTGC-3，序列號19 5’ -CGCTATACTGCAGCCTCGTCCAAAATTGTCA-3’序列號20:5，-CGAATTCTTGCCAACCTGATCTGTGAA-3，使用上述引物對，以根據(jù)通常方法制備的酵母基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得分別相當(dāng)于SCS7基因上流區(qū)域約280bp、下流區(qū)域約280bp的PCR產(chǎn)物。接著作為第二階段的PCR，將上述2種PCR片段混合，用G_50凝膠過濾柱(Quick Spin Columns for radiolabeled DNA purification，羅氏公司)將原有引物除去后，將帶 Geneticin(G418)抗性基因標(biāo)記的pFA6a_kanMX4(EMBL AJ002680)載體作為模板，用上述引物scs7up280F和scs7down280R的組合擴(kuò)增約2. 3kb的PCR片段。使用該最終PCR產(chǎn)物， 根據(jù)常法進(jìn)行實(shí)施例2記載的酵母SUR2阻斷株的轉(zhuǎn)化。用含有G418 300mg/L的YPD平板培養(yǎng)基(1%酵母膏、2%多聚蛋白胨、2%葡萄糖、2%瓊脂)篩選轉(zhuǎn)化體，獲得SUR2/SCS7雙重阻斷株。為了分析G418基因是否插入目標(biāo)部位且SCS7基因是否被阻斷，在SCS7基因上游制備引物SCS7 GD CheckF2(序列號21)，在G418基因內(nèi)制備引物G418 CheckR(序列號 22)。對于經(jīng)PCR有1. 2kb的片段擴(kuò)增的，確認(rèn)為基因阻斷株。序列號21:5’ -GCGCTGCATACATAGACATATACAC-3’序列號22:5， -ATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACA-3，實(shí)施例4 酵母SUR2、SCS7及酵母鞘氨醇激酶基因(LCB4)三重阻斷株的制備與實(shí)施例1 3相同，以公開的酵母基因組數(shù)據(jù)庫(SGD)中的鞘氨醇激酶基因(LCB4)(序列號9)和包含其上游及下游區(qū)域的序列(序列號24)的堿基序列為參考，制備引物L(fēng)CB4. KO-F(序列號25)及LCB4. KO-R(序列號26)。將帶His3標(biāo)記的質(zhì)粒 pYDp-H(Berben et al.在實(shí)施例3中引用)作為摸板，使用上述引物對進(jìn)行PCR，擴(kuò)增約 1. 2kb的片段。使用該P(yáng)CR產(chǎn)物，根據(jù)通常方法進(jìn)行實(shí)施例4記載的酵母SUR2/SCS7雙重阻斷株的轉(zhuǎn)化。用不含組氨酸的基本 完全平板培養(yǎng)基(SC-His)篩選，獲得SUR2/SCS7/LCB4 的三重阻斷株。序列號25:5’ -AGGTTATCAAGAACACAAAAGTCTAGCAGCGAAAAGTACGGAATTCCCGGGGATCCG-3’序列號26:5’ -AAGGACGCAACTTCCAAGTGAATGATTTAATGTGCATATATGAAGCTAGCTTGGCTGCAG-3’以使正?；蚺c阻斷基因中用PCR擴(kuò)增的片段的長度不同而設(shè)計(jì)引物L(fēng)CB4.K0C-F(序列號27)和LCB4. K0F_R(序列號28)，用PCR來確認(rèn)基因阻斷。序列號27:5， -GAAGAAAGGCATACAAGAAGGTGAAAATTCG-3，序列號28:5’ -TCTGGATAAAGAGAGTACGACTTCTAAGG-3'
_2] 實(shí)施仿I丨5 ^A DESl表汰HH本的營養(yǎng)缺陷型t示記由尿P密Pgg々力盧/賴的 2種載體的制備從實(shí)施例1記載的hDESl表達(dá)載體(phDESl)中將含有啟動(dòng)子、終止子的約1. 3kb 的hDESl基因片段用BamHI和XhoI酶解并切出，插入帶Trpl標(biāo)記的pRS424(2 μ) GPD載體 (Mumberg et al. ,GENE, 156,119-122,1995)的相同位點(diǎn)，構(gòu)建帶色氨酸標(biāo)記的hDESl表達(dá)載體(phDESlw)。與實(shí)施例1-4相同，以S⑶中的α -氨基己二酸還原酶(LYS2)和包含其上游及下游區(qū)域的堿基序列(序列號29)為參考，制備LYS2克隆用的引物L(fēng)YS2-PstI-F(序列號30) 及LYS2-SmaI-R(序列號31)。以根據(jù)通常方法制備的酵母基因組DNA作為模板，使用上述引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增約5. Ikb的片段。將獲得的片段首先亞克隆到pCR-Blimt II-TOPO載體上后，用限制性內(nèi)切酶PstI和SmaI酶解并切出約5. Ikb的Lys2片段，插入用PstI和NaeI 酶解實(shí)施例1記載的PhDESl而除去Ura3標(biāo)記的部分，構(gòu)建帶賴氨酸標(biāo)記的hDESl表達(dá)載體(phDESlk)。序列號30:5’ -ACTGCAGAATTCCGGCGGTTTTTCGCGTG-3’序列號31:5’ -ACCCGGGGATTTGTCTCAACCTGCTTTGG-3’實(shí)施例6帶人DESl表達(dá)質(zhì)粒的酵母SUR2、SCS7、LCB4三重阻斷株的制備將實(shí)施例1中制備的人DESl (hDESl)表達(dá)載體(phDESl)、實(shí)施例5中制備的 phDESlw和phDESlk轉(zhuǎn)化到酵母SUR2、SCS7、LCB4三重阻斷株中。轉(zhuǎn)化的方法根據(jù)通常方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化體的篩選，如果為PhDESl時(shí)，使用不含尿嘧啶的基本 完全平板培養(yǎng)基(SC-Ura)，如果使phDESl、phDESlw、phDESlk 3種同時(shí)表達(dá)時(shí)， 使用不含尿嘧啶·色氨酸·賴氨酸的基本·完全平板培養(yǎng)基(SC-Ura，Trp, Lys)。^MMT^ADEsi 類分析(1)親株 13 株;(2)實(shí)施例6中獲得的人DESl基因表達(dá)酵母(phDESl) SUR2、SCS7、LCB4三重阻斷株、以及(3)人 DESl 基因表達(dá)酵母(phDESl、phDESlw、phDESlk) SUR2、SCS7、LCB4 三重阻斷株將上述(1)、(2)及(3)的菌株在SC培養(yǎng)基上30°C下培養(yǎng)24小時(shí)。接著在37°C進(jìn)行90分鐘的熱激(heat shock)培養(yǎng)，根據(jù)文獻(xiàn)(Sperling eta L. ,Journal of Biological Chemistry, 273，28590，1998)，從菌體中提取鞘氨醇類，使其二硝基苯酚化。使用上述鞘氨醇類進(jìn)行薄層色譜法分析(TLC)、高效液相色譜法分析(HPLC)。以下簡略說明該方法。將菌體(濕重350mg)直接加入含有10 % (w/v) Ba (OH) 2的1，4_ 二噁烷/水 1 l(v/v)3ml中，在110°C水解24小時(shí)。通過用氯仿/1，4-二噁烷/水為8 3 8 (ν/ ν/ν)進(jìn)行分層分離從而提取游離的鞘氨醇類。用等量的0. IM Κ0Η,0. 5Μ KCl將有機(jī)層洗滌后，與0. 5% (ν/ν) 1-氟-2，4- 二硝基苯甲醇溶液0. 2ml和2M硼酸/K0H(pH10. 5) 0. 8ml在 60°C反應(yīng)30分鐘，使鞘氨醇類生成二硝基苯酚化合物(DNP化)。反應(yīng)后，對所回收的有機(jī)層進(jìn)行真空干燥而獲得的DNP化鞘氨醇類溶解于氯仿中，然后使用氯仿/甲醇為9 l(v/ ν)在硅膠60TLC板上展開。DNP化鞘氨醇類呈黃色(在UV照射下呈暗藍(lán)色)，對此進(jìn)行觀察。接著，從TLC板上回收DNP化Sphingoid，用氯仿/甲醇2 l(v/v)提取后，用氯仿/甲醇/0. IM KOH為2 1 1 (ν/ν/ν)進(jìn)行分層分離。將有機(jī)層進(jìn)行回收并真空干燥后，溶解于甲醇中作為HPLC試樣供給試驗(yàn)。HPLC使用硅膠ODS柱，進(jìn)行80%甲醇/乙腈 /2-丙醇(10 3 1，ν/ν/ν)、及從20%水到0%水的直線梯度洗脫(流速ImL/分鐘、40 分鐘)，檢測350nm下的紫外線吸收。為了便于理解，用圖4表示利用TLC、HPLC分析鞘氨醇類的流程圖。將對從Sigma公司購買的已經(jīng)定量的合成鞘氨醇進(jìn)行同樣分析的HPLC數(shù)據(jù)作為標(biāo)準(zhǔn)值，對菌體內(nèi)的鞘氨醇進(jìn)行定量。每IOOmg菌體內(nèi)蓄積的鞘氨醇的計(jì)算值為以下值。(1)親株 Π(113 株 0. 13μ g ；(2)人DESl基因表達(dá)酵母(phDESl) SUR2、SCS7、LCB4三重阻斷株27. 6 μ g ；以及(3)人 DESl 基因表達(dá)酵母(phDESl、phDESlw、phDESlk) SUR2、SCS7、LCB4 三重阻斷株 46. 2 μ g。^MM 8(3H) feiF.a^l D- ζ未式-二氡,神經(jīng)鞘氨1 享的神經(jīng)酉糾安的分析將上述神經(jīng)酰胺合成系統(tǒng)基因轉(zhuǎn)化酵母在基本液體培養(yǎng)基中25°C下以 150rpm振蕩培養(yǎng)23小時(shí)后，回收酵母，制備使其懸浮于基本液體培養(yǎng)基中的懸浮液 0. 5ml (160D_units/ml)。加入氚(3H)標(biāo)記的D-赤式-二氫神經(jīng)鞘氨醇10 μ 1 (10 μ Ci)， 在 25°C培養(yǎng)一夜(Zanolari et al.，The EMBO Journal，19，2824，2000)。加入 250mM 的 NaF和250mM的NaN3 200 μ 1，使反應(yīng)停止，然后用冰冷卻的滅菌水洗滌3次，使菌體懸浮于 66 μ 1的滅菌水中。在本懸浮液中加入玻璃珠，劇烈攪拌使菌體破碎。在其中加入氯仿、甲醇，使氯仿、 甲醇、懸浮液之比為10 10 3，提取脂質(zhì)。進(jìn)行提取液的離心分離，回收所得到的上清后，吹入氮?dú)馐蛊錆饪s干燥。將樣品溶解于100 μ 1的氯仿-甲醇-水(10 10 3)中， 加入0.6Ν NaOH甲醇溶液20μ 1，在30°C下反應(yīng)90分鐘后，用0.6Ν醋酸溶液中和。通過丁醇提取來除去鹽，吹入氮?dú)馐顾玫降亩〈紝?上層)濃縮干燥。將脂質(zhì)溶解于20 μ 1的氯仿-甲醇(1 1)中，在經(jīng)borate處理過的薄層色譜 (TLC)板上點(diǎn)樣，用氯仿-甲醇(9 1)展開(Triola et al. , MolecularPharmacology, 66，1671，2004)。展開后，用生物影像分析儀(BAS)分析放射能標(biāo)記神經(jīng)酰胺。結(jié)果如圖5 所示。僅在人DESl表達(dá)酵母SUR2/SCS7雙重阻斷株中不使DESl表達(dá)時(shí)，完全觀察不到神經(jīng)酰胺NS (CerNS) (0% )。人DESl表達(dá)酵母SUR2/SCS7雙重阻斷株的神經(jīng)酰胺NS (CerNS)為100%時(shí)，人DESl基因表達(dá)酵母SUR2/SCS7/LCB4三重阻斷株的神經(jīng)酰胺NS(CerNS)為 214%。
權(quán)利要求
1.一種制造方法，其為在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人神經(jīng)酰胺的方法，其特征在于，包括1)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入鞘氨醇類Δ4-去飽和酶基因(DESl)；2)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失；以及3)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)的表達(dá)缺失。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)編碼具有序列號10的氨基酸序列或序列號10中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘氨醇堿磷酸化活性的蛋白質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，鞘氨醇類△4-去飽和酶基因(DESl)編碼具有序列號2的氨基酸序列或序列號2中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有鞘氨醇類Δ4-去飽和酶活性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)編碼具有序列號6的氨基酸序列或序列號6中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，進(jìn)一步包括4)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因(SCS7)的表達(dá)缺失。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母神經(jīng)鞘脂類α-羥化酶基因 (SCS7)編碼具有序列號8的氨基酸序列或序列號8中1個(gè)或1個(gè)以上的氨基酸殘基發(fā)生缺失、附加或取代的氨基酸序列，且具有神經(jīng)鞘脂類α -羥化酶活性的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，酵母選自酵母屬的酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，1)導(dǎo)入鞘氨醇類Δ4-去飽和酶基因(DESl)時(shí)，使用含有各不相同的選擇性標(biāo)記的2種以上的DESl表達(dá)載體。
全文摘要
本發(fā)明提供在酵母細(xì)胞內(nèi)制造人神經(jīng)酰胺的方法。具體為，本發(fā)明的制造方法包括1)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入鞘氨醇類Δ4-去飽和酶基因(DES1)；2)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母二氫神經(jīng)鞘氨醇C4-羥化酶基因(SUR2)的表達(dá)缺失；以及3)通過酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，使酵母鞘氨醇堿磷酸化酶基因(LCB4)的表達(dá)缺失。
文檔編號C12N15/12GK102317466SQ200880018950
公開日2012年1月11日 申請日期2008年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日
發(fā)明者兒玉由紀(jì)子, 奧原宏明, 船戶耕一 申請人:三得利控股株式會社, 國立大學(xué)法人廣島大學(xué)