本發(fā)明涉及微生物工程領(lǐng)域，特別是一種地衣芽胞桿菌高產(chǎn)桿菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：桿菌肽是由10種氨基酸、12個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽類抗生素，淡黃色或類白色粉末，無嗅，味苦。桿菌肽含有A、B1、B2、B3、D1、D2、D3和E等多種組分，其中，組分A的活性最高，含量也最為豐富。桿菌肽可有效抑制革蘭氏陽性病原菌和部分革蘭氏陰性菌。與此同時，桿菌肽具有在腸道內(nèi)幾乎不吸收，排泄迅速，體內(nèi)不殘留等優(yōu)點，因此被廣泛添加于飼料中。目前，桿菌肽通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)，其主要生產(chǎn)菌株為地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)和枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。培養(yǎng)基的成分在微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中具有重要影響，尤其是對于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。氮源是構(gòu)成菌體物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)元素，氮源過多，會使菌體生長過于旺盛，易導(dǎo)致pH值偏高，溶氧不足，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則影響菌體生長繁殖，易引起菌體衰老、自溶等，從而影響發(fā)酵產(chǎn)量。地衣芽胞桿菌發(fā)酵主要是以餅粕為氮源，餅粕中含有氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，被作為工業(yè)發(fā)酵過程中常用的有機氮源。桿菌肽的原始培養(yǎng)基是以10%的豆粕為有機氮源，然而在培養(yǎng)基成分中，氮源除影響菌體生長和產(chǎn)物合成外，還決定了工業(yè)生產(chǎn)中的發(fā)酵成本。有機氮源能夠為菌體生長提供氮元素及必需的生長因子，選擇合適的有機氮源對提高桿菌肽產(chǎn)量以及降低原料成本具有重大意義。此外，菌種選育也是一種提高桿菌肽產(chǎn)量的有效策略。除了傳統(tǒng)的誘變育種外，基因工程手段也被越來越多的應(yīng)用于菌種選育。有專利報道利用基因工程手段構(gòu)建了一株攜帶絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的地衣芽孢桿菌工程菌株，提高了細胞內(nèi)半胱氨酸的含量，進而提高了桿菌肽產(chǎn)量，這說明細胞中半胱氨酸比例的提高可以提高桿菌肽的產(chǎn)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種地衣芽胞桿菌高產(chǎn)桿菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其應(yīng)用，采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發(fā)酵原料，優(yōu)化了地衣芽胞桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養(yǎng)基提高了12.4%，同時降低了發(fā)酵成本，提高了地衣芽胞桿菌發(fā)酵桿菌肽的效益。為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種地衣芽胞桿菌高產(chǎn)桿菌肽的培養(yǎng)基配方，培養(yǎng)基包括了種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基為100g/L豆粕；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5g/LCaCO3；0.1～1.0g/L(NH4)2SO4，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基為100g/L豆粕、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/LCaCO3和0.5～2g/L(NH4)2SO4。優(yōu)選的，種子培養(yǎng)基中100g/L豆粕替換為70g/L豆粕和20g/L菜籽餅，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中100g/L豆粕替換為70g/L豆粕和20g/L菜籽餅。本發(fā)明還公開了一種地衣芽胞桿菌高產(chǎn)桿菌肽的培養(yǎng)基配方的應(yīng)用，采用上述的培養(yǎng)基配方，應(yīng)用步驟如下：種子培養(yǎng)：先將地衣芽胞桿菌活化，即從甘油管以體積百分比1%接種于裝有5mLLB培養(yǎng)基的PA瓶中，180～300rpm，溫度37℃，培養(yǎng)10～14小時，然后將菌種活化后的菌液以體積百分比按1%接種量接種與種子培養(yǎng)基后于180～300r/min，37℃中培養(yǎng)10～12小時；桿菌肽發(fā)酵：500mL三角瓶裝生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的液量為25～150mL，然后將種子培養(yǎng)的菌液以體積百分比2%接種量，180～300r/min，溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，通過采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發(fā)酵原料，顯著提高了桿菌肽發(fā)酵產(chǎn)量，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養(yǎng)基提高了12.4%，同時對豆粕和菜籽粕的市場價格進行調(diào)研，豆粕的價格在3200元/噸左右小范圍波動，菜籽粕的平均價格在2800元/噸左右小范圍波動，發(fā)酵原料的替換顯著的降低了發(fā)酵成本，提高了地衣芽胞桿菌發(fā)酵桿菌肽的效益。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例3單一氮源分析結(jié)果示意圖。圖2為本發(fā)明實施例4一種原料復(fù)配結(jié)果示意圖。圖3為本發(fā)明實施例4多種原料復(fù)配結(jié)果示意圖。圖4為本發(fā)明實施例5中50L發(fā)酵罐驗證復(fù)合氮源結(jié)果示意圖。具體實施方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。實施例1本發(fā)明公開了一種地衣芽胞桿菌高產(chǎn)桿菌肽的培養(yǎng)基配方及應(yīng)用，培養(yǎng)基包括了種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基為100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽餅；2.5～7.5g/L玉米淀粉；0.5～2.5g/LCaCO3；0.1～1.0g/L(NH4)2SO4。生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基為100g/L豆粕或70g/L豆粕和20g/L菜籽餅、15～25g/L玉米淀粉、4～8g/LCaCO3和0.5～2g/L(NH4)2SO4。地衣芽胞桿菌培養(yǎng)桿菌肽步驟如下：種子培養(yǎng)：先將地衣芽胞桿菌活化，即從甘油管以體積百分比1%接種于裝有5mLLB培養(yǎng)基的PA瓶中，180～300rpm，溫度37℃，培養(yǎng)10～14小時，然后將菌種活化后的菌液以體積百分比按1%接種量接種與種子培養(yǎng)基后于180～300r/min，37℃中培養(yǎng)10～12小時；桿菌肽發(fā)酵：500mL三角瓶裝生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的液量為25～150mL，然后將種子培養(yǎng)的菌液以體積百分比2%接種量，180～300r/min，溫度37℃，發(fā)酵培養(yǎng)48小時。實施例2實驗?zāi)康募胺椒ǎ簽榱蓑炞C本發(fā)明中不同種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基搭配使用對桿菌肽發(fā)酵產(chǎn)量的影響，本實施例以實施例1中所述的培養(yǎng)基配方及實施方法進行實驗驗證，具體實驗組別如下：表1不同種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基搭配使用對桿菌肽效價影響結(jié)果實驗結(jié)果：通過上述不同種子培養(yǎng)基和生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基搭配使用培養(yǎng)可以發(fā)現(xiàn)，在相同的培養(yǎng)情況下，采用菜籽餅代替部分豆粕進行培養(yǎng)基改機可以有效提高桿菌肽效價。實施例3實驗?zāi)康募胺椒ǎ簽榱搜芯繂我坏磳Φ匾卵堪麠U菌發(fā)酵培養(yǎng)的影響，本實施例在發(fā)酵培養(yǎng)基中除氮源外其他成分不變的基礎(chǔ)上，分別添加100g/L的豆粕、花生餅粉、黃豆餅粉、低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅、棉籽餅、芝麻餅、魚粉作為單一氮源，比較它們對桿菌肽發(fā)酵的影響。其中低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，豆粕、花生餅粉、黃豆餅粉、棉籽餅、芝麻餅和魚粉購自湖北省國營三湖農(nóng)場飼料廠?？紤]到氮源種類不同，發(fā)酵周期可能會有差異，因此在發(fā)酵39、42、46、48、50小時，分別用高效液相色譜測定桿菌肽產(chǎn)量。實驗結(jié)果：如圖1所示，實驗結(jié)果表明桿菌肽發(fā)酵的最佳唯一氮源為豆粕，且發(fā)酵48小時，桿菌肽產(chǎn)量達到最高值。實施例4實驗?zāi)康募胺椒ǎ簽榱搜芯繌?fù)合氮源對地衣芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的影響，本實施例以豆粕與一種原料復(fù)配、豆粕與多種原料復(fù)配進行研究，其中豆粕與一種原料復(fù)配的實驗方法如下：10%和9%豆粕分別添加1%其它原料（包括花生餅粉、黃豆餅粉、低蛋白菜籽餅、高蛋白菜籽餅、棉籽餅、芝麻餅、魚粉）作為復(fù)合氮源，10%豆粕單一氮源的設(shè)為對照，比較它們對桿菌肽發(fā)酵的影響。用高效液相色譜測定桿菌肽產(chǎn)量。豆粕與多種原料復(fù)配的實驗方法如下：采用9%豆粕和8%豆粕分別添加1%低蛋白菜籽餅（或高蛋白菜籽餅）和1%魚粉（或芝麻餅），未添加的設(shè)為對照，比較他們對桿菌肽發(fā)酵的影響。用高效液相色譜測定桿菌肽產(chǎn)量。實驗結(jié)果：如圖2所示，發(fā)酵結(jié)果表明：與10%豆粕相比，豆粕與菜籽餅復(fù)配效果最好。9%豆粕分別與1%低蛋白菜籽餅、1%高蛋白菜籽餅、1%魚粉和1%芝麻餅復(fù)配后，效價增加了8.4%、5.2%、1.6%和0.6%。其中菜籽餅1指低蛋白菜籽餅，菜籽餅2指高蛋白菜籽餅。如圖3所示，發(fā)酵結(jié)果表明：與9%的豆粕相比，8%豆粕中同時添加1%低蛋白菜籽餅和1%魚粉效果最好，效價提升22.4%，其次是8%豆粕中同時添加1%高蛋白菜籽粕和1%芝麻餅，效價提升14.2%。前面實驗表明豆粕、低蛋白菜籽餅和魚粉復(fù)配后可以提高桿菌肽產(chǎn)量，為了進一步優(yōu)化三者的比例，設(shè)計了豆粕、低蛋白菜籽餅和魚粉的三因素三水平（參見表2）的正交試驗（參見表3），進一步優(yōu)化氮源配比，并對正交試驗進行方差分析（參見表4），發(fā)現(xiàn)豆粕對桿菌肽效價影響極顯著，低蛋白菜籽餅對桿菌肽效價影響顯著，魚粉對桿菌肽效價影響不顯著。并通過考察豆粕與低蛋白菜籽餅的比例分別為8:1、7:2和6:3時桿菌肽的產(chǎn)量，從而確定桿菌肽發(fā)酵的最佳復(fù)合氮源為：豆粕7%+低蛋白菜籽餅2%。表2主要因素的正交實驗設(shè)計表3正交試驗結(jié)果表4正交試驗的方差分析因素偏差平方和自由度F比顯著性豆粕12233.92139.6**低蛋白菜籽餅4061.9246.4*魚粉150.121.7空列87.621.0誤差87.62注：F0.05(2,2)＝19.0，F(xiàn)0.01(2,2)＝99.0實施例5實驗?zāi)康募胺椒ǎ罕緦嵤├?0L發(fā)酵罐驗證復(fù)合氮源的效果，實施方法為以復(fù)合氮源豆粕7%+低蛋白菜籽餅2%為優(yōu)化組，以原始氮源豆粕10%為對照組，在50L發(fā)酵罐中對優(yōu)化組的效果進行驗證，對照組和優(yōu)化組除氮源外，其他條件完全相同。實驗結(jié)果：如圖4所示，對照組與優(yōu)化組效價分別為755.3U/mL和849.3U/mL，與對照組相比，發(fā)酵結(jié)束時桿菌產(chǎn)量增加了12.4%。實施例6實驗?zāi)康募胺椒ǎ罕緦嵤├M行菜籽粕的氨基酸組成分析，實施方法如下：分別稱取豆粕和低蛋白菜籽餅各0.1g于10mL水解管中，每種原料設(shè)三個平行，加6mol/L鹽酸5mL，密封好后放入100℃水浴鍋中水解24h,水解結(jié)束后定容并調(diào)節(jié)水解液的PH至中性。衍生化后進行GC-FID檢測。實驗結(jié)果：表5豆粕和菜籽餅中氨基酸的組成分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜籽粕中半胱氨酸的比例遠高于豆粕。同時我們對豆粕和菜籽粕的市場價格進行調(diào)研，豆粕的價格在3200元/噸左右小范圍波動，菜籽粕的平均價格在2800元/噸左右小范圍波動。以上實施例表明本發(fā)明通過發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，通過采用富含半胱氨酸，價格低廉的菜籽粕來替代部分豆粕作為發(fā)酵原料，顯著提高了桿菌肽發(fā)酵產(chǎn)量，桿菌肽效價達到849.3U/mL，比原始培養(yǎng)基提高了12.4%，同時降低了發(fā)酵成本，顯著提高了地衣芽胞桿菌發(fā)酵桿菌肽的效益。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3