本發(fā)明屬于果樹病理學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的方法。

背景技術(shù)：

葡萄病害種類多，危害嚴(yán)重，其中葡萄黑痘病分布廣泛，在我國南北多雨地區(qū)大量發(fā)生，發(fā)病嚴(yán)重時最高可造成果實損失50％，嚴(yán)重影響了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，已經(jīng)成為制約葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要因素之一。葡萄黑痘病是由葡萄痂囊腔菌(Elsinoe ampelina)引起的一種真菌性病害，危害葡萄的新梢、蔓、葉柄、葉脈、果柄及果實等部位。

葡萄痂囊腔菌的無性階段為半知菌亞門痂圓孢菌屬，有性階段為子囊菌亞門痂囊腔菌屬，在人工培養(yǎng)基上生長緩慢。據(jù)報道，葡萄痂囊腔菌在谷類瓊脂培養(yǎng)基上生長較好，但培養(yǎng)8周才能達到8cm²左右。該病原菌極難產(chǎn)孢，目前主要通過紫外輻射處理和加水培養(yǎng)獲得孢子，但產(chǎn)孢不穩(wěn)定，操作不便，尤其是產(chǎn)孢量小。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對葡萄痂囊腔菌是葡萄黑痘病的病原菌，該菌生長緩慢，且產(chǎn)孢困難的技術(shù)難題，本發(fā)明的目的在于，提供一種誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的方法。

為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案：

一種誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的方法，其特征在于，按以下步驟進行：

(1)取生長在裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿生長15天的葡萄黑痘病病原真菌菌落的外圈菌絲體接種于新的無菌裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中；

(2)25℃下黑暗培養(yǎng)25天后，將培養(yǎng)瓶在21℃下，黑暗放置24小時；

(3)用無菌手術(shù)刀刮取菌落表面組織，擠壓成粉末狀，然后放入無菌水中，震蕩30秒，取上清液用血球計數(shù)板進行葡萄痂囊腔菌孢子計數(shù)，得到葡萄痂囊腔菌孢子。

根據(jù)本發(fā)明，所述的PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配方為：1000毫升純水、200克馬鈴薯、20克葡萄糖、15克瓊脂。

進一步的，所述的培養(yǎng)瓶為玻璃材質(zhì)，塑料瓶蓋上有0.22微米的微孔，能過濾微生物的透氣膜，其規(guī)格為250毫升，口徑、胸徑和瓶高的尺寸分別為5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。

根據(jù)本發(fā)明，所述的葡萄痂囊腔菌的DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA。

本發(fā)明的誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的方法，操作簡單，能夠穩(wěn)定獲得較多的葡萄痂囊腔菌分生孢子，以便用于篩選抗黑痘病的葡萄種質(zhì)，為抗病育種和葡萄病理研究提供保障。

附圖說明

圖1是葡萄黑痘病菌的分離和鑒定。A圖是從‘紅地球’葉片病健交界處長出的菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基上生長10天的形態(tài)；B圖是黑痘病菌分生孢子在培養(yǎng)基上生長6天，長出單菌落的形態(tài)；C圖是分離純化后的葡萄黑痘病菌ITS擴增產(chǎn)物，大小為580bp；D圖是葡萄黑痘病菌ITS序列與痂囊腔菌屬內(nèi)真菌ITS序列的系統(tǒng)進化分析。

圖2是PDA培養(yǎng)皿和PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)葡萄痂囊腔菌在不同天數(shù)的菌落形態(tài)圖片。其中，A-C圖為PDA培養(yǎng)皿上培養(yǎng)0天，10天，15天的形態(tài)，標(biāo)尺為2cm；D圖為PDA培養(yǎng)皿上生長25天的菌落形態(tài)，標(biāo)尺為0.5cm；E-G圖為PDA培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)0，10，15天的菌落形態(tài)，標(biāo)尺為1cm；H圖為PDA培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25天的菌落形態(tài)，標(biāo)尺為0.5cm。

圖3是溫度、光照、誘導(dǎo)時間和培養(yǎng)時間對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響圖。其中，A圖是PDA培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌分別放置在19℃，21℃，23℃，和25℃下24小時的產(chǎn)孢情況；B圖是PDA培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌分別在光照和黑暗下，21℃下誘導(dǎo)24小時的產(chǎn)孢情況；C圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌黑暗放置在21℃下，不同的誘導(dǎo)時間對產(chǎn)孢的影響情況；D圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)20天，25天，30天和35天后的葡萄痂囊腔菌，黑暗放置在21℃下24小時的葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢情況。

圖4是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天和35天后的菌落形態(tài)和誘導(dǎo)產(chǎn)孢的情況圖。其中，A圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天葡萄痂囊腔菌的菌落形態(tài)，標(biāo)尺為0.5cm；B圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形態(tài)，標(biāo)尺為50μm；C圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小時的產(chǎn)孢情況，標(biāo)尺為10μm；D圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)35天葡萄痂囊腔菌的菌落形態(tài)，標(biāo)尺為0.5cm；E圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面形態(tài)，標(biāo)尺為50μm；F圖是PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)35天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下24小時的產(chǎn)孢情況，標(biāo)尺為10μm。

以下結(jié)合附圖和發(fā)明人給出的實施例，對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。

具體實施方式

由于葡萄黑痘病病原菌為葡萄痂囊腔菌，生長緩慢，極難產(chǎn)孢，申請人通過研究培養(yǎng)方式、培養(yǎng)天數(shù)、溫度和光照對產(chǎn)孢的影響，進而發(fā)現(xiàn)：

1)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)比培養(yǎng)皿培養(yǎng)更容易產(chǎn)孢；

2)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天后誘導(dǎo)效果最佳；

3)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天后，21℃下黑暗誘導(dǎo)24小時，產(chǎn)孢效果最好。

本發(fā)明給出的誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的方法，為痂囊腔菌屬真菌誘導(dǎo)產(chǎn)孢提供快速穩(wěn)定的參考，同時為開展葡萄黑痘病相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。

選擇的具體實驗包括：

(1)培養(yǎng)方式的確定：由于PDA培養(yǎng)皿培養(yǎng)葡萄痂囊腔菌具有菌落形態(tài)的多樣性，影響誘導(dǎo)產(chǎn)孢的穩(wěn)定性，而通過PDA培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的葡萄痂囊腔菌在形態(tài)上具有一致性，而且培養(yǎng)瓶的產(chǎn)孢量較培養(yǎng)皿大。

(2)培養(yǎng)時間的確定：葡萄痂囊腔菌生長比較緩慢，前期的菌落顏色為暗紅色，但在后期菌落顏色變?yōu)榛揖G色，通過在培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)不同天數(shù)后進行誘導(dǎo)產(chǎn)孢發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)25天的產(chǎn)孢量最大。

(3)溫度調(diào)節(jié)產(chǎn)孢：葡萄痂囊腔菌的培養(yǎng)條件為25℃，而在此溫度下的不同培養(yǎng)階段都沒有獲得孢子。通過設(shè)置溫度梯度觀察對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在21℃下的葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢效果最好；進一步發(fā)現(xiàn)，在21℃下誘導(dǎo)24小時，葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢量最大。

(4)光照對產(chǎn)孢的影響：光照條件下，21℃誘導(dǎo)24小時后發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)孢量比黑暗條件少，說明光照下不利于誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢，因此黑暗下誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的效果更好。

以下的實施例中，所使用培養(yǎng)瓶為玻璃材質(zhì)，塑料瓶蓋上有0.22微米的微孔，能過濾微生物的透氣膜，其規(guī)格為250毫升，口徑、胸徑和瓶高的尺寸分別為5.6厘米、6.9厘米和9.1厘米。

實施例1：葡萄黑痘病菌的分離和鑒定

采集‘紅地球’葡萄發(fā)生黑痘病(帶有葡萄黑痘病病原真菌)的葉片帶回實驗室，用手術(shù)刀將病健交界處切下，用剪刀剪成3mm×3mm的小塊，將剪好的小塊放入濃度為2.5％的NaClO溶液中表面消毒2min，再用無菌水漂洗3次。自然晾干后，放置于含50ng/mL鏈霉素的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的配方為：1000毫升純水、200克馬鈴薯、20克葡萄糖、15克瓊脂。25℃下黑暗培養(yǎng)。生長5天后將長出葡萄痂囊腔菌的菌落轉(zhuǎn)移至新的PDA培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)(圖1A)。將分生孢子均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，生長6天可長出單菌落，挑取單葡萄痂囊腔菌的菌落接種于新的PDA培養(yǎng)基上(圖1B)。利用CTAB法提取葡萄黑痘病菌DNA，通過ITS擴增(正向引物：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’，反向引物：5’-TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’)，產(chǎn)物片段大小為580bp(圖1C)，測序該產(chǎn)物片段的DNA序列是：

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCCTTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGCCTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACAACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCCCCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTCGGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA(如SEQ ID NO.1所示)。

所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，結(jié)果與葡萄黑痘病菌的序列一致性最高，屬于痂囊腔菌屬中的葡萄痂囊腔菌(圖1D)，因此命名為葡萄痂囊腔菌。

實施例2：培養(yǎng)方式對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響

首先挑取在PDA培養(yǎng)皿上生長15天的葡萄痂囊腔菌菌落邊緣，接種于含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿和含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中(圖2A和2E)，25℃下黑暗培養(yǎng)，菌落形態(tài)如圖2所示，培養(yǎng)25天后，然后將培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶放置在21℃下誘導(dǎo)24小時，用無菌手術(shù)刀刮取菌落表面組織，擠壓成粉末狀，然后放入無菌水中，震蕩30秒，取上清液用血球計數(shù)板進行葡萄痂囊腔菌孢子計數(shù)，得到葡萄痂囊腔菌孢子。

采用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的葡萄痂囊腔菌的菌落，其產(chǎn)孢量可達5.3×10⁶個/mL，而培養(yǎng)皿每個葡萄痂囊腔菌的菌落在相同條件下的產(chǎn)孢量僅為1.3×10⁶個/mL(圖3B)。說明用培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)方式葡萄痂囊腔菌在產(chǎn)孢量上優(yōu)于培養(yǎng)皿。

實施例3：培養(yǎng)時間對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響

由于葡萄痂囊腔菌生長比較緩慢，前期的葡萄痂囊腔菌的菌落顏色為暗紅色，但在后期菌落顏色變?yōu)榛揖G色，為了探討培養(yǎng)時間對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響，對培養(yǎng)瓶培養(yǎng)20天，25天，30天和35天的葡萄痂囊腔菌進行誘導(dǎo)產(chǎn)孢，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶上培養(yǎng)25天，葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢量最大，而35天的葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢量僅為0.25×10⁶個/mL(圖3D)，說明培養(yǎng)時間長并不利于葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)35天葡萄痂囊腔菌的菌落表面有大量氣生菌絲(圖4E)，而且菌絲中產(chǎn)生大量的油胞(圖4F)，誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢量低；而培養(yǎng)25天葡萄痂囊腔菌的菌落表面氣生菌絲少(圖4B)，未觀察到油胞，能夠誘導(dǎo)出較多的分生孢子(圖4C)。說明培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天是葡萄痂囊腔菌最佳的誘導(dǎo)產(chǎn)孢時期。

實施例4：溫度對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響

為了明確溫度對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響，將培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌，分別放置在19℃，21℃，23℃和25℃下誘導(dǎo)24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在21℃下誘導(dǎo)，葡萄痂囊腔菌的孢子量最大，達到5.0×10⁶個/mL(圖3A)。為進一步確定21℃下需要誘導(dǎo)多長時間，效果最佳，將培養(yǎng)瓶培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌放置在21℃下誘導(dǎo)，分別在6小時，12小時，18小時，24小時，30小時后觀察產(chǎn)孢量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)21℃下24小時，葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢量達到穩(wěn)定(圖3C)。

實施例5：光照對葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響

大量的文獻報道葡萄痂囊腔菌需要在黑暗條件下進行培養(yǎng)，為了明確光照葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢的影響，將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿培養(yǎng)25天的葡萄痂囊腔菌在光照條件下，21℃誘導(dǎo)24小時，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑暗條件下葡萄痂囊腔菌的產(chǎn)孢效果好于光照條件下(圖3B)，說明光照下不利于誘導(dǎo)葡萄痂囊腔菌產(chǎn)孢。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北農(nóng)林科技大學(xué)大學(xué)

<120>一種誘導(dǎo)葡萄黑痘病病原菌穩(wěn)定產(chǎn)孢的方法

<160>

<210> 1

<211> 580

<212> SEQ ID NO. 1

<213> DNA

<220>

<400> 1

TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGAGGTAGGGTTCTCCTCCGGGAAGCCCGAACTCCCCACCCC

TTGCTGTTGCGAATACGTTGCTTCGGCGGGACCCCCCCTTCTGCCCTTCACCGGGGAGGGGGAGGGACCGGGC

CTTCACGGGCCCGGGCAGCGCCCGCCGGGGGACCGAACCAACTCTTTTTGTTAAACAATGCAGTCGGAGTACA

ACGTACATAATCAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAAT

GCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATT

CCGAGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCACCAATCAAGCCCCGCTTGGTATTAGGCGATCCGGCCGGCCC

CCCCGTGGCCGGCCCGCCCGAAATGCATCGGCGAGGCACCGACCCCCGGCGTGTTAGAATTTCTTTTAACGTC

GGGAGCACCGGTGTACCTCCGCCGTGAAACCTTTCTATTTTTCTAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA

<210> 2

<211>25

<212>正向引物

<213> DNA

<220>

<400> 2

5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGGA-3’

<210> 3

<211>25

<212>反向引物

<213> DNA

<220>

<400> 3

5’- TCCTACCTGATCCGAGGTCA-3’