專(zhuān)利名稱(chēng)：：向ppp1r12c基因座的靶向整合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本公開(kāi)內(nèi)容屬于基因組工程的領(lǐng)域，尤其是向人類(lèi)PPP1R12C("p84"或"AAVS1")基因靶向整合的領(lǐng)域。背景基因組生物學(xué)中感興趣的主要方面，尤其鑒于對(duì)許多基因組的全核苦酸序列的測(cè)定，是將一種或多種感興趣的序列靶向整合到所需要的位置。已經(jīng)進(jìn)行了通過(guò)利用同源重組的自然現(xiàn)象在培養(yǎng)的細(xì)胞中改變基因組序列的嘗試。參見(jiàn)例如C叩ecchi(1989)5We"ce244:1288-1292;美國(guó)專(zhuān)利第6,528,313和6,528,314號(hào)。如果多核苷酸與含有有待改變的序列的基因組區(qū)域具有足夠的同源性，那么多核苷酸的部分或全部序列通過(guò)同源重組取代基因組序列是可能的。然而，在這些情況下，同源重組的頻率是極其低的。而且，在缺乏序列同源性的基因組位置，外源多核苷酸的插入的頻率超過(guò)靶向的同源重組的頻率若干數(shù)量級(jí)。Sedivy和Joyner(1992)7^rge"wg,OxfordUniversityPress,Oxford。在與外源多核苷酸具有同源性的基因組的區(qū)域中將雙鏈斷裂引入基因組DNA已顯示在培養(yǎng)的細(xì)胞中幾千倍地激發(fā)在這一位點(diǎn)的同源重組。Rouet等人(1994)Mo/.CW/.說(shuō)o/.14:8096-8106;Choulika等人(1995)Mo/.Ce〃.J5/o/.15:1968-1973;Donoho等人(1998)Mo/.Ce〃.所o/.18:4070-4078。還參見(jiàn)Johnson等人(2001)所0c/7ew.7>ww.29:196-201;和Yanez等人(1998)Gewe77zera/少5:149-159。在這些方法中，通過(guò)將大范圍核酸酶(即其識(shí)別序列非常大以致在感興趣的基因組中所述識(shí)別序列不存在或僅僅非常少地存在的內(nèi)切核酸酶)的識(shí)別位點(diǎn)插入所需要的基因組區(qū)域中來(lái)完成在所需要的基因組區(qū)域中的DNA切割。已經(jīng)描述了多種用于基因組DNA的靶向切割的方法和組合物。這些靶向切割事件可被用來(lái)例如誘導(dǎo)靶向的突變發(fā)生、誘導(dǎo)細(xì)胞DNA序列的耙向的缺失以及促進(jìn)在預(yù)定的染色體位點(diǎn)的靶向的重組。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474和20060188987,以及國(guó)際公布WO2007/014275，其公開(kāi)內(nèi)容適用于所有目的地通過(guò)引用全文并入本文。然而，仍有對(duì)于用于向基因組中安全港基因座(safeharborlocus)，尤其是非必需的內(nèi)源PPP1R12C(也稱(chēng)為p84和/或AAVSl)基因基因座的穩(wěn)定的靶向整合的組合物和方法的需要。概述本公開(kāi)內(nèi)容提供用于表達(dá)已經(jīng)整合至細(xì)胞中的PPP1R12C基因中的外源核酸序列的一種或多種產(chǎn)物(即蛋白或RNA分子)的方法和組合物。外源核酸序列可包括例如一種或多種基因或cDNA分子，或任何類(lèi)型的編碼或非編碼序列以及一種或多種控制元件(例如啟動(dòng)子)。此外，外源核酸序列可產(chǎn)生一種或多種RNA分子(例如小發(fā)夾RNA(shRNA)、抑制性RNA(RNAi)、小RNA(miRNA)等)。外源核酸序列被引入細(xì)胞中，使得它在位于染色體19上的PPP1Rl2C基因中被整合到細(xì)胞的基因組中。通過(guò)在PPP1R12C基因中的基因組的靶向的雙鏈切割促進(jìn)外源核酸序列向PPP1R12C基因的整合。通過(guò)使用含有鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域(cleavagehalf-domain)的融合蛋白將切割靶向至PPP1R12C基因，其中所述鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)成與PPP1R12C中的序列結(jié)合。這種切割促進(jìn)切割位點(diǎn)處或附近的外源多核苷酸序列的整合。外源序列的整合可通過(guò)同源性依賴(lài)和非同源性依賴(lài)的機(jī)制進(jìn)行。7在一個(gè)方面，本文公開(kāi)了設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，其結(jié)合PPP1R12C基因中的靶位點(diǎn)，所述設(shè)計(jì)的鋅指蛋白例如包括表1中所示的識(shí)別螺旋的任何設(shè)計(jì)的鋅指蛋白。在某些實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)的鋅指蛋白包括從N-末端至C-末端標(biāo)明為Fl至F4的四個(gè)鋅指，并且其中Fl-F4包括下列序列Fl:YNWHLQR(SEQIDNO:16);F2:RSDHLTT(SEQIDNO:8);F3:HNYARDC(SEQIDNO:9)和F4:QNSTRIG(SEQIDNO:15)。在其他的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)的鋅指蛋白包括標(biāo)明為Fl至F4的四個(gè)鋅指，并且其中Fl包括QSSNLAR(SEQIDNO:3);F2包括RTDYLVD(SEQIDNO:11);F3包括YNTHLTR(SEQIDNO:12);并且F4包括QGYNLAG(SEQIDNO:13)。在還有另外的實(shí)施方案中，本公開(kāi)內(nèi)容包括含有2或3個(gè)鋅指的設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，所述2或3個(gè)鋅指具有表1中所示的ZFN的識(shí)別螺旋。例如本文提供了包括從N-末端至C-末端標(biāo)明為Fl至F4的四個(gè)鋅指的設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，其中所述蛋白包括表1中所示的ZFN的任何一個(gè)的Fl、F2和F3;或F1、F3、F4;或F1、F2、F4;或F2、F3和F4;或Fl和F2;或F1和F3;或F1和F4;或F2和F3;或F2和F4;或F3和F4，并且其中其余的(reminaing)指包括與表l中所示的各個(gè)指序列不同的序列。本文所描述的鋅指蛋白中的任何一個(gè)還可包括功能結(jié)構(gòu)域，例如切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域(例如切割半結(jié)構(gòu)域是來(lái)自IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶諸如FoW或在另一個(gè)方面，本文公開(kāi)了用于在細(xì)胞中表達(dá)外源核酸序列的產(chǎn)物的方法，所述方法包括(a)在細(xì)胞中表達(dá)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被設(shè)計(jì)成與細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因中的第一靶位點(diǎn)結(jié)合；(b)在細(xì)胞中表達(dá)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因中的第二靶位點(diǎn)結(jié)合，其中第二耙位點(diǎn)與第一把位點(diǎn)不同；以及(c)將細(xì)胞與包括外源核酸序列和第一核苷酸序列的多核普酸接觸，所述第一核普酸序列與PPP1R12C基因中的第一序列同源；其中第一融合蛋白與第一靶位點(diǎn)的結(jié)合和第二融合蛋白與第二靶位點(diǎn)的結(jié)合定位切割半結(jié)構(gòu)域，使得細(xì)胞的基因組在PPP1R12C基因中被切割，由此導(dǎo)致外源序列在PPP1R12C基因中整合到細(xì)胞的基因組中并且表達(dá)外源序列的產(chǎn)物。外源核酸序列可包括具有或不具有一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子的編碼一個(gè)或多個(gè)功能多肽的序列(例如cDNA)和/或可產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)RNA序列(例如經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)shRNA表達(dá)盒)。在某些實(shí)施方案中，核酸序列包括編碼抗體、抗原、酶、生長(zhǎng)因子、受體(細(xì)胞表面或細(xì)胞核)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子、報(bào)道分子、上述任何一個(gè)的功能片段和上述的組合的無(wú)啟動(dòng)子序列。之后通過(guò)由內(nèi)源PPP1R12C啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄確保整合的序列的表達(dá)。在其他的實(shí)施方案中，"串聯(lián)的，，盒以此方式被整合到PPP1R12C基因座中，盒的第一組件包括如前文所描述的無(wú)啟動(dòng)子序列，之后是轉(zhuǎn)錄終止序列和編碼自主表達(dá)盒的第二序列。在某些實(shí)施方案中，多核普酸還包括第二核普酸序列，其與PPP1R12C基因中的第二序列同源。第二核苷酸序列可與PPP1R12C基因中的第二序列相同。此外，在包括第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的實(shí)施方案中，第一核香酸序列可與PPP1R12C基因中的第一序列相同，而第二核苷S臾序列可與PPP1R12C基因中的第二序列同源但不相同。在本文所描述的方法的任何一個(gè)中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列位于外源序列側(cè)面。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸是質(zhì)粒。在另外的實(shí)施方案中，多核苷酸是線(xiàn)狀DNA分子。在另一個(gè)方面中，本文提供了用于將外源序列整合到細(xì)胞的基因組中的PPP1R12C基因中的方法，所述方法包括(a)在細(xì)胞中表達(dá)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被設(shè)計(jì)成與細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因座中的第一靶位點(diǎn)結(jié)合；(b)在細(xì)胞中表達(dá)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二切對(duì)半結(jié)構(gòu)域，其中所述第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因座中的第二靶位點(diǎn)結(jié)合，其中第二耙位點(diǎn)與第一把位點(diǎn)不同；以及(c)將細(xì)胞與包括外源核酸序列的多核苷酸接觸；其中第一融合蛋白與第一靶位點(diǎn)的結(jié)合和第二融合蛋白與第二靶位點(diǎn)的結(jié)合定位切割半結(jié)構(gòu)域，使得細(xì)胞的基因組在PPP1R12C基合到細(xì)胞的基因組中。在某些實(shí)施方案中，編碼功能多肽的外源序列被插入到PPP1R12C基因中。在本文描述的方法的任何一個(gè)中，第一切割半結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域來(lái)自IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶，例如FoW或5^1。此外，在本文描述的方法的任何一個(gè)中，融合蛋白中的至少一個(gè)可包括切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化界面的氨基酸序列中的改變，例如使得切割半結(jié)構(gòu)域的專(zhuān)性異源二聚體(obligateheterodimer)形成。在本文描述的方法的任何一個(gè)中，細(xì)胞可是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，人類(lèi)細(xì)胞。此外，細(xì)胞可被停滯在細(xì)胞周期的G2期。另外，在本文描述的方法的任何一個(gè)中，第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可包括具有表1中展示的識(shí)別螺旋的鋅指蛋白(例如其中所使用的ZFN對(duì)包括ZFN15556和ZFN15590的方法)。因此本主題包括但不限于以下實(shí)施方案1.一種用于在細(xì)胞中表達(dá)外源核酸序列的產(chǎn)物的方法，所述方法包括'(a)在細(xì)胞中表達(dá)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第一鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被設(shè)計(jì)成與細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因中的第一靶位點(diǎn)結(jié)合；(b)在細(xì)胞中表達(dá)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞的基因組的PPP1Rl2C基因中的第二靶位點(diǎn)結(jié)合，其中第二靶位點(diǎn)與第一靶位點(diǎn)不同；以及(c)將細(xì)胞與包括外源核酸序列的多核苷酸接觸；其中第一融合蛋白與第一靶位點(diǎn)的結(jié)合和第二融合蛋白與第二把位點(diǎn)的結(jié)合定位切割半結(jié)構(gòu)域，使得細(xì)胞的基因組在PPP1R12C基因中被切割，由此導(dǎo)致外源序列在PPP1R12C基因中同源性依賴(lài)的整合到細(xì)胞的基因組中并表達(dá)外源序列的產(chǎn)物。2.如l所述的方法，其中所述外源核酸序列編碼多肽。3.如2所述的方法，其中所述多肽選自由抗體、抗原、酶、生長(zhǎng)因子、受體(細(xì)胞表面或細(xì)胞核)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子、報(bào)道分子、其功能片段和其組合所組成的組。4.如1至3中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源序列還包括啟動(dòng)子。5.如4所述的方法，其中所述多核苷酸還包括第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列與PPP1R12C基因中的第一序列同源但不相同。6.如5所述的方法，其中所述多核苷酸還包括第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列與PPP1R12C基因中的第二序列同源但不相同。7.如6所述的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核芬酸序列位于外源序列側(cè)面。8.如1至7中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多核苷酸是質(zhì)粒。9.如l所述的方法，其中所述多核苷酸是線(xiàn)狀DNA分子。10.如1至9中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一切割半結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域來(lái)自IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。11.如10所述的方法，其中所述IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶選自由FoW和5^I組成的組。12.如1至12中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞被停滯在細(xì)胞周期的G2期。13.如1至11中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述融合蛋白中的至少一個(gè)包括切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化界面的氨基酸序列中的改變。14.如1至13所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。15.如14所述的方法，其中所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。附圖簡(jiǎn)述圖1是描述鋅指核酸酶(ZFN)驅(qū)動(dòng)的向PPP1R12C基因的靶向插入中所涉及的各種多核苷酸組件的示意圖。參見(jiàn)，實(shí)施例1。頂部的線(xiàn)描述內(nèi)源PPP1R12C基因座，包括示例性ZFN靶位點(diǎn)和與編碼GFP的示例性質(zhì)粒供體同源的區(qū)域。中部的線(xiàn)描述環(huán)狀GFP質(zhì)粒供體。當(dāng)ZFN存在時(shí)，如底部的示意圖所示，質(zhì)粒供體上攜帶的GFP編碼序列被插入PPP1R12C基因中。圖中展示的實(shí)施方案允許所整合的GFP開(kāi)放讀碼框的轉(zhuǎn)錄和其隨后通過(guò)整合剪接受體(SA)位點(diǎn)的翻譯，之后是翻譯中斷-再啟動(dòng)信號(hào)(2A;Fang等人(2005)A^S/ofec/z.23:584),之后是GFP開(kāi)放讀碼框，以及多腺苷酸化信號(hào)。圖2圖示描述染色體19(頂部的線(xiàn))和染色體19中PPPlR12C/p84的位置(中部的線(xiàn))。示例性的ZFN結(jié)合位點(diǎn)示于底部的線(xiàn)上的PPP1R12C的內(nèi)含子1。圖3，圖A、B和C，描述靶向整合測(cè)定，所述靶向整合測(cè)定評(píng)估圖1中所示的供體多核苷酸單獨(dú)(標(biāo)記為"供體單獨(dú)"的泳道)或供體多核苷酸和靶向PPP1R12C的ZFN(標(biāo)記為"供體+ZFN"的泳道)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中GFPORF的整合。圖3A顯示K562細(xì)胞中的結(jié)果。圖3B顯示293T細(xì)胞中的結(jié)果；以及圖3C顯示Hep3B細(xì)胞中的結(jié)果。圖4，圖A至F,描述如FACS所評(píng)估的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。圖4A描述僅用GFP供體轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖4B描述用GFP供體和靶向PPP1R12C的ZFN轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖4C描述僅用GFP供體轉(zhuǎn)染的293T細(xì)月包中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖4D描述用GFP供體和靶向PPP1R12C的ZFN轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖4E描述僅用GFP供體轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖4F描述用GFP供體和靶向PPP1R12C的ZFN轉(zhuǎn)染的Hep3B細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。圖5是描述在標(biāo)明的細(xì)胞類(lèi)型中PPPlR12C/p84mRNA表達(dá)的圖解。PPP1R12C/18S標(biāo)明PPP1R12C基因座相對(duì)于18S的表達(dá)，而PPP1R12C/GAPDH標(biāo)明相對(duì)于GAPDH的表達(dá)的表達(dá)。圖6描述當(dāng)標(biāo)明的ZFN存在或不存在時(shí)供體多核苷酸向PPPlR12C/p84基因座中的整合。整合百分比示于每泳道之下。泳道1顯示陰性對(duì)照(無(wú)ZFN)。泳道2顯示用ZFN對(duì)15554/15587轉(zhuǎn)染的細(xì)^/,泳道3顯示用ZFN對(duì)15554/15590轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；泳道4顯示用ZFN對(duì)15556/15587轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;泳道5顯示用ZFN對(duì)15556/15590轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;泳道6顯示用ZFN對(duì)15557/15587轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；泳道7顯示用ZFN對(duì)15557/15590轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；以及泳道8顯示用ZFN對(duì)9931/10099轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；ZFN對(duì)示于表1中。圖7，圖A和B，描述ZFN介導(dǎo)的無(wú)啟動(dòng)子GFPORF的插入。圖7A是描述GFPORF向由ZFN切割的區(qū)域的整合和mRNA表達(dá)的示意圖。圖7B描述GFPORF在ZFN不存在(泳道1)或存在(泳道2)的條件下的插入。具有在ZFN存在(泳道2)的條件下整合的GFPORF的細(xì)胞的百分比(9.6%)標(biāo)明于泳道2之下。圖8，圖A至E，描述含有啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄單位(PTU)的供體的整合。圖8A顯示當(dāng)由內(nèi)源p84啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)時(shí)，K562細(xì)胞中GFP的表達(dá)的表觀(guān)遺傳的穩(wěn)定性。顯示了在無(wú)選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的25天內(nèi)(大約30次細(xì)胞倍增)所測(cè)量的GFP陽(yáng)性細(xì)胞池(十字)、由有限的稀釋得到的在p84處對(duì)于GFPORF來(lái)說(shuō)純合的(正方形)和雜合的(三角形)克隆的平均熒光強(qiáng)度(MFI)。也顯示了未轉(zhuǎn)化的K562(菱形)。圖8B描述顯示除了GFPORF篩選標(biāo)記(screeningmarker)之外shRNA表達(dá)盒整合的串聯(lián)的"標(biāo)記-PTU"加入過(guò)程的圖解示意圖。圖8C描述使用ZFN轉(zhuǎn)移至p84基因座的PTU的有效的長(zhǎng)期功能。如圖8C中圖示描述的，細(xì)胞(按照?qǐng)D中出現(xiàn)的順序)為被留下未作處理，用編碼抗CD58的質(zhì)粒的shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或用ZFN和供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。使用抗CD58的抗體通過(guò)免疫焚光和FACS測(cè)定細(xì)胞表面上CD58的表達(dá)。圖8D描述p84處細(xì)胞雙轉(zhuǎn)基因的FACS染色概況。圖8E描述對(duì)僅攜帶GFPORF(中間泳道)或攜帶與編碼抗CD58的shRNA的PTU串聯(lián)的GFPORF(右泳道)的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的以定量PCR為基礎(chǔ)的測(cè)定的結(jié)果。數(shù)目表示已經(jīng)被修飾的群體的百分比。圖9,圖A和B，描述ZFN作用的全核(nucleus-wide)分子細(xì)胞學(xué)測(cè)量。圖9A是顯示由IL2RY靶向和p84靶向的ZFN在它們預(yù)期的基因座驅(qū)動(dòng)的基因組編輯效率的對(duì)比的凝膠的再現(xiàn)。用標(biāo)明的試劑轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞。靶基因座處的基因斷裂頻率通過(guò)SurveyorTM內(nèi)切核酸酶如Miller等人(2007)Ato.5w&c/wo/.25(7):778-785所描述的測(cè)定并標(biāo)明在適當(dāng)?shù)挠镜乐?。圖9B是描述使用如Miller等人(2007)Ato.S/o&c/mo/.25(7):778-785中所描述的基于FACS的測(cè)定在如標(biāo)明的處理的細(xì)胞中的總的全核水平的H2A.X染色的圖解。詳述本公開(kāi)內(nèi)容涉及用于向位于染色體19上的人類(lèi)PPP1R12C基因靶向整合(TI)的方法和組合物。PPP1R12C是腺伴隨病毒向人類(lèi)基因組整合的主要位點(diǎn)并且沒(méi)有病理生理學(xué)事件已經(jīng)與AAV感染相關(guān)(Warrington&Herzog(2006)//wwGe"ef119:571-603)，表明PPP1R12C功能的丟失為人類(lèi)細(xì)胞所耐受并且這一基因座可被認(rèn)為是靶向整合的"安全港"。而且，PPP1R12C基因是廣泛轉(zhuǎn)錄的。因此，插入的(供體)序列可是無(wú)啟動(dòng)子的并且整合的開(kāi)放讀碼框的轉(zhuǎn)錄可由內(nèi)源基因啟動(dòng)子產(chǎn)生，其降低了由于供體的隨機(jī)整合和/或經(jīng)由供體所攜帶的啟動(dòng)子的內(nèi)源基因假性活化而引起的嚴(yán)重的不良事件的可能性(參見(jiàn)，例如Kohn等人Waf/evCa"cw3:477-488)。用于向PPP1R12C基因靶向切割和重組的組合物包括融合蛋白、編碼這些蛋白的多核苷酸以及多肽和編碼多肽的多核苷酸的組合，所述融合蛋白含有切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)和鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可含有一個(gè)或多個(gè)鋅指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多鋅指)并且可被設(shè)計(jì)成與PPP1R12C中的任何序列結(jié)合。細(xì)胞中這樣的融合蛋白(或蛋白)的存在將導(dǎo)致融合蛋白與它(它們)的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合以及內(nèi)源PPP1R12C基因中的切割。概況本發(fā)明的實(shí)踐，以及本文公開(kāi)的組合物的制備和使用，除非另有說(shuō)明，使用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、計(jì)算化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA和也在本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)的相關(guān)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中被充分說(shuō)明。參見(jiàn)例如Sambrook等人MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989和第三版，2001;Ausubel等人，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(分子生物學(xué)中的通用規(guī)程)，JohnWiley&Sons,NewYork,1987和定期更新；METHODSINENZYMOLOGY(酶學(xué)方法)系列，AcademicPress,SanDiego;Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION(染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能)，第三版，AcademicPress,SanDiego,1998;METHODSINENZYMOLOGY(酶學(xué)方法)，304巻，"Chromatin(染色質(zhì))，，(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe，編輯)，AcademicPress,SanDiego，1999和METHODSINMOLECULARBIOLOGY(分子生物學(xué)方法)，119巻，"ChromatinProtocols(染色質(zhì)頭見(jiàn)程)"(RB.Becker編輯)HumanaPress,Totowa，1999。定義術(shù)語(yǔ)"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互換使用并是指線(xiàn)狀或環(huán)狀構(gòu)象以及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，這些術(shù)語(yǔ)不被理解為在有關(guān)聚合物長(zhǎng)度的方面限制。該術(shù)語(yǔ)可包括天然的核苷酸的已知的類(lèi)似物，以及在堿基、糖和/或磷酸部分被修飾的核苷酸(例如硫代磷酸酯主鏈)。通常，特定的核苷酸的類(lèi)似物具有相同的堿基配對(duì)特異性；即A的類(lèi)似物將與T堿基配對(duì)。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽，，和"蛋白"可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)還適用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的化學(xué)類(lèi)似物或修飾的衍生物的氨基酸聚合物。"結(jié)合"是指大分子之間(例如蛋白和核酸之間)序列特異的、非共價(jià)的相互作用。只要相互作用作為一個(gè)整體是序列特異的即可，并非結(jié)合相互作用的所有組件都需要是序列特異的(例如與DNA主鏈中的磷酸殘基的接觸)。這種相互作用通常以10"NT'或更低的解離常數(shù)(Kd)為特征。"親和性"是指結(jié)合的強(qiáng)度增加的結(jié)合親和性與較低的Kd有關(guān)。"結(jié)合蛋白"是能夠與另一個(gè)分子非共價(jià)結(jié)合的蛋白。結(jié)合蛋白可與例如DNA分子(DNA結(jié)合蛋白)、RNA分子(RNA結(jié)合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白結(jié)合蛋白)結(jié)合。在蛋白結(jié)合蛋白情況下，它可與自身結(jié)合(以形成同型二聚體、同型三聚體等)和/或它可與不同蛋白或多個(gè)不同蛋白的一個(gè)或多個(gè)分子結(jié)合。結(jié)合蛋白可具有多于一種類(lèi)型的結(jié)合活性。例如鋅指蛋白具有DNA結(jié)合、RNA結(jié)合和蛋白結(jié)合活性。"鋅指DNA結(jié)合蛋白"(或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)是蛋白或者較大蛋白中的結(jié)構(gòu)域，其以序列特異的方式通過(guò)一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合DNA,鋅指是結(jié)合結(jié)構(gòu)域中其結(jié)構(gòu)通過(guò)鋅離子配位而被穩(wěn)定的氨基S臾序列區(qū)域。術(shù)語(yǔ)鋅指DNA結(jié)合蛋白常常被縮寫(xiě)為鋅指蛋白或ZFP。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被"設(shè)計(jì)"成與預(yù)定的核苷酸序列結(jié)合。用于設(shè)計(jì)鋅指蛋白的方法的非限制性的實(shí)例是設(shè)計(jì)和選擇。設(shè)計(jì)的鋅指蛋白是自然界中不存在的蛋白，其設(shè)計(jì)/組成主要產(chǎn)生自合理標(biāo)準(zhǔn)。設(shè)計(jì)的合理標(biāo)準(zhǔn)包括取代規(guī)則和用于處理在儲(chǔ)存已有的ZFP設(shè)計(jì)和結(jié)合數(shù)據(jù)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)中的信息的計(jì)算機(jī)算法的應(yīng)用。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利6,140,081、6,453,242和6,534,261;還參見(jiàn)WO98/53058、WO98/53059、WO98/53060、WO02/016536和WO03/016496。"選擇的"鋅指蛋白是在自然界中找不到的蛋白，其產(chǎn)生主要來(lái)自于實(shí)驗(yàn)處理例如噬菌體展示、相互作用陷阱或雜交體選擇。參見(jiàn)例如us5,789,538、US5,925,523、US6,007,988、US6,013,453、US6,200,759、WO95/1943、WO96/06166、WO98/53057、WO98/54311、WO00/27878、WO01/60970WO01/88197和WO02/099084。術(shù)語(yǔ)"序列"是指任何長(zhǎng)度的核苷酸序列，其可是DNA或RNA;可是線(xiàn)狀、環(huán)狀或分枝的并且可是單鏈或雙鏈的。術(shù)語(yǔ)"供體序列，，是指插入基因組的核苷酸序列。供體序列可具有任何長(zhǎng)度，例如長(zhǎng)度為2和10,000核苷酸之間(或其間或其上的任何整數(shù)值)，優(yōu)選地長(zhǎng)度為約100和1,000核苷酸之間(或其間的任何整數(shù))，更優(yōu)選長(zhǎng)度為約200和500核苷酸之間。"同源但不相同的序列，，是指與第二序列分享一定程度的序列同一性的第一序列，但是其序列與第二序列的序列不相同。例如，含有突變基因的野生型序列的多核苦酸與突變基因的序列是同源但不相同的。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)序列之間的同源性的程度足以允許其間利用正常的細(xì)胞機(jī)源性的程度可小至一個(gè)核苷酸(例如，為了通過(guò)靶向同源重組修正基因組點(diǎn)突變)或大至10或更多千堿基(例如為在染色體中的預(yù)定的異位位點(diǎn)插入基因)。含有同源但不相同的序列的兩個(gè)多核香酸不必為相同長(zhǎng)度。例如，可使用20和10，000核苷酸或核苷酸對(duì)之間的外源多核苷酸(即供體多核苷酸)。用于測(cè)定核酸和氨基酸序列的同一性的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。通常，這些技術(shù)包括測(cè)定基因的mRNA的核香酸序列和/或測(cè)定其編碼的氨基酸序列并將這些序列與第二核苷酸或氨基酸序列對(duì)比?；蚪M序列也可以這一方式被測(cè)定和對(duì)比。通常，同一性分別是指兩個(gè)多核苷酸或多肽序列的精確的核苷酸對(duì)核苷酸或氨基酸對(duì)氨基酸的一致性。兩個(gè)或更多個(gè)序列(多核苷酸或氨基酸)可通過(guò)測(cè)定它們的百分比同一性而被對(duì)比。無(wú)論核酸還是氨基酸序列，兩個(gè)序列的同一性百分比是兩個(gè)比對(duì)序列之間的精確匹配數(shù)除以較短的序列的長(zhǎng)度并乘以100的數(shù)目。核酸序列的近似的序列只于比是由Smith和"Waterman,AdvancesinAppliedMathematics(應(yīng)用凄丈學(xué)進(jìn)展)2:482-489(1981)的局部同源性算法提供的。這一算法可通過(guò)使用由Dayhoff,AtlasofProteinS叫uencesandStructure(蛋白序列和結(jié)構(gòu)的地圖集),MO.Dayhoff編輯,，第5次增補(bǔ).3:353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,D.C,USA開(kāi)發(fā)并由Gribskov,Nucl.AcidsRes.14(6):6745-6763(1986)標(biāo)準(zhǔn)化的得分矩陣而應(yīng)用到氨基酸序列。這一算法測(cè)定序列的同一性百分比的示例性實(shí)施是由GeneticsComputerGroup(Madison,WI)在"BestFit"發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)中提供的。這一方法的默認(rèn)參數(shù)描述于WisconsinSequenceAnalysisPackageProgramManual(Wisconsin序列分析程序包手冊(cè))，第8版(1995)(可從GeneticsComputerGroup,MadisonWI獲得)。在本公開(kāi)內(nèi)容的背景下，建立同一性百分比的優(yōu)選的方法是使用UniversityofEdinburgh版權(quán)的JohnF.Collins和ShaneS.Sturrok開(kāi)發(fā)并由IntelliGenetics，Inc.(MountainView,CA)發(fā)布的MPSRCH程序包。根據(jù)這一套程序包，Smith-Waterman算法可在默認(rèn)參數(shù)被用于記分臺(tái)時(shí)(例如空位開(kāi)放罰分12、空位延伸罰分1和空位6)使用。根據(jù)所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，"匹配"值反映了序列同一性。用于計(jì)算序列間同一性百分比或相似性的其他的適合的程序一般是本領(lǐng)域已知的，例如，另一種序列比對(duì)程序是BLAST,以默認(rèn)參數(shù)使用。例如，BLASTN和BLASTP可通過(guò)采用下列默認(rèn)參數(shù)而使用遺傳密碼-標(biāo)準(zhǔn)、過(guò)濾器=無(wú)、鏈=兩者、臨界值=60、預(yù)期值=10、矩陣-BLOSUM62、描述=50個(gè)序列、分類(lèi)依據(jù)=高分、數(shù)據(jù)庫(kù)=非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻譯+Swissprotein+Spupdate+PIR。這些程序的細(xì)節(jié)可在因特網(wǎng)上找到。關(guān)于本文所描述的序列，序列同一性的所期望的程度的范圍是大約80%至100%以及其中任何整數(shù)值。通常序列間的同一性百分比為至少70-75%,優(yōu)選地80-82%，更優(yōu)選地85-90%,甚至更優(yōu)選地92%,還更優(yōu)選地95%和最優(yōu)選地98%的序列同一性。穩(wěn)定的雙鏈體形成的條件下多核苷酸的雜交，之后是使用單鏈特異性核酸酶的消化和所消化片段的大小測(cè)定來(lái)測(cè)定。如使用上文的方法所測(cè)定的，當(dāng)序列在確定的分子長(zhǎng)度上顯示出至少約70%-75%,優(yōu)選地80%-82%，更優(yōu)選地85%-90%,甚至更優(yōu)選地92%，還更優(yōu)選地95%和最優(yōu)選地98%的序列同一性時(shí)，兩個(gè)核酸或兩個(gè)多肽序列是彼此大致同源的。如本文所用的，大致同源還指顯示出與特定的DNA或多肽序列的完全同一性的序列。大致同源的DNA序列可在DNA雜交實(shí)驗(yàn)中在例如如對(duì)特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)格條件下被識(shí)別。確定適當(dāng)?shù)碾s交條件屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。參見(jiàn)例如Sambrook等人，如上；NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(核酸雜交實(shí)用方法),B.D.Hames和S丄Higgins編輯，(1985)Oxford;Washington,DC;IRLPress)。兩個(gè)核酸片段的選擇性雜交可被如下測(cè)定。兩個(gè)核酸分子之間的序列同一性的程度影響這些分子之間的雜交事件的效率和強(qiáng)度。部分相同的核酸序列將至少部分地抑制完全相同的序列與靶分子的雜交。完全相同的序列的雜交的抑制可使用本領(lǐng)域熟知的雜交測(cè)定來(lái)評(píng)定(例如Southern(DNA)印跡、Northern(RNA)印跡、溶液雜交或類(lèi)似技術(shù)，參見(jiàn)Sambrook，等人，Mo/ecw/arC7om."g:^丄a6orato^yMawwa/(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。這種測(cè)定可使用不同程度的選擇性，例如使用從低嚴(yán)格性到高嚴(yán)格性變化的條件來(lái)進(jìn)行。如果使用了低嚴(yán)格性級(jí)探針(例如，與靶分子具有少于約30%序列同一性的探針)來(lái)評(píng)定，這樣，缺少非特異性結(jié)合事件的情況下，次級(jí)探針將不與靶雜交。當(dāng)使用基于雜交的檢測(cè)系統(tǒng)時(shí)，選擇與參照核酸序列互補(bǔ)的核酸探針，并且隨后通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)臈l件，探針和參照序列彼此選擇性地雜交或結(jié)合以形成雙鏈體分子。能夠選擇性地與參照序列在適度嚴(yán)格的雜交條件下選擇性雜交的核酸分子通常在允許檢測(cè)長(zhǎng)度為至少約10-14個(gè)核苷酸的與所選擇的核酸探針的序列具有至少約70%的序列同一性的耙核酸序列的條件下雜交。嚴(yán)格雜交條件通常允許檢測(cè)長(zhǎng)度為至少約10-14個(gè)核苷酸的與所選擇的核酸探針的序列具有高于約90-95%的序列同一性的耙核酸序列。當(dāng)探針和參照序列具有特定程度的序列同一性時(shí)，用于探針/參照序列雜交的雜交條件可如本領(lǐng)域中已知的被確定(參見(jiàn)，例如，NucleicAcidHybridization:APracticalApproach(核酸雜交實(shí)用方法)，B.D.Hames和S.J.Higgins編輯，(1985)Oxford;Washington,DC;IRLPress)。用于雜交的條件是本領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員熟知的。雜交嚴(yán)格性是指雜交條件不適于含有錯(cuò)配核苷酸的雜交體的形成的程度，較高的嚴(yán)格性與對(duì)錯(cuò)配雜交體的較低的耐受性相關(guān)。影響雜交的嚴(yán)格性的因素是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員熟知的，并且包括但不限于溫度、pH、離子強(qiáng)度和有機(jī)溶劑例如曱酰胺和二曱基亞砜的濃度。如本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的，雜交的嚴(yán)格性隨更高的溫度、更低的離子強(qiáng)度和更低的溶劑濃度而升高。關(guān)于雜交的嚴(yán)格性條件，本領(lǐng)域內(nèi)熟知的是通過(guò)變化例如下列因素，許多等效條件可被用于建立特定的嚴(yán)格性序列的長(zhǎng)度和性質(zhì)，不同序列的堿基組成、鹽和其他雜交溶液成分的濃度，雜交溶液中存在或不存在封閉劑(例如硫酸葡聚糖和聚乙二醇)，雜交反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù)，以及改變清洗條件。一套特定雜交條件的選擇是按照本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法選擇的(參見(jiàn)例如Sambrook,等人，MolecularCloning;:ALaboratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))，第二版(1989)ColdSpringHarbor,N.Y.)。"重組"是指兩個(gè)多核苷酸之間互換遺傳信息的過(guò)程。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，"同源重組(HR)"是指在例如細(xì)胞中雙鏈斷裂的修復(fù)期間發(fā)生的這種交換的特殊化的形式。這一過(guò)程需要核苷酸序列同源性，使用"供體"分子來(lái)模板修復(fù)"靶"分子(即經(jīng)歷雙鏈斷裂的分子)，并且由于其導(dǎo)致遺傳信息從供體向靶轉(zhuǎn)移而不同地稱(chēng)為"非交換型基因轉(zhuǎn)化"或"短序列基因轉(zhuǎn)化(shorttractgeneconversion)"。不希望被任何特定的理論所束縛，這種轉(zhuǎn)移可涉及在斷裂的靶和供體間形成的異源雙鏈體DNA的錯(cuò)配修正，和/或"合成依賴(lài)的鏈退火"，其中供體被用于重合成將會(huì)成為部分靶的遺傳信息和/或相關(guān)的過(guò)程。這種特殊化的HR常常導(dǎo)致靶分子的序列的改變以致供體多核苷酸的部分或全部序列被結(jié)合到靶多核苷酸中。"切割"是指DNA分子的共價(jià)主鏈的斷裂。切割可由不同的方法起始，所述方法包括但不限于磷酸二酯鍵的酶水解或化學(xué)水解。單鏈切割和雙鏈切割都是可能的，并且雙鏈切割可作為兩個(gè)不同的單鏈切割事件的結(jié)果而發(fā)生。DNA切割可導(dǎo)致平端或粘性末端(staggeredend)的產(chǎn)生。在某些實(shí)施方案中，融合多肽被用于靶向的雙鏈DNA切割。"切割結(jié)構(gòu)域"包括對(duì)DNA切割具有催化活性的一個(gè)或多個(gè)多肽序列。切割結(jié)構(gòu)域可包含在單獨(dú)的多肽鏈中或者切割活性可來(lái)自?xún)蓚€(gè)(或更多個(gè))多肽的聯(lián)合。"切割半結(jié)構(gòu)域"是多肽序列，其與第二多肽(相同或不同的)結(jié)合形成具有切割活性(優(yōu)選地雙鏈切割活性)的復(fù)合體。"染色質(zhì)"是含有細(xì)胞基因組的核蛋白結(jié)構(gòu)。細(xì)胞染色質(zhì)包括核酸(主要是DNA)和蛋白(包括組蛋白和非組蛋白染色體蛋白)。大多數(shù)真核細(xì)胞染色質(zhì)以核小體的形式存在，其中，核小體的核包括與含有組蛋白H2A、H2B、H3和H4各兩個(gè)的八聚體相關(guān)的約150》咸基對(duì)的DNA;并且連接體DNA(具有取決于生物體的可變的長(zhǎng)度)在核小體的核之間延伸。組蛋白HI分子通常與連接體DNA有關(guān)。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，術(shù)語(yǔ)"染色質(zhì)"意指包括所有類(lèi)型的細(xì)胞核蛋白，原核的和真核的。細(xì)胞染色質(zhì)包括染色體染色質(zhì)和附加型染色質(zhì)。"染色體"是含有全部或部分細(xì)胞基因組的染色質(zhì)復(fù)合體。細(xì)胞基因組常常以它的核型為特征，核型是包括細(xì)胞基因組的所有染色體的集合。細(xì)胞基因組可包括一個(gè)或多個(gè)染色體。"附加體"是含有不是細(xì)胞染色體核型的一部分的核酸的復(fù)制的核酸、核蛋白復(fù)合體或其他結(jié)構(gòu)。附加體的實(shí)例包括質(zhì)粒和某些病毒基因組。"易接近的區(qū)域"是細(xì)胞染色質(zhì)中的位點(diǎn)，其中核酸中存在的靶位點(diǎn)可被識(shí)別耙位點(diǎn)的外源分子結(jié)合。不希望被任何特定的理論所束縛，據(jù)信易接近的區(qū)域是沒(méi)有被包裝到核小體結(jié)構(gòu)中的區(qū)域。易接近的區(qū)域的不同結(jié)構(gòu)常常可通過(guò)它對(duì)化學(xué)和酶探針例如核酸酶的敏感度來(lái)檢測(cè)。"靶位點(diǎn)"或"靶序列"是以結(jié)合發(fā)生的充足條件為條件，定義結(jié)合分子將結(jié)合的核酸部分的核酸序列。例如，序列5'-GAATTC-3，是EcoRI限制性?xún)?nèi)切核酸酶的靶位點(diǎn)。"外源的"分子是細(xì)胞中不是正常存在的但是可通過(guò)一種或多種遺傳、生物化學(xué)或其他方法被引入細(xì)胞中的分子。就細(xì)胞特定的發(fā)育階段和環(huán)境條件而言來(lái)確定"細(xì)胞中正常存在"。因此，例如只在肌肉的胚胎發(fā)育期間存在的分子對(duì)于成體肌肉細(xì)胞而言是外源分子。相似地，通過(guò)熱休任何多肽或其片段的編碼序列，未發(fā)揮作用的內(nèi)源分子的發(fā)揮作用的形式或正常發(fā)揮作用的內(nèi)源分子的未發(fā)揮作用的形式。此外，外源分子可包括來(lái)自另一物種的編碼序列，其是宿主細(xì)胞中的內(nèi)源基因的直向同源物。特別地，外源分子可是小分子，例如通過(guò)組合的化學(xué)過(guò)程產(chǎn)生的，或大分子，例如蛋白、核酸、糖類(lèi)、脂類(lèi)、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何的修飾的衍生物或含有上述分子中的一種或多種的任何復(fù)合體。核酸包括DNA和RNA，可是單鏈或雙鏈；可是線(xiàn)狀、分枝或環(huán)狀的并且可具有任何長(zhǎng)度。核酸包括能夠形成雙鏈體的那些，以及形成三鏈體的核酸。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利第5，176,996和5，422，251號(hào)。蛋白包括但不限于DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重構(gòu)因子、甲基化的DNA結(jié)合蛋白、聚合酶、曱基化酶、脫曱基酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、脫乙?；浮⒓っ?、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓樸異構(gòu)酶、促旋酶和解旋酶。外源分子可是與內(nèi)源分子相同類(lèi)型的分子，例如外源蛋白或核酸。例如，外源核酸可包括引入細(xì)胞的感染的病毒基因組、質(zhì)粒或附加體或在細(xì)胞中不是正常存在的染色體。用于將外源分子引入細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的，并且包括但不限于脂類(lèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(即，脂質(zhì)體，包括中性脂類(lèi)和陽(yáng)離子脂類(lèi))、電穿孔、直接注射、細(xì)胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和病毒載體(vector)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移。相比之下，"內(nèi)源"分子是在特定的環(huán)境條件下處于特定發(fā)育階段的特定的細(xì)胞中正常存在的分子。例如，內(nèi)源核酸可包括染色體，線(xiàn)粒體、葉綠體或其他細(xì)胞器的基因組，或者天然存在的附加型核酸。此外，內(nèi)源分子可包括蛋白，例如轉(zhuǎn)錄因子和酶。如本文所用的，術(shù)語(yǔ)"外源核酸的產(chǎn)物"包括多核苷酸和多肽產(chǎn)物，例如轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(多核芬酸，例如RNA)和翻譯產(chǎn)物(多肽)。"融合"分子是其中兩個(gè)或更多亞基分子被連接(優(yōu)選共價(jià)地)的分一類(lèi)型的融合分子的實(shí)例包括但不限于融合蛋白(例如ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域之間的融合)和融合核酸(例如，編碼上文描述的融合蛋白的核酸)。第二類(lèi)型的融合分子的實(shí)例包括但不限于形成三鏈體的核酸和多肽之間的融合，以及小溝結(jié)合物和核酸之間的融合。細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)可由融合蛋白向細(xì)胞的遞送產(chǎn)生或通過(guò)編碼融合蛋白的多核苷酸向細(xì)胞的遞送產(chǎn)生，其中多核苷酸被轉(zhuǎn)錄，并且轉(zhuǎn)錄物被翻譯以產(chǎn)生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽連接也可被涉及在細(xì)胞中的蛋白的表達(dá)中。本公開(kāi)內(nèi)容的其他地方介紹了用于多核苷酸和多肽向細(xì)胞遞送的方法。為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，"基因"包括編碼基因產(chǎn)物(見(jiàn)下文)的DNA區(qū)域，以及調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的產(chǎn)生的所有DNA區(qū)域，無(wú)論這些調(diào)節(jié)序列是否鄰近編碼和/或轉(zhuǎn)錄的序列。相應(yīng)地，基因包括但不必限于，啟動(dòng)子序列、終止子、翻譯調(diào)節(jié)序列例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)和內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、增強(qiáng)子、沉默基因、絕緣子、邊界元件、復(fù)制原點(diǎn)、基質(zhì)附著部位和基因座控制區(qū)。"基因表達(dá)"是指包含在基因中的信息轉(zhuǎn)化成基因產(chǎn)物?；虍a(chǎn)物可是直4矣的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(例如mRNA、tRNA、rRNA,反義RNA、核酶、結(jié)構(gòu)RNA或任何其他類(lèi)型的RNA)或經(jīng)由mRNA翻譯所產(chǎn)生的蛋白?；虍a(chǎn)物還包括通過(guò)過(guò)程例如加帽、多聚腺苷化、曱基化和編輯而被修飾的RNA和通過(guò)例如曱基化、乙?；?、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化(myristilation)和糖基化而被修飾的蛋白?；虮磉_(dá)的"調(diào)節(jié)"是指基因活性的改變。表達(dá)的調(diào)節(jié)可包括但不限于基因活化和基因抑制。"真核"細(xì)胞包括但不限于真菌細(xì)胞(例如酵母)、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)月包、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和人類(lèi)細(xì)胞。"感興趣的區(qū)域"是細(xì)胞染色質(zhì)的任何區(qū)域，例如，諸如基因或者基因中或鄰近基因的非編碼序列，其中結(jié)合外源分子是所期望的。結(jié)合可是為了耙向的DNA切割和/或靶向的重組的目的。感興趣的區(qū)域可存在于例如染色體、附加體、細(xì)胞器的基因組(例如線(xiàn)粒體的、葉綠體的)或感染的病毒基因組中。感興趣的區(qū)域可在基因的編碼區(qū)域中，在轉(zhuǎn)錄的非編碼區(qū)域例如，諸如前導(dǎo)序列、尾隨序列或內(nèi)含子中，在非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(編碼區(qū)域的上游或下游)中。感興趣的區(qū)域在長(zhǎng)度上可是小至單個(gè)核香酸對(duì)或多達(dá)2,000個(gè)核苷酸對(duì)，或任何整數(shù)值的核苷酸對(duì)。對(duì)于兩個(gè)或更多組件(例如序列元件)的并置，術(shù)語(yǔ)"操作的連接"和"操作地連接的"(或"可操作地連接的")可互換使用，其中組件被排列以使組件正常起作用并允許至少一個(gè)組件可介導(dǎo)施加于至少一個(gè)其他組件的作用的可能性。通過(guò)示例性說(shuō)明，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子被操作地連接至編碼序列，如果轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列響應(yīng)于一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的存在或不存在控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄的水平。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列通?？刹僮鞯嘏c編碼序列順式連接，但不必與其直接相鄰。例如，增強(qiáng)子是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列，其操作地連接至編碼序列，即使它們不是相鄰的。就融合多肽而言，術(shù)語(yǔ)"操作地連接的"可指與其他組件連接的每個(gè)組件執(zhí)行的功能與如果它未如此連接時(shí)執(zhí)行的功能相同的事實(shí)。例如，對(duì)于其中ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與切割結(jié)構(gòu)域融合的融合多肽來(lái)說(shuō)，如果在該融合多肽中ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域部分能夠結(jié)合它的靶位點(diǎn)和/或它的結(jié)合位點(diǎn)，而切割結(jié)構(gòu)域能夠鄰近靶位點(diǎn)切割DNA，那么ZFPDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與切割結(jié)構(gòu)域處于操作地連接。蛋白、多肽或核酸的"功能片段"是其序列與全長(zhǎng)的蛋白、多肽或核酸不相同但仍保留與全長(zhǎng)的蛋白、多肽或核酸相同的功能的蛋白、多肽或核酸。功能片段可具有比相應(yīng)的天然分子更多、更少或相同數(shù)目的殘基，和/或可包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸取代。用于確定核酸功能(例如編碼功能、與另一個(gè)核酸雜交的能力)的方法是本領(lǐng)域熟知的。相似地，用于確定蛋白功能的方法是熟知的。例如，多肽的DNA結(jié)合功能可通過(guò)例如濾膜結(jié)合、電泳遷移率變換或免疫沉淀測(cè)定來(lái)確定。DNA切割可通過(guò)凝膠電泳來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)Ausubel等人，如上。蛋白與另一個(gè)蛋白的相互作用的能力可通過(guò)例如免疫共沉淀、雙雜交測(cè)定或互補(bǔ)(遺傳的和生物化學(xué)的)來(lái)測(cè)定。參見(jiàn)例如Fields等人(1989)淑,340:245-246;美國(guó)專(zhuān)利第5,585,245號(hào)和PCTWO98/44350。靶位點(diǎn)所公開(kāi)的方法和組合物包括含有切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)和鋅指結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，其中鋅指結(jié)構(gòu)域通過(guò)結(jié)合人類(lèi)PPP1R12C基因座中的序列來(lái)指導(dǎo)與序列鄰近的切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)的活性并且因此誘導(dǎo)PPP1R12C中的切割(例如雙鏈斷裂)。如本公開(kāi)內(nèi)容中其他地方所展示的，鋅指結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)成結(jié)合實(shí)際上任何期望的序列。相應(yīng)地，一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)成結(jié)合PPP1R12C基因中的一個(gè)或多個(gè)序列。在細(xì)胞中，包括鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的融合蛋白(或兩個(gè)融合蛋白，其每個(gè)包括鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域)的表達(dá)影響PPP1R12C基因中的切割。PPP1R12C中用于經(jīng)由鋅指結(jié)構(gòu)域來(lái)結(jié)合的序列(例如靶位點(diǎn))的選擇可依照例如共有的美國(guó)專(zhuān)利第6,453,242號(hào)(2002年9月17日)中公開(kāi)的方法完成，該專(zhuān)利還公開(kāi)了用于設(shè)計(jì)ZFP以與所選擇的序列結(jié)合的方法。對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)簡(jiǎn)單的目視檢查核苷酸序列也可被用于選擇把位點(diǎn)是明顯的。相應(yīng)地，用于靶位點(diǎn)選擇的任何方法可在本文描述的方法中使用。耙位點(diǎn)通常包括多個(gè)相鄰的靶亞位點(diǎn)。靶亞位點(diǎn)是指被各個(gè)鋅指結(jié)合的序列(通常是可經(jīng)由一個(gè)核苷酸與相鄰的四聯(lián)體重疊的核苷酸三聯(lián)體或核苦酸四聯(lián)體)。參見(jiàn)例如WO02/077227。如果鋅指蛋白與其進(jìn)行大部分接觸的鏈?zhǔn)侵付ǖ陌墟?初級(jí)識(shí)別鏈"或"初級(jí)接觸鏈"，某些鋅指蛋白結(jié)合靶鏈中的三堿基三聯(lián)體和在非靶鏈上的第四個(gè)石咸基。耙位點(diǎn)通常具有至少9個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，并且相應(yīng)地被含有至少三個(gè)鋅指的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。然而，例如4-指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與12-核苷酸靶位點(diǎn)的結(jié)合、5-指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與15-核苷酸靶位點(diǎn)的結(jié)合或6-指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與18-核苷酸靶位點(diǎn)的結(jié)合也是可能的。顯然地，更大的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如7-、8-、9-指和更多)與更長(zhǎng)的靶位點(diǎn)的結(jié)合也是可能的。對(duì)于靶位點(diǎn)來(lái)說(shuō)不必為三個(gè)核苦酸的倍數(shù)。例如，在其中發(fā)生交叉鏈相互作用的情況中(參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利6,453,242和WO02/077227),多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的各個(gè)鋅指中的一個(gè)或多個(gè)可與重疊的四聯(lián)體亞位點(diǎn)結(jié)合。作為結(jié)果，三指蛋白可結(jié)合10-核苦酸的序列，其中第十個(gè)核苷酸是末端的指結(jié)合的四聯(lián)體的一部分，四指蛋白可結(jié)合13-核苷酸序列，其中第十三個(gè)核普酸是末端的指結(jié)合的四聯(lián)體的一部分，等等。多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的各個(gè)鋅指之間的氨基酸連接體序列的長(zhǎng)度和性質(zhì)也影響與靶序列的結(jié)合。例如，多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中相鄰鋅指之間的所謂的"非規(guī)范連接體"、"長(zhǎng)連接體"或"結(jié)構(gòu)連接體"的存在可允許這些指結(jié)合不是直接相鄰的亞位點(diǎn)。這種連接體的非限制性實(shí)例被描述于例如美國(guó)專(zhuān)利第6,479,626號(hào)和WO01/53480中。相應(yīng)地，在用于鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶位點(diǎn)中，一個(gè)或多個(gè)亞位點(diǎn)可通過(guò)1、2、3、4、5或更多個(gè)核普酸與彼此分隔開(kāi)。提供一個(gè)實(shí)例，四指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可與在序列中含有兩個(gè)鄰近的3-核芬酸亞位點(diǎn)，一個(gè)插入的核苷酸和兩個(gè)連續(xù)的三聯(lián)體亞位點(diǎn)的13-核苦酸的把位點(diǎn)結(jié)合。序列(例如靶位點(diǎn))間的距離是指如從與彼此最近的序列的邊緣開(kāi)始所測(cè)量的兩個(gè)序列之間插入的核苷酸或核苷酸對(duì)的數(shù)目。在其中切割取決于兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域/切割半結(jié)構(gòu)域融合分子與分開(kāi)的革巴位點(diǎn)的結(jié)合的某些實(shí)施方案中，兩個(gè)靶位點(diǎn)可位于相對(duì)的DNA鏈上(實(shí)施例l)。在其他的實(shí)施方案中，輩巴位點(diǎn)都位于同一個(gè)DNA鏈。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可被用于本文所公開(kāi)的方法中。在某些實(shí)施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括鋅指蛋白。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)或多個(gè)鋅指。Miller等人(1985)4:1609-1614;Rhodes(1993)Sc/e"折c二月56-65;美國(guó)專(zhuān)利第6,453,242號(hào)。本文描述的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域通常包括2、3、4、5、6或者甚至更多個(gè)鋅指。通常，單獨(dú)的鋅指結(jié)構(gòu)域在長(zhǎng)度上大約為30個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)證實(shí)每個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域(基序)包括兩個(gè)P片層(保持含有兩個(gè)不變的半胱氨酸殘基的(3轉(zhuǎn)角)和一個(gè)a螺旋(含有兩個(gè)不變的組氨酸殘基)，其通過(guò)經(jīng)由兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸的鋅原子的配位保持特定的構(gòu)象。鋅指包括規(guī)范的C2H2鋅指(即其中鋅離子通過(guò)兩個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸殘基配位的那些)和非規(guī)范的鋅指例如，諸如C3H鋅指(其中鋅離子通過(guò)三個(gè)半胱氨酸殘基和一個(gè)組氨酸殘基配位的那些)和Ct鋅指(其中鋅離子通過(guò)四個(gè)半胱氨酸殘基配位的那些)。還參見(jiàn)WO02/057293。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可將鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)成結(jié)合PPP1R12C中的靶位點(diǎn)(參見(jiàn)上文)。參見(jiàn)，實(shí)施例1;共有的美國(guó)專(zhuān)利6,453,242和6,534,261,包括其中引用的參考文獻(xiàn)。與天然存在的鋅指蛋白相比，設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有新穎的結(jié)合特異性。設(shè)計(jì)的方法包括但不限于推理設(shè)計(jì)和各種類(lèi)型的選擇。推理設(shè)計(jì)包括例如使用包括三聯(lián)體(或四聯(lián)體)核苷S吏序列和單獨(dú)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中每個(gè)三聯(lián)體或四聯(lián)體核苦酸序列與結(jié)合特定的三聯(lián)體或四聯(lián)體序列的鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)。示例性的選擇方法，包括噬菌體展示和雙雜交系統(tǒng)，被描述于美國(guó)專(zhuān)利5,789,538、5,925,523、6,007,988、6,013,453、6,410,248、6,140,466、6,200,759和6，242，568;以及WO98/37186、WO98/53057、WO00/27878、WO01/88197和GB2,338,237。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性的增強(qiáng)已經(jīng)在例如共有的WO02/077227中描述。由于單獨(dú)鋅指結(jié)合三核苦酸(即三聯(lián)體)序列(或四核苷酸序列，其可通過(guò)一個(gè)核苷酸與鄰近鋅指的四核苷酸結(jié)合位點(diǎn)重疊)，鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域被設(shè)計(jì)以結(jié)合的序列(例如靶序列)的長(zhǎng)度將決定在設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中鋅指的數(shù)目。例如，對(duì)于其中指基序不與重疊的亞位點(diǎn)結(jié)合的ZFP，六核香酸耙序列被二指結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，九核苷酸靶序列被三指結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合，等。如本文所注意的，靶位點(diǎn)中單獨(dú)的鋅指的結(jié)合位點(diǎn)(即亞位點(diǎn))不必是鄰近的，而是取決于多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的鋅指之間的氨基酸序列(即指間連接體)的長(zhǎng)度和性質(zhì)而可被一個(gè)或幾個(gè)核苷酸分隔開(kāi)。在多指鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，鄰近的鋅指可被大約5個(gè)氨基酸的氨基酸連接體序列(所謂的"規(guī)范的"指間連接體)分隔開(kāi)，或可選擇地被一個(gè)或多個(gè)非規(guī)范的連接體分隔開(kāi)。參見(jiàn)，例如共有的美國(guó)專(zhuān)利第6,453,242和6,534,261號(hào)。對(duì)于含有多于三指的設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域來(lái)說(shuō)，某些鋅指之間較長(zhǎng)("非規(guī)范的")指間連接體的插入由于可增加通過(guò)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合的親和性和/或特異性而可是優(yōu)選的。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利第6,479,626和WO01/53480號(hào)。相應(yīng)地，多指鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域也可以關(guān)于非規(guī)范的指間連接體的存在和位置的方面為特征。例如，含有三個(gè)指(通過(guò)兩個(gè)規(guī)范的指間連接體連接)、一個(gè)長(zhǎng)連接體和三個(gè)另外的指(通過(guò)兩個(gè)規(guī)范的指間連接體連接)的六指鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域被表示為2x3構(gòu)型。相似地，含有兩個(gè)指(其間具有規(guī)范的連接體)、一個(gè)長(zhǎng)連接體和兩個(gè)另外的指(通過(guò)規(guī)范的連接體連接)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域被表示為2x2蛋白。含有三個(gè)兩指單元(其每個(gè)中兩個(gè)指通過(guò)一個(gè)規(guī)范的連接體連接)并且其中每個(gè)兩指單元通過(guò)長(zhǎng)連接體被連接至鄰近的兩指單元的蛋白，被稱(chēng)為3x2蛋白。在多指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中兩個(gè)相鄰的鋅指之間長(zhǎng)的或非規(guī)范的指間連接體的存在常常允許兩個(gè)指結(jié)合靶序列中并非直接相鄰的亞位點(diǎn)。相應(yīng)地，在耙位點(diǎn)中的亞位點(diǎn)之間可有一個(gè)或多個(gè)核苷酸的間隙，即耙位點(diǎn)可含有不被鋅指接觸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。例如2x2鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域可結(jié)合被一個(gè)核苷酸分隔開(kāi)的兩個(gè)六核苷酸序列，即其結(jié)合13-核苷酸的靶位點(diǎn)。還參見(jiàn)Moore等人(2001a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:1432-1436;Moore等人(2001b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:1437-1441和WO01/53480。如之前所提到的，靶亞位點(diǎn)是被一個(gè)鋅指結(jié)合的三或四核苷酸序列。為了某些目的，二指單元被表示為結(jié)合構(gòu)件。結(jié)合構(gòu)件可通過(guò)例如在結(jié)合特定的六核苷酸耙序列的多指蛋白(通常三個(gè)指)的情況中選擇兩個(gè)相鄰的指來(lái)獲得。可選擇地，構(gòu)件可通過(guò)單獨(dú)的鋅指的集合來(lái)構(gòu)建。還參見(jiàn)WO98/53057和WO01/53480?？蛇x擇地，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可從核酸酶獲得。例如，歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的識(shí)別序列例如I-5*ceI、I-Cewl、PI-I、PKSce、HIV、I-C湖I、I畫(huà)尸a"I、IHI々oI、I隱SceIII、I匿OeI、I-7fevI、HII和I畫(huà)revIII是已知的。還參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利第5,420,032號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,833,252號(hào)；Belfort等人(1997)M/c/e/cM25:3379-3388;Dujon等人(1989)82:115-118;Perler等人(1994)NucleicAcidsRes.22，1125-1127;Jasin(1996)7>ewAGe"e"2:224-228;Gimble等人(1996)JMo/.263:163-180;Argast等人(1998)/Mo/.AW.280:345-353和NewEnglandBiolabscatalogue(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室目錄)。此外，歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合特異性可被設(shè)計(jì)成結(jié)合非天然的靶位點(diǎn)。參見(jiàn)，例如Chevalier等人(2002)Afo/ec.CW/10:895-905;Epinat等人(2003)AWe/c版31:2952-2962;Ashworth等人(2006)淑,441:656-659;Paques等人(2007)Cwre"fTTzerapy7:49-66;美國(guó)專(zhuān)利公布第20070117128號(hào)。切割結(jié)構(gòu)域本文公開(kāi)的融合蛋白的切割結(jié)構(gòu)域部分可從任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶獲得?？蓮钠浍@得切割結(jié)構(gòu)域的示例性?xún)?nèi)切核酸酶包括但不限于限制性?xún)?nèi)切核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶。參見(jiàn)，例如2002-2003目錄，NewEnglandBiolabs,Beverly,MA和Belfort等人(1997)」c/<isies.25:3379-3388。切割DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶、綠豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO內(nèi)切核酸酶；還參見(jiàn)Linn等人(編輯)M/c/醋es(核酸酶)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993)。歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的非限制性實(shí)例包括I-化d、I-Cewl、PI-I、PI-Sce、I-MV、I-C雄I、I-尸a"I、I-屈I、I々oI、I-toIII、I畫(huà)Od、i-revi、i-revii和i-:revm是已知的。還參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利第5，420，032號(hào)；美國(guó)專(zhuān)利第6,833,252號(hào)；Belfort等人(1997)M/c/e/c^4c/A/仏25:3379-3388;Dujon等人(1989)Ge"e82:115-118;Perler等人(1994)NucleicAcidsRes,22，1125-1127;Jasin(1996)7^"AGe威12:224-228;Gimble等人(1996)/Mo/.5/o/.263:163-180;Argast等人(1998)/Mo/.280:345-353和NewEnglandBiolabscatalogue(新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室目錄)。這些酶中的一個(gè)或多個(gè)(或其功能片段)可被用作切割結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域的來(lái)源。限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制性酶)存在于許多物種中并且能夠與DNA序列特異性地結(jié)合(在識(shí)別位點(diǎn))并在結(jié)合的位點(diǎn)處或附近切割DNA。某些限制性酶(例如IIS型)在遠(yuǎn)離其識(shí)別位點(diǎn)的位點(diǎn)處切割DNA并具有可分離的結(jié)合和切割結(jié)構(gòu)域。例如，IIS型酶fbH在距其一條鏈上的識(shí)別位點(diǎn)9個(gè)核苦酸處和距其另一條鏈上的識(shí)別位點(diǎn)13個(gè)核苷酸處催化DNA的雙鏈切割。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利5,356,802、5，436,150和5，487，994;以及Li等人(1992)尸rac.A^/.5W.OS」89:4275-4279;Li等人(1993)尸rac.A^/.^cad90:2764-2768;Kim等人(1994a)/Voc.A^/.」cat/.5W.L/iS^91:883-887;Kim等人(1994b)JC7ze肌269:31,978-31，982。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白含有來(lái)自至少一個(gè)IIS型限制性酶的切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其可或不可被設(shè)計(jì)。其切割結(jié)構(gòu)域可與結(jié)合結(jié)構(gòu)域分離的一種示例性IIS型限制性酶是Fo/H。這一特定的酶作為二聚體時(shí)是活化的。Bitinaite等人(1998)Prac.Wa//./kat/.Sc/.95:10,570-10,575。相應(yīng)地，為了本公開(kāi)內(nèi)容的目的，在所公開(kāi)的融合蛋白中使用的FokI酶的部分被認(rèn)為是切割半結(jié)構(gòu)域。因此，為了使用鋅指-Fo/H融合的細(xì)胞序列的靶向雙鏈切割和/或靶向替代，兩個(gè)融合蛋白，每個(gè)含有Fo/tI切割半結(jié)構(gòu)域，可被用于重構(gòu)催化活性的切割結(jié)構(gòu)域。可選擇地，也可使用含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)FoA:I切割半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽分子。使用鋅指-FWI融合的靶向切割和靶向序列改變的參數(shù)在本公開(kāi)內(nèi)容中其他地方提供。切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域可是保留切割活性的或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能切割結(jié)構(gòu)域的能力的蛋白的任何部分。示例性IIS型限制性酶被描述于共有的國(guó)際公布WO2007/014275中，其通過(guò)引用全文并入本文。為了增強(qiáng)切割特異性，切割結(jié)構(gòu)域還可被修飾。在某些實(shí)施方案中，使用了切割半結(jié)構(gòu)域的變體，該變體將切割半結(jié)構(gòu)域的同源二聚化最小化或阻止切割半結(jié)構(gòu)域的同源二聚化。這種修飾的切割半結(jié)構(gòu)域的非限制性的實(shí)例具體描述于WO2007/014275中，其通過(guò)引用全文并入本文。還參見(jiàn)實(shí)施例。在某些實(shí)施方案中，切割結(jié)構(gòu)域含有設(shè)計(jì)的切割半結(jié)構(gòu)域(也稱(chēng)為二聚化結(jié)構(gòu)域突變體)，其將同源二聚化最小化或阻止同源二聚化是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的并被描述于例如美國(guó)專(zhuān)利公布第20050064474和20060188987號(hào)，其通過(guò)引用全文并入本文。MI的446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538位置處的氨基酸殘基是影響FoAI切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化的所有靶。參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利公布第20050064474和20060188987號(hào)；國(guó)際專(zhuān)利公布WO07/139898;Miller等人(2007)iV加所0&c/2w/.25(7):778-785。形成專(zhuān)性異源二聚體的其他設(shè)計(jì)的I的切割半結(jié)構(gòu)域也可被用于本文描述的ZFN中。第一切割半結(jié)構(gòu)域包括Fo/H的490和538位置處的氨基酸殘基上的突變而第二切割半結(jié)構(gòu)域包括氨基酸殘基486和499處的突變。在某些實(shí)施方案中，切割結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域，其都是含有結(jié)合結(jié)構(gòu)域、第一切割半結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多肽的一部分。切割半結(jié)構(gòu)域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它們起作用以切割DNA。通常，如果融合蛋白含有切割半結(jié)構(gòu)域，那么兩個(gè)融合蛋白是切割所需要的。可選擇地，可使用含有兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域的單個(gè)蛋白。兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于相同的內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)或每個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域可來(lái)源于不同的內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)。此外，兩個(gè)融合蛋白的耙位點(diǎn)被優(yōu)選地相對(duì)于彼此排列，使得兩個(gè)融合蛋白與它們各自的靶位點(diǎn)的結(jié)合以相對(duì)于彼此的空間方位放置切割半結(jié)構(gòu)域，所述空間方位允許切割半結(jié)構(gòu)域形成功能切割結(jié)構(gòu)域(例如通過(guò)二聚化)。因此，在某些實(shí)施方案中，靶位點(diǎn)的近側(cè)邊緣被5-8個(gè)核苷酸或被15-18個(gè)核苷酸分隔開(kāi)。然而，任何整數(shù)數(shù)目的核苷酸或核苷酸對(duì)可插入兩個(gè)靶位點(diǎn)之間(例如從2至50個(gè)核普酸或更多)。通常切割的點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。鋅指結(jié)構(gòu)域-切割結(jié)構(gòu)域融合用于設(shè)計(jì)和構(gòu)成融合蛋白(以及編碼這一融合蛋白的多核普酸)的方法是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的。例如，用于設(shè)計(jì)和構(gòu)成含有鋅指蛋白的融合蛋白(以及編碼這一融合蛋白的多核苷酸)的方法被描述于共有的美國(guó)專(zhuān)利6,453,242和6,534,261以及國(guó)際公布WO2007/014275中。在某些實(shí)施方案中，編碼這些融合蛋白的多核苷酸被構(gòu)成。這些多核苷酸可被插入載體中，而載體可被引入細(xì)胞中(參見(jiàn)下文關(guān)于將多核苦酸引入細(xì)胞的載體和方法的另外的公開(kāi)內(nèi)容)。在本文描述的方法的某些實(shí)施方案中，融合蛋白含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自FoA:I限制性酶的切割半結(jié)構(gòu)域，并且在細(xì)胞中表達(dá)兩個(gè)這樣的融合蛋白。細(xì)胞中兩個(gè)融合蛋白的表達(dá)可由兩個(gè)蛋白向細(xì)胞的遞送、一個(gè)蛋白和編碼蛋白中的一個(gè)的一個(gè)核酸向細(xì)胞的遞送、兩個(gè)核酸(其每個(gè)編碼蛋白中的一個(gè))向細(xì)胞的遞送或通過(guò)單一的核酸(其編碼兩個(gè)蛋白)向細(xì)胞的遞送而產(chǎn)生。在另外的實(shí)施方案中，融合蛋白含有單一的多肽鏈，該單一的多肽鏈含有兩個(gè)切割半結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在這一實(shí)例中，單一的融合蛋白在細(xì)胞中被表達(dá)，并且，不希望被理論所束縛，單一的融合蛋白據(jù)信作為切割半結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)二聚體的形成的結(jié)果而切割DNA。兩個(gè)融合蛋白，每個(gè)含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域，可在細(xì)胞中被表達(dá)并與靶位點(diǎn)結(jié)合，所述靶位點(diǎn)以使得在靶位點(diǎn)附近功能切割結(jié)構(gòu)域被重構(gòu)并且DNA#1切割的方式并置。在一個(gè)實(shí)施方案中，切割發(fā)生在兩個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶位點(diǎn)之間。鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一個(gè)或兩個(gè)和/或切割結(jié)構(gòu)域可被設(shè)計(jì)。參見(jiàn)實(shí)施例1。融合蛋白(例如ZFP-FWI融合)的組件可被排列，以使鋅指結(jié)構(gòu)域最接近融合蛋白的氨基末端并且切割半結(jié)構(gòu)域最接近羧基末端。通過(guò)融合蛋白與相對(duì)的DNA鏈上的位點(diǎn)的結(jié)合獲得切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化以形成功能核酸酶，結(jié)合位點(diǎn)的5'末端彼此最接近?？蛇x才奪地，融合蛋白(例如ZFP-FoA:I融合)的組件可被排列以使切割半結(jié)構(gòu)域最接近融合蛋白的氨基末端并且鋅指結(jié)構(gòu)域最接近羧基末端。在這些實(shí)施方案中，通過(guò)融合蛋白與相對(duì)的DNA鏈上的位點(diǎn)的結(jié)合獲得切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化以形成功能核酸酶，結(jié)合位點(diǎn)的3，末端彼此最接近。在還有另外的實(shí)施方案中，第一融合蛋白包含最接近融合蛋白的氨基末端的切割半結(jié)構(gòu)域和最接近融合蛋白的羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域，而第二融合蛋白被排列以使鋅指結(jié)構(gòu)域最接近融合蛋白的氨基末端并且切割半結(jié)構(gòu)域最接近羧基末端。在這些實(shí)施方案中，兩個(gè)融合蛋白都與相同的DNA鏈結(jié)合，含有最接近羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)位于含有最接近氨基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)的5，側(cè)。兩個(gè)融合蛋白可以相同或相反的極性在感興趣的區(qū)域中結(jié)合并且它們的結(jié)合位點(diǎn)(即靶位點(diǎn))可被任何數(shù)目的核苷酸例如從0到200個(gè)核苷酸或其間的任何整數(shù)值的核苷酸所分隔開(kāi)。在某些實(shí)施方案中，兩個(gè)融合蛋白(每個(gè)含有鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割半結(jié)構(gòu)域)的結(jié)合位點(diǎn)如從每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的最接近另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的邊緣開(kāi)始所測(cè)量的可相隔5和18個(gè)之間的核苷酸，例如相隔5-8個(gè)核苷酸、或相隔15-18個(gè)核苷酸或相隔6個(gè)核苷酸，或相隔16個(gè)核苷酸，并且切割發(fā)生在結(jié)合位點(diǎn)之間。DNA被切割的位點(diǎn)通常位于兩個(gè)融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)之間。DNA的雙鏈斷裂通常來(lái)自于兩個(gè)單鏈的斷裂，或抵消1、2、3、4、5、6或更多個(gè)核苷酸的"切口"(例如通過(guò)天然FoAI的雙鏈DNA的切割來(lái)自于抵消4個(gè)核苷酸的單鏈斷裂)。因此，切割不是必須發(fā)生在每條DNA鏈上的精確相對(duì)的位點(diǎn)處。此外，融合蛋白的結(jié)構(gòu)和靶位點(diǎn)之間的距離可影響切割是否鄰近單一核苷酸對(duì)發(fā)生或者切割是否發(fā)生在幾個(gè)位點(diǎn)。然而，對(duì)靶向的整合來(lái)說(shuō)，一定范圍內(nèi)的核苷酸中的切割通常是足夠的，而特定堿基對(duì)之間的切割是不需要的。在所公開(kāi)的融合蛋白中，鋅指結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域(或切割半結(jié)構(gòu)域)之間的氨基酸序列被表示為"zc連接體"。zc連接體與上文所討論的指間連接體不同。ZC連接體具體#:描述于例如WO2007/014275中。如下文所具體討論的，融合蛋白(ZFN)或編碼這一蛋白的多核苷酸被引入細(xì)胞中。一旦被引入細(xì)胞中或在細(xì)胞中被表達(dá)，融合蛋白與PPP1R12C中的靶序列結(jié)合并在這一基因座內(nèi)切割。向PPP1R12C基因的靶向整合所公開(kāi)的方法和組合物可被用于切割細(xì)胞染色質(zhì)的PPP1R12C基因中的DNA,其有利于外源序列穩(wěn)定的靶向的整合到PPP1R12C基因座的"安全港"中。如上文所提到的，內(nèi)源PPP1R12C的功能的丟失被人類(lèi)細(xì)胞所很好的耐受并且整合到這一基因中的序列從內(nèi)源啟動(dòng)子被廣泛地轉(zhuǎn)錄。因此，PPP1R12C是外源序列的靶向整合的理想位點(diǎn)。為了向PPP1R12C輩巴向整合，一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域;波設(shè)計(jì)成結(jié)合預(yù)定切割位點(diǎn)處或附近的靶位點(diǎn)，并且含有設(shè)計(jì)的鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和切割結(jié)構(gòu)域的融合蛋白在細(xì)胞中被表達(dá)。當(dāng)融合蛋白的鋅指部分與靶位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，DNA,優(yōu)選地經(jīng)由雙鏈斷裂，鄰近靶位點(diǎn)通過(guò)切割結(jié)構(gòu)域被切割。PPP1R12C基因座中雙鏈斷裂的存在有助于外源序列經(jīng)由同源重組整合。因此，含有有待被插入PPP1R12C基因的外源序列的多核苷酸將包括與PPP1Rl2C基因同源的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域以幫助同源重組。感興趣的任何序列(外源序列)可如本文所描述的凈皮引入PPP1R12C基因座中。示例性的外源序列包括但不限于任何多肽編碼序列(例如cDNA)、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他調(diào)節(jié)序列、shRNA表達(dá)盒、附加表位、標(biāo)記基因、切割酶識(shí)別位點(diǎn)和各種類(lèi)型的表達(dá)構(gòu)建體。這些序列可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(克隆、合成等)容易地獲得和/或可商業(yè)獲得。例如，MISSIONTRCshRNA庫(kù)是可從Sigma商業(yè)獲得的。標(biāo)記基因包括但不限于編碼介導(dǎo)抗生素抗性(例如氨芐青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、。票呤霉素抗性)的蛋白的序列、編碼有色或熒光或發(fā)光的蛋白(例如綠色熒光蛋白、增強(qiáng)的綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白、熒光素酶)、細(xì)胞表面抗原(例如ANGFR)以及介導(dǎo)增強(qiáng)的細(xì)胞生長(zhǎng)和/或基因擴(kuò)增的蛋白(例如二氫葉酸還原酶)的序列。附加表位包括例如FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可檢測(cè)的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)拷貝。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外源序列包括編碼在細(xì)胞中其表達(dá)是期望的任何多肽的多核香酸，所述多肽包括但不限于抗體、抗原、酶、受體(細(xì)胞表面或細(xì)胞核)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子、報(bào)道多肽、生長(zhǎng)因子和上述任何一個(gè)的功能片段。編碼序列可是例如cDNA。外源序列還可編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。例如，耙向PPP1R12C基因座的外源序列包括編碼在患有遺傳疾病的受治療者中缺少或無(wú)功能的多肽的序列，所述遺傳疾病包括但不限于下列遺傳疾病中的任何一種軟骨發(fā)育不全、色盲、酸性麥芽糖酶缺乏、腺苷脫氨酶缺乏(OMIM第102700號(hào))、腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、艾卡爾迪綜合征、a-l抗胰蛋白酶缺乏、a-地中海貧血、雄激素不敏感綜合征、阿佩爾綜合征、心律失常性右室心肌病、發(fā)育不良、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、巴特綜合征、|3-地中海貧血、藍(lán)色橡皮皰痣綜合征、卡納萬(wàn)病、慢性肉芽腫疾病(CGD)、貓叫綜合征、嚢性纖維化、德?tīng)柨喜?、外胚層發(fā)育不良、范可尼貧血、進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良、脆性X綜合征、半乳糖血癥、戈謝病、全身性神經(jīng)節(jié)苷脂病(例如GM1)、血色素沉著病、(3球蛋白的第六密碼子中的血紅蛋白C突變(HbC)、血友病、亨廷頓病、胡爾勒綜合征、低磷酸酯酶癥、克萊恩費(fèi)爾特綜合征、克拉伯病、Langer-Giedion綜合征、白細(xì)胞粘附缺陷(LAD,OMIM第116920號(hào))、腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良、長(zhǎng)QT綜合征、馬方綜合征、Moebius綜合征、粘多糖病(MPS)、指曱髕骨綜合征、腎性尿崩癥、神經(jīng)纖維瘤病、Neimann-Pick病、成骨不全、吟啉癥、普-威綜合征、早衰、變形桿菌綜合征(Proteussyndrome)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、雷特綜合征、魯賓斯坦-泰比綜合征、圣菲利波綜合癥、重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)、施瓦赫曼綜合征、鐮狀細(xì)胞病(鐮狀細(xì)胞性貧血)、史密斯-馬吉利氏綜合征、斯蒂克勒綜合征、泰-薩病、血小板過(guò)低合并橈骨缺失(TAR)綜合征、特雷徹柯林斯綜合征、三體性、結(jié)節(jié)性硬化癥、特納綜合征、尿素循環(huán)障礙、希佩爾-林道病、瓦爾敦堡綜合征、威廉斯綜合征、威爾遜病、威斯科特-奧爾德里奇綜合征、X連鎖淋巴組織增生綜合征(XLP,OMIM第308240號(hào))?？赏ㄟ^(guò)靶向的整合治療的其他示例性的疾病包括獲得性免疫缺陷、溶酵體貝e:積病(例如戈謝病、GM1、法布里病和泰-薩病)、粘多糖病(例如亨特病、胡爾勒病)、血紅蛋白病(例如鐮狀細(xì)胞病、HbC、a-地中海貧血、(3-地中海貧血)和血友病。在某些實(shí)施方案中，外源序列可包括標(biāo)記基因(上文所描述的)和編碼另外的功能性的連接序列，其中所述標(biāo)記基因允許已經(jīng)經(jīng)歷靶向整合的細(xì)胞的選擇。此外，盡管不是表達(dá)所需要的，外源序列也可是轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序列，例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、絕緣子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)、編碼2A肽的序列和/或多腺苷酸化信號(hào)。如本文所公開(kāi)的，外源序列的靶向整合可被用來(lái)產(chǎn)生用于蛋白表達(dá)的細(xì)胞和細(xì)胞系。參見(jiàn)，例如，共有的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公布第2006/0063231號(hào)基因組的外源序列編碼的一種或多種蛋白的最佳表達(dá)，染色體整合位點(diǎn)應(yīng)與整合序列的高水平轉(zhuǎn)錄相容，優(yōu)選地在大范圍的細(xì)胞類(lèi)型和發(fā)育階段中。然而，已經(jīng)觀(guān)察到整合序列的轉(zhuǎn)錄由于尤其是整合位點(diǎn)處的基因組的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而取決于整合位點(diǎn)而變化。相應(yīng)地，支持整合序列的高水平轉(zhuǎn)錄的基因組的靶位點(diǎn)是所期望的。在某些實(shí)施方案中，外源序列的整合不會(huì)導(dǎo)致一種或多種細(xì)胞基因(例如致癌基因)的異位活化也是所期望的。在另一方面，在整合啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子序列的情況下，異位表達(dá)可能是所期望的。外源(供體)序列可被引入細(xì)胞中，在融合蛋白的表達(dá)之前、同時(shí)或之后。供體多核奇酸包含與基因組序列的足夠的同源性以支持它和與它具有同源性的基因組序列之間的同源重組(或同源性指導(dǎo)的修復(fù))。在供體和基因組序列之間大約25、50、100、200、500、750、l，OOO、1，500、2,000個(gè)核苷酸或更多的序列同源性(或10和2,000之間的任4可整數(shù)值個(gè)核苷酸或更多)將支持其間的同源重組。供體序列長(zhǎng)度上可在10至5,000個(gè)核苷酸(或其間任何整數(shù)值個(gè)核苷酸)或更長(zhǎng)的范圍內(nèi)。顯而易見(jiàn)的是供體序列與它所替代的基因組序列通常不相同。例如，供體多核苷酸的序列可含有對(duì)于基因組序列來(lái)說(shuō)一個(gè)或多個(gè)單一的堿基改變、插入、缺失、倒位或重排，只要存在與染色體序列的足夠的同源性?？蛇x擇地，供體序列可含有側(cè)面為兩個(gè)同源性區(qū)域的非同源性序列。此外，供體序列可包括載體分子，其含有與細(xì)胞染色質(zhì)中感興趣的區(qū)域不同源的序列。通常，供體序列的同源性區(qū)域與希望進(jìn)行重組的基因組序列具有至少50%的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，存在60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或99.9。/。的序列同一性?？纱嬖?%和100%之間的任何值的序列同一性，這取決于供體多核苷酸的長(zhǎng)度。供體分子可含有與細(xì)胞染色質(zhì)同源的幾個(gè)不連續(xù)的區(qū)域。例如，同源性的區(qū)域可在包含所期望的改變的兩個(gè)或更多個(gè)區(qū)域側(cè)面。供體多核苷酸可是DNA或RNA,單鏈的或雙鏈的并可被以線(xiàn)狀或環(huán)狀形式引入細(xì)胞中。如果以線(xiàn)狀形式引入，供體序列的末端可通過(guò)本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員已知的方法被保護(hù)(例如避免核酸外切降解)。參見(jiàn)WO2007/014275。多核苷酸可作為具有另外的序列例如諸如復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子和編碼抗生素抗性的基因的載體分子的一部分被引入細(xì)胞。而且，供體多核苷酸可作為棵露的核酸、作為與劑例如脂質(zhì)體或泊洛沙姆絡(luò)合的核酸而被引入，或可通過(guò)病毒(例如腺病毒、AAV、皰滲病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒)被遞送。還提供了可增強(qiáng)靶向重組水平的方法和組合物，包括但不限于另外的ZFP功能結(jié)構(gòu)域融合的使用。參見(jiàn)WO2007/014275。在含有鋅指/核酸酶融合分子和供體DNA分子的細(xì)胞中，把向重組的效率的進(jìn)一步提高是通過(guò)在同源性驅(qū)動(dòng)的修復(fù)過(guò)程被最大地活化時(shí)，將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的G2期中來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種阻滯可以多種方法實(shí)現(xiàn)。例如，可用例如影響細(xì)胞周期進(jìn)程的藥物、化合物和/或小分子處理細(xì)胞以便將細(xì)物(例如長(zhǎng)春堿、諾考達(dá)唑、紫杉醇)、與DNA相互作用的化合物(例如順二氯二胺鈾(11)、順柏、阿霉素)和/或影響DNA合成的化合物(例如胸苷、羥基脲、L-含羞草堿、依托泊苷、5-氟尿嘧啶)。此外重組效率上的提高是通過(guò)使用組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如丁酸鈉、制滴菌素A)實(shí)現(xiàn)的，所述抑制劑改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)以使基因組DNA對(duì)于細(xì)胞的重組片幾制來(lái)說(shuō)更容易達(dá)到。用于細(xì)胞周期阻滯的另外的方法包括抑制CDK細(xì)胞周期激酶活性的蛋白的過(guò)量表達(dá)，例如通過(guò)將編碼蛋白的cDNA引入細(xì)胞或通過(guò)將活化編碼蛋白的基因的表達(dá)的所設(shè)計(jì)的ZFP引入細(xì)胞。細(xì)胞周期阻滯也通過(guò)例如使用RNAi方法(例如美國(guó)專(zhuān)利第6,506,559號(hào))抑制細(xì)胞周期蛋白和CDK的活性或通過(guò)向細(xì)胞中引入抑制細(xì)胞周期過(guò)程中所涉及的一個(gè)或多個(gè)基因(例如，諸如細(xì)胞周期蛋白和/或CDK基因)的表達(dá)的設(shè)計(jì)的ZFP來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)，例如共有的美國(guó)專(zhuān)利第6,534,261號(hào)的用于合成用于調(diào)節(jié)基因表達(dá)的設(shè)計(jì)的鋅指蛋白的方法。可選擇地，在某些實(shí)例中，靶向的切割在供體多核苷酸不存在的情況下(優(yōu)選地在S或G2期中)進(jìn)行，并且重組發(fā)生在同源染色體之間。遞送融合蛋白(ZFN)可作為多肽和/或多核苷酸被引入。例如，兩個(gè)多核苷酸(其每一個(gè)含有編碼前述多肽中的一個(gè)的序列)可一皮引入細(xì)胞，并且當(dāng)多肽被表達(dá)并且其每一個(gè)都與它的靶序列結(jié)合時(shí)，切割在靶序列處或附近發(fā)生。可選擇地，包括編碼兩種融合多肽的序列的單一的多核苷酸被引入細(xì)胞中。多核苷酸可是DNA、RNA或任何修飾的形式或類(lèi)似物或DNA和/或RNA?？墒褂萌魏芜m合的方法將如本文所描述的核酸(例如編碼ZFN的多核普酸和/或外源"供體"序列)引入細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，可將一個(gè)或多個(gè)ZFP或ZFP融合蛋白克隆至用于向原核或真核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的載體中以便復(fù)制和/或表達(dá)。載體可是原核載體(例如質(zhì)粒)、或穿梭載體、昆蟲(chóng)載體或真核載體。使用例如Sambrook等人，如上和美國(guó)專(zhuān)利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474和20060188987和國(guó)際公布WO2007/014275中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，編碼本文描述的序列的核酸(ZFN)也可被克隆至表達(dá)載體中以便施用于植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞(優(yōu)選地哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人類(lèi)細(xì)胞)、真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)力包或原生動(dòng)物細(xì)月包。在某些實(shí)施方案中，為了基因治療用途，ZFN和供體序列被體內(nèi)或離體遞送。用于將多核苷酸遞送至細(xì)胞中的非病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA質(zhì)粒、棵露的核酸和與遞送運(yùn)載體例如脂質(zhì)體或泊洛沙姆絡(luò)合的核酸。病毒載體遞送系統(tǒng)包括DNA和RNA病毒，其在遞送至細(xì)胞后具有附加型或整合的基因組。基因治療程序的綜述，參見(jiàn)Anderson,Sc/ence256:808-813(1992);Nabel&Feigner,7TO7^C//11:211-217(1993);Mitani&Caskey,:162-166(1993);Dillon,7W五C7/11:167-175(1993);Miller,Atowe357:455-460(1992);VanBrunt,所0fec/7"0/0gy6(10):1149-1154(1988);Vigne，Ae加raf/ve臉wra/ogyaw/臉wrasc/ewce8:35-36(1995);Kremer&Perricaudet,BWto/iWec/z'ca/5w〃e""51(1):31-44(1995);Haddada等人于Cwrre"7b//csf"M/cra6/o/ogya"c//m附w"。/c^f微i游夢(mèng)^^瘦夢(mèng)"^^,趟；JDoerfler和B6hm(編輯)(1995)中和Yu等人T7zera/^1:13-26(1994)。核酸的體內(nèi)或離體的非病毒遞送的方法包括電穿孔、脂轉(zhuǎn)染(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利第5,049,386;4,946,787號(hào)和可商業(yè)獲得的試劑例如TransfectamTM和LipofectinTM)、顯微注射、生物射彈、病毒顆粒、脂質(zhì)體(參見(jiàn)例如Crystal,5We"ce270:404-410(1995);Blaese等人Ca"cerTTzer.2:291-297(1995);Behr等人，A.。匿乂，/eOzew.5:382-389(1994);Remy等人，B/oco咖g她CVz，.5:647-654(1994);Gao等人,77zera/少2:710-722(1995);Ahmad等人，C薩wto,52:4817-4820(1992);美國(guó)專(zhuān)利第4,186,183，4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787號(hào))、免疫脂質(zhì)體、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì)核酸軛合物、棵露的DNA、人造病毒體、病毒載體系統(tǒng)(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴隨、牛疽和如WO2007/014275中所描述的用于遞送包括ZFP的蛋白的單純皰滲病毒載體)以及劑強(qiáng)化的DNA吸收。使用例如Sonitron2000系統(tǒng)(Rich-Mar)的聲穿孑L(Sonoporation)也可被用于遞送核酸。另外的示例性核酸遞送系統(tǒng)包4舌由AmaxaBiosystems(Cologne,Germany).,Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)和BTXMolecularDeliverySystems(Holliston，MA)所提供的那些。在某些實(shí)施方案中，例如，在其中ZFP融合蛋白的瞬時(shí)表達(dá)是優(yōu)選的實(shí)施方案中，可使用基于腺病毒的系統(tǒng)?；谙俨《镜妮d體能夠在許多細(xì)胞類(lèi)型中具有非常高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率并且不要求細(xì)胞分裂。用這些載體獲得了高效價(jià)和高水平的表達(dá)。這一載體可在相對(duì)簡(jiǎn)單的系統(tǒng)中被大量生產(chǎn)。腺伴隨病毒("AAV")載體也可被用來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有靶核酸的細(xì)胞，例如在核酸和肽的體外生產(chǎn)中，以及用于體內(nèi)和離體的基因治療程序(參見(jiàn)，例如West等人，Wra/ogy160:38-47(1987);美國(guó)專(zhuān)利第4,797,368號(hào)；WO93/24641;Kotin,//ww朋77zera;^5:793-801(1994);Muzyczka,C7/"./m^f.94:1351(1994)。重組的AAV載體的構(gòu)成被描述于大量出版物中，包括美國(guó)專(zhuān)利第5,173,414號(hào)；Tratschin等人，Mo/.Ce〃.所o/.5:3251-3260(1985);Tratschin等人，Mo/.B/o/.4:2072-2081(1984);Hermonat&Muzyczka,尸A^S81:6466-6470(1984)和Samulski等人，JWra/.63:03822-3828(1989)。對(duì)于臨床試驗(yàn)中的基因轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，至少六種病毒載體方法是目前可獲得的，其利用了包括通過(guò)插入輔助細(xì)胞系的基因補(bǔ)充缺陷型載體以產(chǎn)生轉(zhuǎn)導(dǎo)劑的方法。pLASN和MFG-S是反轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例，其已經(jīng)被用于臨床試驗(yàn)(Dunbar等人別ood85:3048-305(1995);Kohn等人淑Med1:1017-102(1995);Malech等人，/WAS94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治療實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)治療性載體(Blaese等人，5Wewce270:475-480(1995))。對(duì)于MFG-S包裝載體已經(jīng)觀(guān)察到50%或更高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率(Ellem等人，/;wmwo//wmwwo/er.44(1):10-20(1997);Dranoff等人，7fe1:111-2(1997)。重組的腺伴隨病毒載體(rAAV)是基于缺陷型的并且非病原的細(xì)小病毒腺伴隨病毒亞型的很有前途的備選基因遞送系統(tǒng)。所有的載體都是來(lái)源于僅保留位于轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒側(cè)面的AAV的145bp的倒置末端重復(fù)的質(zhì)粒。歸因于向所轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的基因組的整合的有效的基因轉(zhuǎn)移和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因遞送是這一載體系統(tǒng)的主要特征(Wagner等人，￡朋"/351:91171702-3(1998)，Keams等人，Ge"eTTzer.9:748-55(1996))。此外，可使用自身互補(bǔ)型重組腺伴隨病毒(scAAV)來(lái)源的載體。復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體(Ad)可以高效價(jià)被生產(chǎn)并且容易地感染許多不同的細(xì)胞類(lèi)型。大多數(shù)腺病毒載體被設(shè)計(jì)成使得轉(zhuǎn)基因取代AdEla、Elb和/或E3基因；之后復(fù)制缺陷型載體反過(guò)來(lái)在支持刪除基因功能的人類(lèi)293細(xì)胞中被繁殖。Ad載體可體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)多種類(lèi)型的組織，包括不分裂的分化的細(xì)胞例如在肝、腎和肌肉中存在的那些。常規(guī)的Ad栽體具有大的攜帶能力。Ad載體在臨床試驗(yàn)中使用的一個(gè)實(shí)例包括使用肌肉內(nèi)注射的用于抗腫瘤免疫法的多核苷酸治療(Sterman等人，//mw.777W7:1083-9(1998))。在臨床試驗(yàn)中用于基因轉(zhuǎn)移的腺病毒載體的使用的另外的實(shí)例包括Ros.enecker等人，24:15-10(1996);Sterman等人，77zw.9:71083-1089(1998);Welsh等人，//w附.T7zw2:205-18(1995);Alvarez等人，77zw5:597-613(1997);Topf等人，G騰Tte5:507-513(1998);Sterman等人，//證G騰TTzw7:1083-1089(1998)。包裝細(xì)胞被用于形成能夠感染宿主細(xì)胞的病毒顆粒。這種細(xì)胞包括包裝腺病毒的293細(xì)胞以及i(/2細(xì)胞或PA317細(xì)胞，其包裝反轉(zhuǎn)錄病毒。用于基因治療的病毒載體通常是通過(guò)將核酸載體包裝到病毒顆粒中的生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生的。載體通常含有包裝和之后向宿主的整合(如果可用)所需要的最少的病毒序列，其他的病毒序列被編碼有待表達(dá)的蛋白的表達(dá)盒所取代。丟失的病毒功能反過(guò)來(lái)由包裝細(xì)胞系提供。例如，基因治療中使用的AAV載體通常僅具有來(lái)自AAV基因組的倒置末端重復(fù)(ITR)序列，其是包裝和向宿主基因組整合所需要的。病毒DNA在細(xì)胞系中被包裝，所述細(xì)胞系含有編碼其他AAV基因即;？和rap的輔助質(zhì)粒，但缺少I(mǎi)TR序列。也用腺病毒作為輔助病毒感染細(xì)胞系。輔助病毒啟動(dòng)AAV載體的復(fù)制和來(lái)自輔助質(zhì)粒的AAV基因的表達(dá)。由于缺少I(mǎi)TR序列，大量的輔助質(zhì)粒不被包裝。腺病毒的污染可通過(guò)例如熱處理來(lái)減少，腺病毒對(duì)熱處理比AAV更敏感。在許多基因治療應(yīng)用中，高度的特異性地將多核苷酸(例如ZFN編碼序列和/或供體序列)遞送至特定的組織類(lèi)型是所期望的。相應(yīng)地，病毒載體可通過(guò)表達(dá)配體而被修飾成具有對(duì)給定的細(xì)胞類(lèi)型的特異性，所述配體為具有病毒外部表面上的病毒外殼蛋白的融合蛋白。配體被選擇以對(duì)已知存在于所感興趣的細(xì)胞類(lèi)型上的受體具有親和性。例如Han等人，iV"W./4cat/.5W.92:9747-9751(1995)，報(bào)道莫洛尼鼠白血病病毒可被修飾以表達(dá)與gp70融合的人類(lèi)調(diào)蛋白，并且重組的病毒感染某些表達(dá)人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體的人類(lèi)乳癌細(xì)胞。這一原理可被擴(kuò)展至其他病毒-靶細(xì)胞對(duì)，其中靶細(xì)胞表達(dá)受體而病毒表達(dá)含有細(xì)胞表面受體的配體的融合蛋白。例如，絲狀噬菌體可被設(shè)計(jì)成展示抗體片段(例如FAB或Fv)，所述抗體片段實(shí)際上對(duì)任何所選擇的細(xì)胞受體具有特異的結(jié)合親和性。盡管上述描述主要應(yīng)用于病毒載體，但相同的原理可被應(yīng)用于非病毒栽體。這些載體可被設(shè)計(jì)成含有特定的攝取序列，其有助于通過(guò)特定的靶細(xì)胞攝取?；蛑委熭d體可通過(guò)對(duì)個(gè)別的患者施用，通常通過(guò)全身施用(例如靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌肉內(nèi)的、皮下的或顱內(nèi)的輸注)或如下文所描述的局部應(yīng)用而被體內(nèi)遞送。可選擇地，栽體可被離體遞送至細(xì)胞，例如從個(gè)別的患者移植的細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞、骨髓吸出物、組織的活組織檢查)或普通供體的造血干細(xì)胞，之后，通常在選擇具有合并的栽體的細(xì)胞之后，將細(xì)胞再植入患者中。用于診斷、研究或用于基因治療(例如經(jīng)由轉(zhuǎn)染細(xì)胞向宿主生物體的再輸注)的離體細(xì)胞轉(zhuǎn)染是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所熟知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將細(xì)胞從受治療生物體分離，用ZFP核酸(基因或cDNA)和外源序列轉(zhuǎn)染并再輸注回所述受治療生物體(例如患者)中。適于離體轉(zhuǎn)染的各種細(xì)胞類(lèi)型是本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員熟知的(參見(jiàn)，例如Freshney等人.,CWfweo/zim'ma/CW/s,爿Afa"wa/o/5os7'c7fec/w/《we(動(dòng)物纟田月包i吾養(yǎng),基本技術(shù)手冊(cè))(第3版.1994))和其中引用的關(guān)于如何從患者分離并培養(yǎng)細(xì)胞的討論的參考文獻(xiàn))。在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞被用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染和基因治療的離體程序哺乳動(dòng)物(例如細(xì)胞的供體)中，在所述哺乳動(dòng)物中它們將移植到骨髓中。使用細(xì)胞因子例如GM-CSF、IFN-y和TNF-a將CD34+細(xì)胞體外分化為臨床上重要的免疫細(xì)胞類(lèi)型的方法是已知的(參見(jiàn)Inaba等人，/Med176:1693-1702(1992))。使用已知的方法將干細(xì)胞分離以用于轉(zhuǎn)導(dǎo)和分化。例如，通過(guò)用與不需要的細(xì)胞例如CD4+和CD8+(T細(xì)胞)、CD45+(panB細(xì)胞)、GR-1(粒細(xì)胞)和Iad(分化的抗原呈遞細(xì)胞)結(jié)合的抗體來(lái)淘選骨髓細(xì)胞可將干細(xì)胞從骨髓細(xì)胞分離(參見(jiàn)Inaba等人，/M^/.176:1693-1702(1992))。含有如本文所述的核酸的載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、脂質(zhì)體等)也可被直接施用于生物體以便進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)?？蛇x擇地，可施用棵露的DNA。施用通過(guò)通常用于將分子引入與血液或組織細(xì)胞最終接觸的路線(xiàn)中的任何一種，包括但不限于注射、輸注、局部應(yīng)用和電穿孔。施用這種且，盡管多于一種的路線(xiàn)可被用于施用特定的組合物，但是特定的路線(xiàn)常?？商峁┍攘硗獾穆肪€(xiàn)更直接和更有效的反應(yīng)。用于將DNA引入造血干細(xì)胞的方法被公開(kāi)在例如，美國(guó)專(zhuān)利第5，928，638號(hào)中。用于將轉(zhuǎn)基因引入造血干細(xì)胞例如CD34+細(xì)胞中的載體包括腺病毒35型。適用于將轉(zhuǎn)基因引入免疫細(xì)胞(例如T細(xì)胞)中的載體包括非整合的慢病毒載體。參見(jiàn)，例如Ory等人(1996)A^/.^cad5W.OSL493:11382-11388;Dull等人(1998)JWra/.72:8463-8471;Zuffery等(1998)/72:9873-9880;Follenzi等人(200Q)淑,25:217-222。藥學(xué)上可接受的載體(carrier)部分地通過(guò)正在被施用的特定的組合物以及通過(guò)用于施用組合物的特定的方法而確定。相應(yīng)地，如下文所描述的，有可獲得的藥物組合物的各種適用的制劑(參見(jiàn)例如Aem/"gto"、尸/z"mzacw"c^/Sc/e"c^(雷明頓藥學(xué))，第17版，1989)。如上文所提到的，使用例如WO2007/014275中所描述的方法，一種或多種ZFN融合蛋白也可作為多肽被引入細(xì)胞中。蛋白遞送運(yùn)載體的非限制性實(shí)例包括"膜易位多肽"例如具有兩親性或疏水氨基酸子序列的肽、毒素分子、脂質(zhì)體和脂質(zhì)體衍生物例如免疫脂質(zhì)體(包括靶向脂質(zhì)體)，其中所述兩親性或疏水氨基酸子序列具有作為膜易位載體的能力。為了治療或預(yù)防應(yīng)用，例如癌、局部缺血、糖尿病性一見(jiàn)網(wǎng)膜病、黃斑變性、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、HIV感染、鐮狀細(xì)胞性貧血、阿爾茲海默病、肌營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)變性疾病、血管疾病、囊性纖維化、中風(fēng)和類(lèi)似疾病，ZFP和編碼ZFP的表達(dá)載體可被直接施用于患者以便靶向的切割整合到PPP1R12C中。治療上有效的量的施用是通過(guò)通常用于將ZFP引入與有待治療的組織最終接觸的路線(xiàn)中的任何一種。以任何適合的方式施用ZFP，優(yōu)選地用藥的那些技術(shù)人員所熟知的，并且盡管多于一種的路線(xiàn)可被用于施用特定的組合物，但是特定的路線(xiàn)常?？商峁┍攘硗獾穆肪€(xiàn)更直接和更有效的反應(yīng)。藥學(xué)上可接受的載體部分地通過(guò)正在被施用的特定的組合物以及通過(guò)用于施用組合物的特定的方法而確定。相應(yīng)地，有可獲得的藥物組合物的各種適用的制劑(參見(jiàn)例如iem/"gto";y尸/wrw"cez^/ca/5We"ces(雷明頓藥學(xué))，第17版，1985))。"霧化")以經(jīng)由吸入而被施用。氣溶膠制劑可被放置在加壓的可接受的推進(jìn)劑例如二氯二氟曱烷、丙烷、氮?dú)夂皖?lèi)似物中。適用于腸胃外例如，諸如通過(guò)靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)和皮下路線(xiàn)施用的制劑包括含水和非含水的等滲的無(wú)菌注射液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使得制劑與預(yù)期的接受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及含水和非含水的無(wú)菌懸浮液，其可含有懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。所公開(kāi)的組合物可例如通過(guò)靜脈內(nèi)輸注、口服地、局部地、腹膜內(nèi)地、膀胱內(nèi)地或鞘內(nèi)地被施用。化合物的制劑可存在于單位劑量或多劑量的密封的容器例如安瓿和小瓶中。注射液和懸浮液可從之前描述過(guò)的類(lèi)型的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。實(shí)施例實(shí)施例1:靶向PPP1R12C的鋅指核酸酶的設(shè)計(jì)按照國(guó)際公布WO2007/014275中所描述的，設(shè)計(jì)含有一對(duì)4-指的鋅指蛋白核酸酶(ZFN)的融合蛋白，并用噬菌體展示依照公開(kāi)的流程(Rebar&Pabo(1994)5We"ce263(5147):671陽(yáng)3;Greisman&Pabo(1997)5Wewe275(5300):657-61)優(yōu)化以誘導(dǎo)如圖1所示的PPP1R12C的內(nèi)含子1中的雙鏈斷裂。ZFN靶序列對(duì)應(yīng)于人類(lèi)染色體19的"-"鏈的位置60318932-60318961(UCSC人類(lèi)基因組發(fā)布，2006年3月)。表1顯示示例性的靶向PPP1R12C的ZFN，其被用于向PPP1R12C基因座的靶向整合實(shí)驗(yàn)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>實(shí)施例2:向PPP1R12C基因座的把向整合通過(guò)使用相同基因座的1,647bp的片段(位置60318104-60319750)并將"剪接受體-FMDV2A-GFP-poly(A)"盒引入ZFN的9931和10099結(jié)合位點(diǎn)之間的位置來(lái)設(shè)計(jì)供體。如Umov等人(2005)Atoww435:646-651和Moehle等人(2007)PNAS194:305中所描述的制備ZFN和供體構(gòu)建體，除了Fokl內(nèi)切核酸酶的專(zhuān)性異源二聚體形式被用于ZFN表達(dá)構(gòu)建體(參見(jiàn)上文標(biāo)題為"切割結(jié)構(gòu)域"的章節(jié))并被引入K562、293T、Hep3B或HEK293細(xì)胞。如Moehle等人(2007)A^7」c^/.<SW.L4104:3055-3060所描述的，轉(zhuǎn)染七十二小時(shí)后，通過(guò)放射標(biāo)記的PCR測(cè)定來(lái)測(cè)定靶向整合(TI)的比例。同樣如Moehle等人(2007)所描述的，轉(zhuǎn)染兩個(gè)星期后，通過(guò)FACS測(cè)定GFP陽(yáng)性細(xì)^^的百分比。結(jié)果示于圖3和4中。靶向整合的頻率分析(圖3A和B)證實(shí)在K562(圖3A)和293T(圖3B)細(xì)胞中供體序列向PPP1R12C的整合在ZFN存在的情況下顯著增加。DNA印記法證實(shí)了PCR分析的結(jié)果(見(jiàn)圖7B)。此外，如圖4中所示，通過(guò)FACS分析GFP表達(dá)還證實(shí)了GFP供體序列被整合進(jìn)PPP1R12C中。特別地，沒(méi)有ZFN表達(dá)構(gòu)建體的共引入，供體GFP序列整合進(jìn)PPP1R12C的頻率(圖4A)是可忽略的。ZFN存在的情況下，其中供體序列被整合進(jìn)PPP1R12C中的靶位點(diǎn)的細(xì)胞的百分比增加至13.09%(圖4B)。同樣地，在293T細(xì)胞中，供體序列沒(méi)有被整合進(jìn)野生型細(xì)胞中(圖4C，0%)但是在靶向PPP1R12C的ZFN存在的情況下被整合進(jìn)3.66%的細(xì)胞中(圖4D)。在Hep3B細(xì)胞中，在耙向PPP1R12C的ZFN不存在的情況下供體序列被整合至0.65%的細(xì)胞中(圖4E)，而在靶向PPP1R12C的ZFN存在的情況下被整合至1.73%的Hep3B纟田月包中(圖4F)。因此，不同細(xì)胞類(lèi)型中，ZFN驅(qū)動(dòng)無(wú)啟動(dòng)子外源編碼序列耙向整合至PPP1R12C"安全港"基因座中。實(shí)施例3:PPP1R12C/p84mRNA的定量RT-PCR測(cè)量進(jìn)行了涉及一組通常所用的轉(zhuǎn)化細(xì)胞類(lèi)型(HEK293(293T)、成纖維細(xì)胞、K562、HeLa、DU-145、Hep3B)的PPP1R12C/p84mRNA水平的定量RT-PCR測(cè)量以研究基因是否在多種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。結(jié)果被表示為PPP121R12C基因座相對(duì)于18S或GAPDH的表達(dá)的比率。簡(jiǎn)單的說(shuō)，使用PPP1R12C的定制的基因表達(dá)測(cè)定(ABI)，如在Tan等人(2003)尸rac.AW"^.固100:11997-12002)中所描述的通過(guò)AppliedBiosystems7300TaqMan機(jī)上的實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)量了PPP1R12CmRNA的水平。結(jié)果示于圖5，證實(shí)了PPP1R12C/p84是被廣泛轉(zhuǎn)錄的，與指示了PPP1R12C實(shí)施例4:向PPP1R12C基因座的靶向整合為了測(cè)定用于基因添加的PPP1R12C(p84)基因基因座的效用，經(jīng)由使用一組可選擇的ZFN設(shè)計(jì)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和測(cè)量核酸酶測(cè)定的篩選鑒定來(lái)自表1中所示的ZFN組的引導(dǎo)ZFN以測(cè)定DSB誘導(dǎo)的效率(Miller等人(2007)所o&c/wo/.25(7):778-85)。這一測(cè)定測(cè)量PPPlR12C/p84衍生的攜帶DSB》務(wù)復(fù)的遺傳標(biāo)志(geneticsignature)的染色單體的部分經(jīng)由非同源末端連接產(chǎn)生的小的插入和缺失。對(duì)于所有向PPPlR12C/p84的靶向整合的實(shí)驗(yàn)，我們使用了與染色體基因座同源的1.6kb的供體DNA構(gòu)建體(Urnov等人，Nature.2005435(7042):646-51)并使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)引入所描述的異源序列段(stretches)。使用唯一的SnaBI位點(diǎn)，ALNGFR細(xì)胞表面標(biāo)記的自主表達(dá)盒被引入供體構(gòu)建體的右側(cè)同源性臂的外部。如Urnov等人(上文)中所描述的培養(yǎng)HEK293和K562細(xì)胞并用DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染。如圖6中所示，與顯示無(wú)整合的陰性對(duì)照相比，所測(cè)試的所有ZFN對(duì)整合供體構(gòu)建體。這些數(shù)據(jù)證實(shí)有效地將DSB靶向至PPPlR12C/p84基因基因座的所期望的區(qū)域中的ZFN已經(jīng)獲得。此外，這一測(cè)定中鑒定的引導(dǎo)ZFN對(duì)(15556/15590，圖6的泳道5)將DSB1,800bp引入PPPlR12C/p84基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，即距原始啟動(dòng)子序列足夠遠(yuǎn)以允許用于將開(kāi)放讀碼框添加至這一基因座的無(wú)啟動(dòng)子的供體DNA設(shè)計(jì)(圖7A)。之前我們已經(jīng)展示了靶向DNA位點(diǎn)的ZFP的優(yōu)化增加了基因組編輯速率。參見(jiàn)例如Urnov等人(2005)。與這一觀(guān)察結(jié)果相一致，PPPlR12C/p84的引導(dǎo)ZFN的優(yōu)化也導(dǎo)致了切割活性的顯著增強(qiáng)(-4倍增加)，產(chǎn)生了顯示出五分之一的編輯染色單體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞的群體。實(shí)施例4:ZFN介導(dǎo)的位點(diǎn)特異的基因添加效的位點(diǎn)特異的添加，我們使用了無(wú)啟動(dòng)子的供體DNA設(shè)計(jì)，其利用了原始PPPlR12C/p84啟動(dòng)子以產(chǎn)生標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞(圖7a)。這一供體質(zhì)粒包括兩個(gè)750bp的序列段，該序列段與被無(wú)啟動(dòng)子的GFPORF和多腺苷酸化信號(hào)序列所中斷的PPPlR12C/p84基因座的內(nèi)含子1中的DSB位點(diǎn)側(cè)面區(qū)域同源。當(dāng)PPPlR12C/p84中的外顯子1被翻譯，為獲得原始PPPlR12C/p84啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP表達(dá)，我們?cè)贠RF的上游，2A核糖體打滑信號(hào)之前(參見(jiàn)Fang等人(2005)A^S/ofec^.23:584)包含了剪接受體位點(diǎn)(圖7A)。如圖7A中所描述的，這一盒向PPPlR12C/p84基因座的真實(shí)的位點(diǎn)特異的基因添加將導(dǎo)致由PPPlR12C/p84啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的單一轉(zhuǎn)錄，所迷啟動(dòng)子包括PPPlR12C/p84的外顯子1和標(biāo)記GFPORF。作為2A肽序列的結(jié)果，這一mRNA的翻譯將導(dǎo)致2個(gè)分離的多肽的產(chǎn)生(i)由PPPlR12C/p84的外顯子1編碼的肽，以及(ii)完整的GFP多肽。使用臺(tái)式迷你FACS設(shè)備(GuavaTechnologies)進(jìn)行了FACS分析，并且使用WinMDI軟件進(jìn)一步分析了數(shù)據(jù)。如所描述的(Urnov等人，2005)通過(guò)高定量PCR測(cè)定進(jìn)行了以DNA為基礎(chǔ)的耙向整合頻率的分析，除了省略了限制性酶消化的步驟(唯一的例外是實(shí)驗(yàn)使用引入含有NcoI識(shí)別位點(diǎn)的30bp小片段(patch)的供體，其中野生型和攜帶整合的染色體之間小型差異需要限制性酶消化的使用)。如所描述的(Urnov等人，2005)進(jìn)行了使用Dpnl(消除過(guò)量的供體DNA)和Accl(消化基因組DNA)消化的基因組DNA的DNA印跡。如主要在Miller等人(2007)Wa/.25(7):778-785和Tan等人(2003)PraciVaf/"5^4100:11997-12002用編碼ZFN的質(zhì)粒DNA和供體DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的K562細(xì)胞的分析證實(shí)，如通過(guò)PCR和通過(guò)DNA印跡所估計(jì)的，平均上，細(xì)胞群體中10%的染色單體已經(jīng)獲得供體特異的盒(圖7B)。之后在不存在任何選擇的情況下將修飾的細(xì)胞培養(yǎng)一個(gè)月(超過(guò)30次群體倍增)。與在第2天獲得的分子數(shù)據(jù)(圖7B,泳道2)—致，盡管培養(yǎng)的時(shí)間延長(zhǎng)，在ZFN和供體處理的池中觀(guān)察到13%的GFP陽(yáng)性細(xì)胞，而少于1。/。的單獨(dú)用供體質(zhì)粒處理的細(xì)胞表達(dá)GFP。這些數(shù)據(jù)顯示無(wú)啟動(dòng)子的標(biāo)記ORF向人類(lèi)PPPlR12C/p84基因座的添加在不存在用于期望事件的選擇的情況下，產(chǎn)生高頻率的穩(wěn)定的標(biāo)記陽(yáng)性的細(xì)胞。為了測(cè)定這些觀(guān)察結(jié)果的普遍性，我們用不同來(lái)源的兩個(gè)另外的常用的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)(HEK293,通過(guò)神經(jīng)元細(xì)胞的腺病毒轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞系，以及Hep3B,肝細(xì)胞癌)。注意到內(nèi)源PPPlR12C/p84啟動(dòng)子在這兩種細(xì)胞類(lèi)型中都是有活性的，我們使用了與之前相同的無(wú)啟動(dòng)子的GFP供體質(zhì)粒(圖7A，上部的圖)并能夠荻得在PPPlR12C/p844基因座攜帶添加ZFN的ORF的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的池。值得注意的是，除了使用對(duì)所感興趣的細(xì)胞類(lèi)型特異的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件，沒(méi)有其他的修飾是進(jìn)行GFPORF添加的試劑所必需的。位點(diǎn)特異性的穩(wěn)定的基因添加可通過(guò)適合的質(zhì)粒DNA對(duì)一組常用的人類(lèi)細(xì)胞的簡(jiǎn)單的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染迅速地獲得。實(shí)施例5:向PPPlR12C/p84的基因添加導(dǎo)致穩(wěn)定的表達(dá)水平經(jīng)由外源DNA經(jīng)由質(zhì)粒或病毒遞送的隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)基因常常導(dǎo)致變化的初始基因表達(dá)水平以及表達(dá)隨時(shí)間的不穩(wěn)定性。為了確定ZFN介導(dǎo)的向PPP1Rl2C/p84基因座的位點(diǎn)特異的基因添加是否將克服這些限制，我們將K562細(xì)胞暴露于編碼ZFN和GFPORF的質(zhì)粒，在不存在任何選擇劑的情況下使細(xì)胞增殖(expand)4周，并且之后用FACS以分離GFP陽(yáng)性細(xì)胞池。較大的(含有轉(zhuǎn)基因的)染色單體的PCR擴(kuò)增不如在混合細(xì)胞群體中較小的野生型等位基因的擴(kuò)增有效。將這一差異標(biāo)準(zhǔn)化，我們通過(guò)PCR對(duì)這些細(xì)胞中的PPPlR12C/p84基因座進(jìn)行基因分型，其顯示80°/。的染色單體在PPPlR12C/p84基因基因座攜帶插入的ORF(圖8E，泳道2)。重要地是，沒(méi)有用于GFP表達(dá)的另外的分選的有限的稀釋產(chǎn)生一組20個(gè)單細(xì)胞來(lái)源的克隆系，其被發(fā)現(xiàn)以單等位基因的或二對(duì)等位基因的構(gòu)型并以與PCR基因分型的結(jié)果完全一致的相對(duì)頻率在PPPlR12C/p84攜帶精確插入的GFP盒。為了確定GFP表達(dá)的穩(wěn)定性，將代表性的對(duì)照K562細(xì)胞、GFP陽(yáng)性的FACS富集細(xì)胞池和對(duì)于PPPlR12C/p84的GFP插入來(lái)說(shuō)單等位基因的和二對(duì)等位基因的兩個(gè)單細(xì)胞克隆系培養(yǎng)50次細(xì)胞倍增并每?jī)芍軠y(cè)定GFP表達(dá)水平。數(shù)據(jù)示于圖8A，顯示(i)在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中沒(méi)有平均焚光強(qiáng)度的損失；(ii)在GFP陽(yáng)性細(xì)胞池中標(biāo)記陰性細(xì)胞的整體分?jǐn)?shù)沒(méi)有變化(~5%);并且(iii)對(duì)于PPPlR12C/p84處的GFP盒來(lái)說(shuō)純合的細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度始終高于雜合的細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)證實(shí)ZFN激活的向PPPlR12C/p84基因基因座的ORF添加產(chǎn)生設(shè)計(jì)的"內(nèi)源啟動(dòng)子陷阱"所期望的表達(dá)的長(zhǎng)期穩(wěn)定性和一致性。實(shí)施例6:ZFN驅(qū)動(dòng)的自主表達(dá)盒的添加為了擴(kuò)展^f吏用用于由PPPlR12C/p84啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的標(biāo)記表達(dá)的無(wú)啟動(dòng)子的GFPORF系統(tǒng)獲得的結(jié)果(圖7)，我們接下來(lái)評(píng)估使用編碼自主表達(dá)盒的供體DNA設(shè)計(jì)的可行性這一所謂的"啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄單位"(PTU)攜帶它自己的啟動(dòng)子，之后是有待被轉(zhuǎn)錄的序列段(例如編碼shRNA的構(gòu)建體或cDNA)和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(例如聚(A)序列段或RNA聚合酶III終止子)。我們修飾了我們的供體質(zhì)粒以含有shRNA的表達(dá)盒。這一供體DNA設(shè)計(jì)以圖解形式示于圖8B中。我們選^^f呆留無(wú)啟動(dòng)子GFPORF系統(tǒng)的元件作為將已經(jīng)經(jīng)歷了真實(shí)的向PPPlR12C/p84基因座的基因添加的細(xì)胞標(biāo)記的方法。GFP盒的下游我們包括了靶向細(xì)胞表面標(biāo)記CD58(已49知將在K562細(xì)胞中表達(dá))的shRNA表達(dá)盒，由此將GFP表達(dá)(由PPPlR12C/p84驅(qū)動(dòng))與shRNA表達(dá)構(gòu)建體在同一基因座的整合物理相連。用ZFN和含有shRNA的供體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞48小時(shí)后的定量PCR分析表明8%的PPPlR12C/p84染色單體已經(jīng)獲得位于靶位點(diǎn)的ORF-PTU盒。GFP陽(yáng)性細(xì)胞池的FACS分選產(chǎn)生~10倍富集的ZFN修飾的染色單體(圖8D)。為了確定插入的shRNA盒的效力，我們通過(guò)對(duì)CD58(shRNA分子的靶)的FACS染色對(duì)比了對(duì)照細(xì)胞和PPPlR12C/p84ZFN/供體修飾的細(xì)胞。重要的是，CD58的細(xì)胞表面染色在30次細(xì)胞群體倍增之后甚至顯著下降并且在數(shù)量級(jí)上與在用shRNA表達(dá)質(zhì)粒本身瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后所觀(guān)察到的差不多。參見(jiàn)圖8C。值得注意的是48小時(shí)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染樣品證實(shí)靶基因減少與在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因背景下攜帶僅僅1個(gè)或2個(gè)拷貝的細(xì)胞中所觀(guān)察到的差不多。使用只有GFP的供體(即位點(diǎn)特異性基因添加但是無(wú)shRNA盒)平行產(chǎn)生的ZFN修飾的細(xì)胞的池產(chǎn)生正常水平的CD58染色，而其中CD58抗體被省略的對(duì)照樣品中只提供了殘余的焚光?？偟膩?lái)說(shuō)，這些數(shù)據(jù)證實(shí)快速的、無(wú)藥物選擇的、一步標(biāo)記的并且分離在特異性位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞群體的用于穩(wěn)定表達(dá)PTU的無(wú)啟動(dòng)子的GFP連接的PTU供體系統(tǒng)的效用。實(shí)施例7:ZFN驅(qū)動(dòng)的PPPlR12C/p84基因耙向的特異性我們使用兩個(gè)公認(rèn)的測(cè)定以實(shí)驗(yàn)性的研究使用以質(zhì)粒為基礎(chǔ)的遞送的ZFN驅(qū)動(dòng)的基因添加的特異性。首先，我們測(cè)量了使用充分研究的DSB修復(fù)的標(biāo)志的DSB全基因組的產(chǎn)生，所述標(biāo)志即以在修復(fù)位點(diǎn)的磷酸化的組蛋白變體H2A.X為焦點(diǎn)的集合(Paull等人(2000)Cw〃歷o/10:886-895)。我們進(jìn)行了與陽(yáng)性對(duì)照Z(yǔ)FN(靶向IL2Ry基因座)平行進(jìn)行的這些測(cè)定。耙向PPPlR12C/p84和IL2Ry的ZFN使用Fokl內(nèi)切核酸酶的高保真的"專(zhuān)性異源二聚體"形式，其被設(shè)計(jì)成限制ZFN對(duì)與它們所需要的靶的作用。參見(jiàn)Miller等人(2007);V饑S/ofec/wo/.25(7):778-785。在這些靶向IL2Ry的ZFN的例子中，產(chǎn)生了在/p84ZFN顯示出與用靶向IL2Ry的ZFN獲得的那些在統(tǒng)計(jì)學(xué)上難以區(qū)別的H2A.X染色水平。參見(jiàn)圖9A和9B。相反，使用誘導(dǎo)DSB的藥物依托泊香的處理產(chǎn)生H2A.X信號(hào)的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，因此證實(shí)了測(cè)定的功能性。其次，我們想知道PPPlR12C/p84ZFN的表達(dá)是否將增加供體DNA隨機(jī)整合至基因組中的比例。為了解決這一問(wèn)題，我們使用攜帶位于供體同源性臂的外部的用于細(xì)胞表面標(biāo)記的自主表達(dá)盒(ANGFR)的質(zhì)粒供體DNA,主要如Moehle等人(2007)中所描述的。質(zhì)粒的錯(cuò)整合(misintergation)將產(chǎn)生ANGFR盒的結(jié)合和表達(dá)，其同源性指導(dǎo)的修復(fù)產(chǎn)生沒(méi)有ANGFR表達(dá)的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。與較早的檢測(cè)靶向IL2Ry基因座的ZFN的工作(Moehle等人，2007;Urnov等人，2005)相一致，我們發(fā)現(xiàn)在僅用供體DNA處理的細(xì)胞中觀(guān)察到的上文的供體質(zhì)粒錯(cuò)整合率沒(méi)有增加。相反，加入依托泊苷(DNA損害誘導(dǎo)藥物)導(dǎo)致ANGFR細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加。這些數(shù)據(jù)表明PPPlR12C/p84定向的核酸酶在所使用的測(cè)定的靈敏度的范圍內(nèi)，沒(méi)有產(chǎn)生多于一種的高于背景的DSB，也沒(méi)有驅(qū)動(dòng)供體質(zhì)粒隨機(jī)整合上的可測(cè)量的增加。因此，在ZFN特異性的兩個(gè)測(cè)定(每基因組的ZFN誘導(dǎo)的DSB數(shù)目的直接測(cè)量和經(jīng)由隨機(jī)整合的間接讀數(shù))中，PPPlR12C/p84ZFN顯示了高特異性，支持了它們?cè)诋a(chǎn)生轉(zhuǎn)化的人類(lèi)細(xì)胞系中的使用。本文提及的所有專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)和公布適用于所有目的地通過(guò)引用全文并入本文。盡管為了清楚理解的目的已經(jīng)通過(guò)示例性說(shuō)明和實(shí)施例的方法較詳細(xì)地提供了公開(kāi)內(nèi)容，但是對(duì)本領(lǐng)域那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)明顯的是在不背離本公開(kāi)內(nèi)容的精神或范圍的情況下可進(jìn)行各種改變和修飾。相應(yīng)地，前述說(shuō)明和實(shí)施例不應(yīng)被解釋為是限制性的。權(quán)利要求1.一種用于在細(xì)胞中表達(dá)外源核酸序列的產(chǎn)物的方法，所述方法包括(a)在所述細(xì)胞中表達(dá)第一融合蛋白，所述第一融合蛋白包括第一DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第一切割結(jié)構(gòu)域或第一切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第一DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域已被設(shè)計(jì)成與所述細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因中的第一靶位點(diǎn)結(jié)合；以及(b)在使得所述第一融合蛋白在所述PPP1R12C基因中切割所述細(xì)胞的基因組并且所述外源核酸序列被插入切割位點(diǎn)中并被表達(dá)的條件下，將所述細(xì)胞與包括外源核酸序列的多核苷酸接觸。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域是鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其還包括在所述細(xì)胞中表達(dá)第二融合蛋白，所述第二融合蛋白包括第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域，其中所述第二鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述細(xì)胞的基因組的PPP1R12C基因中的第二靶位點(diǎn)結(jié)合，其中所述第二靶位點(diǎn)與所述第一靶位點(diǎn)不同；其中所述第一融合蛋白與所述第一靶位點(diǎn)的結(jié)合和所述第二融合蛋白與所述第二輩巴位點(diǎn)的結(jié)合定位所述切割半結(jié)構(gòu)域，使得所述細(xì)胞的基因組在所述PPP1R12C基因中被切割，由此導(dǎo)致外源序列在所述PPP1R12C基因中整合到所迷細(xì)胞的基因組中并表達(dá)所述外源序列的產(chǎn)物。4.如權(quán)利要求1至3中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源核酸序列編碼多肽。5.如權(quán)利要求1至3中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源核S吏序列產(chǎn)生多核苷酸。6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述多肽選自由抗體、抗原、酶、生長(zhǎng)因子、受體(細(xì)胞表面或細(xì)胞核)、激素、淋巴因子、細(xì)胞因子、報(bào)道分子、其功能片段和其組合所組成的組。7.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述報(bào)道分子包括GFP。8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述多核苷酸選自由一個(gè)或多個(gè)shRNA、一個(gè)或多個(gè)RNAi分子、一個(gè)或多個(gè)miRNA和其組合組成的組。9.如權(quán)利要求1至8中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源序列還包括啟動(dòng)子。10.如權(quán)利要求1至8中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源序列不包括啟動(dòng)子。11.如權(quán)利要求1至10中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源序列還包括第一核苷酸序列，所述第一核芬酸序列與所述PPPR12C基因中的第一序列同源但不相同。12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述外源序列還包括第二核苦酸序列，所述第二核苷酸序列與所述PPP1Rl2C基因中的第二序列同源但不相同。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述第一核苷酸序列和第二核香酸序列位于所述外源序列側(cè)面。14.如權(quán)利要求1至13中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述外源序列是質(zhì)粒。15.如權(quán)利要求1至13中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述多核苷酸是線(xiàn)狀DNA分子。16.—種用于筌定向細(xì)胞的基因組整合外源序列的方法，所述方法包括如權(quán)利要求1至15中的任何一項(xiàng)在所迷細(xì)胞中表達(dá)外源序列，其中所述外源核酸序列包括標(biāo)記基因；以及鑒定表達(dá)所述標(biāo)記基因的細(xì)胞，由此鑒定所述外源序列已經(jīng)被整合至其中的細(xì)胞。17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述外源序列被可操作地連接至啟動(dòng)子。18.如權(quán)利要求16或17所述的方法，其中所述標(biāo)記基因包括篩選標(biāo)記。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述篩選標(biāo)記包括GFP。20.如權(quán)利要求1至19中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一切割半結(jié)構(gòu)域和第二切割半結(jié)構(gòu)域來(lái)自IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶選自由和S&I組成的組。22.如權(quán)利要求1至21中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞被停滯在細(xì)胞周期的G2期。23.如權(quán)利要求1至22中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中所述融合蛋白中的至少一個(gè)包括所述切割半結(jié)構(gòu)域的二聚化界面的氨基酸序列中的改變。24.如權(quán)利要求1至23所述的方法，其中所述細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述細(xì)胞是人類(lèi)細(xì)胞。26.如權(quán)利要求2至25中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)鋅指，從N-末端至C-末端依次為Fl至F4并且進(jìn)一步地其中Fl包括YNWHLQR(SEQIDNO:16);F2包括RSDHLTT(SEQIDNO:8);F3包括HNYARDC(SEQIDNO:9);以及F4包括QNSTRIG(SEQIDNO:15)。27.如權(quán)利要求2至26中的任何一項(xiàng)所述的方法，其中鋅指結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)鋅指，從N-末端至C-末端依次為Fl至F4并且進(jìn)一步地其中Fl包括QSSNLAR(SEQIDNO:3);F2包括RTDYLVD(SEQIDNO:11);F3包括YNTHLTR(SEQIDNO:12);以及F4包括QGYNLAG(SEQIDNO:13)。28.—種設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，其與PPP1R12C基因結(jié)合，其中所述蛋白包括四個(gè)鋅指并且所述鋅指中的每一個(gè)的識(shí)別區(qū)域的氨基酸序列如下Fl包括YNWHLQR(SEQIDNO:16);F2包括RSDHLTT(SEQIDNO:8);F3包括HNYARDC(SEQIDNO:9);以及F4包括QNSTRIG(SEQIDNO:15)。29.—種設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，其與PPP1R12C基因結(jié)合，其中所述蛋白包括四個(gè)鋅指并且所述鋅指中的每一個(gè)的識(shí)別區(qū)域的氨基酸序列如下Fl包括QSSNLAR(SEQIDNO:3);F2包括RTDYLVD(SEQIDNO:11);F3包括YNTHLTR(SEQIDNO:12);以及F4包括QGYNLAG(SEQIDNO:13)。30.如權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的設(shè)計(jì)的鋅指蛋白，其還包括切割結(jié)構(gòu)域或切割半結(jié)構(gòu)域。31.如權(quán)利要求28至30的任何一項(xiàng)所述的蛋白，其中所述切割半結(jié)構(gòu)域來(lái)自IIS型限制性?xún)?nèi)切核酸酶。32.如權(quán)利要求31所述的蛋白，其中所述ns型限制性?xún)?nèi)切核酸酶選自由FoM和S&I組成的組。全文摘要本文所公開(kāi)的是用于將外源序列靶向整合至人類(lèi)PPP1R12C基因座中的方法和組合物，例如，以便表達(dá)感興趣的多肽。文檔編號(hào)C12N15/10GK101679977SQ200880018836公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年4月24日優(yōu)先權(quán)日2007年4月26日發(fā)明者D·帕斯喬恩,F·諾弗,P·D·格雷戈里,P·譚,R·迪克勒弗申請(qǐng)人:桑格摩生物科學(xué)股份有限公司