本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，屬于從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素的方法。

背景技術(shù)：

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate)是一種酸性粘多糖，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的軟骨、喉骨、鼻骨和氣管中。硫酸軟骨素是由葡萄糖醛酸和氨基己糖交替連結(jié)而成的雙糖聚合物，它含有50～70 個(gè)雙糖基本結(jié)構(gòu),分子量為10000～50000。按其化學(xué)組成和結(jié)構(gòu),可分為CSA、C、D、E、F、H 等多種同分異構(gòu)體,藥用硫酸軟骨素是從動(dòng)物軟骨中提取的,主要是A、C 及各種硫酸軟骨素的混合物。CSA 和CSC 均由D2氨基葡萄糖醛和N2乙酰2D2氨基半乳糖組成,只是硫酸基團(tuán)位置不同。

硫酸軟骨素通常與蛋白質(zhì)結(jié)合成糖蛋白的形式存在，當(dāng)其水解時(shí)發(fā)生消去反應(yīng)，連接硫酸軟骨素與蛋白質(zhì)中絲氨酸羥基的苷鍵斷裂，可以得到游離態(tài)的硫酸軟骨素。硫酸軟骨素為白色或微黃色粉末,具有吸濕性，易溶于水而成粘度較大的溶液，難溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙醇、丙酮和冰醋酸等有機(jī)溶劑，并且遇熱不穩(wěn)定，乙?；装l(fā)生水解脫落，在酸性條件下更易水解成不同聚合度的低聚糖。硫酸軟骨素具有降血脂、抗凝血、抗炎癥及抗腫瘤等生理活性，臨床上可用于預(yù)防動(dòng)脈粥狀硬化、提高機(jī)體免疫力、治療風(fēng)濕病和腎炎及由鏈霉素引起的聽覺障礙。硫酸軟骨素與銅等金屬離子結(jié)合可用于治療皮膚病，與硝酸鉍或氫氧化鋁反應(yīng)得到的絡(luò)合物可用于治療消化性潰瘍，與苯甲酸酯、利多卡因或布比卡因作用生成的衍生物可用作麻醉劑。作為食品添加劑，硫酸軟骨素可用于食品的乳化、保濕和祛除異味。在化妝品中添加硫酸軟骨素，可調(diào)節(jié)皮膚的細(xì)胞代謝，促進(jìn)營養(yǎng)的吸收，保持皮膚的水分和改善發(fā)質(zhì)。

隨著硫酸軟骨素生物活性不斷被揭示和其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷擴(kuò)展,有關(guān)硫酸軟骨素的提取、純化和分離技術(shù)已取得了一定的研究成果,但應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)際還有許多需要改進(jìn)和完善之處。目前，硫酸軟骨素生產(chǎn)廠家主要采用的方法成本高，產(chǎn)率和純度低。所以，本公司開發(fā)了稀堿——酶解——樹脂吸附提取法從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素，以降低成本，提高效益。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種全新的方法（稀堿—酶解—樹脂吸附提取法）從豬鼻骨中提取硫酸軟骨素，能夠有效地降低成本，并提高產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度。

為此，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

1、堿解

將豬鼻骨粉碎，放入1mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡，42～53℃下保溫堿解3小時(shí)。

2、酶解

加4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到6.5～7.5，按豬鼻骨與胰蛋白酶1000∶(1~8)的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于40～50℃酶解12小時(shí)后，再按豬鼻骨與胃蛋白酶1000∶(1~8)的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，40～50℃酶解12小時(shí)。

3、樹脂吸附

將溶液通過離子交換樹脂柱吸附完畢，用0.5 mol/L的NaCl 液洗滌，再用1.8mol/L 的氯化鈉液洗脫，流速2L/h。

4、沉淀

調(diào)節(jié)洗脫液pH至6.8～7.2，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，靜置12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨素。

5、純化

將硫酸軟骨素溶于濃度為2%~5%(m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。

6、脫水

最后，用95%以上的丙酮對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。

本發(fā)明的有益效果是：用堿解、酶解、樹脂吸附三者相結(jié)合的方法分離豬鼻骨中的硫酸軟骨素，并且增加了純化過程，有效地降低了生產(chǎn)成本，并且提高了產(chǎn)品的產(chǎn)率和純度。

四、具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例一：

1、堿解

稱取100千克豬鼻骨粉碎，放入1mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡，45℃下保溫堿解3小時(shí)。

2、酶解

加4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到6.6，按豬鼻骨與胰蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于49℃酶解12小時(shí)后，再按豬鼻骨與胃蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，42℃酶解12小時(shí)。

3、樹脂吸附

將溶液通過離子交換樹脂柱吸附完畢，用0.5 mol/L的NaCl 液洗滌，再用1.8mol/L 的氯化鈉液洗脫，流速2L/h。

4、沉淀

調(diào)節(jié)洗脫液pH至6.9，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬螅o置12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨素。

5、純化

將硫酸軟骨素溶于濃度為2%(m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。

6、脫水

最后，用95%以上的丙酮對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。

7、對(duì)比

稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用傳統(tǒng)工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量24726L,產(chǎn)出硫酸軟骨素20.27kg,純度78.26%，產(chǎn)率49.20%。稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用稀堿—酶解—樹脂吸附提取法工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量2993L,產(chǎn)出硫酸軟骨素28.36kg,純度97.24%，產(chǎn)率85.54%。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：傳統(tǒng)工藝明顯地成本高，效益低。

實(shí)施例二：

1、堿解

稱取100千克豬鼻骨粉碎，放入1mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡，51℃下保溫堿解3小時(shí)。

2、酶解

加4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到7.3，按豬鼻骨與胰蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于43℃酶解12小時(shí)后，再按豬鼻骨與胃蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，48℃酶解12小時(shí)。

3、樹脂吸附

將溶液通過離子交換樹脂柱吸附完畢，用0.5 mol/L的NaCl 液洗滌，再用1.8mol/L 的氯化鈉液洗脫，流速2L/h。

4、沉淀

調(diào)節(jié)洗脫液pH至7.1，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，靜置12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨素。

5、純化

將硫酸軟骨素溶于濃度為2%(m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。

6、脫水

最后，用95%以上的丙酮對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。

7、對(duì)比

稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用傳統(tǒng)工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量24726L,產(chǎn)出硫酸軟骨素20.27kg,純度78.26%，產(chǎn)率49.20%。稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用稀堿—酶解—樹脂吸附提取法工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量2983L,產(chǎn)出硫酸軟骨素28.91kg,純度97.13%，產(chǎn)率86.20%。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：傳統(tǒng)工藝明顯地成本高，效益低。

實(shí)施例三：

1、堿解

稱取100千克豬鼻骨粉碎，放入1mol/L的氫氧化鈉溶液中浸泡，49℃下保溫堿解3小時(shí)。

2、酶解

加4mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH到6.9，按豬鼻骨與胰蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胰蛋白酶，于44℃酶解12小時(shí)后，再按豬鼻骨與胃蛋白酶1000∶3的質(zhì)量比加入胃蛋白酶，47℃酶解12小時(shí)。

3、樹脂吸附

將溶液通過離子交換樹脂柱吸附完畢，用0.5 mol/L的NaCl 液洗滌，再用1.8mol/L 的氯化鈉液洗脫，流速2L/h。

4、沉淀

調(diào)節(jié)洗脫液pH至7.1，再加入2.5倍體積的95%以上乙醇，充分?jǐn)嚢韬?，靜置12小時(shí)以上，虹吸上層乙醇，即得硫酸軟骨素。

5、純化

將硫酸軟骨素溶于濃度為2%(m/v)的氯化鈉溶液中，加入少量乙醇，于低溫下靜置后離心，將其上清液中再加入少量乙醇，重復(fù)以上步驟，可依次得到較高純度的硫酸軟骨素。

6、脫水

最后，用95%以上的丙酮對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行脫水，再真空干燥，即可。

7、對(duì)比

稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用傳統(tǒng)工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量24726L,產(chǎn)出硫酸軟骨素20.27kg,純度78.26%，產(chǎn)率49.20%。稱取100千克同一批次的豬鼻骨，采用稀堿—酶解—樹脂吸附提取法工藝提取其中的硫酸軟骨素,乙醇用量2988L,產(chǎn)出硫酸軟骨素31.26kg,純度98.97%，產(chǎn)率95.96%。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)：傳統(tǒng)工藝明顯地成本高，效益低。