本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌易感基因變異文庫(kù)構(gòu)建方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：目前腫瘤的發(fā)病率和死亡率高于其他疾病，開(kāi)發(fā)以非侵入式診斷策略進(jìn)行腫瘤基因診斷研發(fā)，針對(duì)腫瘤靶標(biāo)與化療用藥后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與抗藥性，而傳統(tǒng)疾病診斷通過(guò)臨床經(jīng)驗(yàn)、病理監(jiān)測(cè)、細(xì)胞檢測(cè)作為依據(jù)，有靈敏度的限制，也無(wú)法做到早期發(fā)現(xiàn)早期治療或提早預(yù)測(cè)提早預(yù)防。新一代高通量基因檢測(cè)技術(shù)，當(dāng)今主要以Illumina公司的Hiseq，Miseq系列和Life公司的IonTorrentTM系列測(cè)序儀為代表，有著其他技術(shù)不可比擬的高通量、低成本等優(yōu)勢(shì)。已被廣泛用于各類(lèi)生物學(xué)研究核醫(yī)學(xué)檢測(cè)。對(duì)有參考的物種序列，進(jìn)行全基因組重測(cè)序，在全基因組水平上檢測(cè)突變位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)個(gè)體差異的分子基礎(chǔ)。新一代測(cè)序技術(shù)通過(guò)全基因組測(cè)序構(gòu)建了大量常規(guī)物種的基因組圖譜，也促進(jìn)了測(cè)序技術(shù)的告訴發(fā)展。同時(shí)，高通量測(cè)序技術(shù)在基因診斷和基因治療方面也有著重要的作用。SNPs(單核苷酸多態(tài)性)指在不同個(gè)體的同一條染色體或同一位點(diǎn)的核苷酸序列中，絕大多數(shù)核苷酸序列一直，而只有一個(gè)堿基不同的現(xiàn)象。SNP是人類(lèi)DNA中常見(jiàn)的變異形式，數(shù)以百萬(wàn)存在整個(gè)人類(lèi)的基因組中，部分SNP能夠?qū)е碌鞍踪|(zhì)氨基酸編碼改變或基因表達(dá)調(diào)控改變。結(jié)直腸癌(colorectalcancer,CRC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。在西方國(guó)家其發(fā)病率居惡性腫瘤的第2～3位,隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高和飲食習(xí)慣的改變,我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率也在逐年升高,已躍居第3～5位。結(jié)直腸癌的預(yù)后與早期診斷密切相關(guān),多數(shù)早期結(jié)直腸癌可以治愈,5年生存率可達(dá)90％,而晚期則不足10％,內(nèi)鏡是早期診斷的主要手段。大量研究證實(shí)遺傳因素在疾病的易感性中發(fā)揮重要作用，復(fù)雜疾病的遺傳因素己證實(shí)存在微效基因劑量效應(yīng)，即微效基因作用的累加才可以形成明顯的表型綜合效應(yīng)。因此，對(duì)疾病的多個(gè)易感基因及突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要，約占整個(gè)基因組中遺傳突變的92％。對(duì)結(jié)直腸癌的易感基因的研究并不需要對(duì)全基因組測(cè)序，而只需要對(duì)特定的幾個(gè)基因進(jìn)行研究，目標(biāo)序列捕獲測(cè)序的出現(xiàn)，使得對(duì)基因組塔頂區(qū)域的研究成為可能。這項(xiàng)技術(shù)首先合成大量能與基因組特定區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合的寡核苷酸序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增富集目標(biāo)區(qū)段，然后用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)這些區(qū)段進(jìn)行測(cè)序。高通量多基因檢測(cè)可以一次性檢測(cè)多個(gè)基因的多種變異類(lèi)型，同步解析靶向用藥、化療用藥和遺傳風(fēng)險(xiǎn)，綜合指導(dǎo)腸癌患者的個(gè)體化治療，最大化患者獲益可能。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種測(cè)序通量高，靈敏度強(qiáng)，特異性強(qiáng)，基于二代測(cè)序平臺(tái)技術(shù)，能夠用于檢測(cè)游離DNA低頻突變的結(jié)直腸癌易感基因變異文庫(kù)構(gòu)建方法。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是：一種結(jié)直腸癌易感基因變異文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟：A.根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)這些變異區(qū)域的引物對(duì)；B.通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件得到各引物對(duì)的參數(shù)W1、Tm1、W2和Tm2，從而計(jì)算得到各引物對(duì)的判斷參數(shù)R，計(jì)算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]；其中，W1是擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量，Tm1是擴(kuò)增產(chǎn)物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值，將判斷參數(shù)R的值小于或等于1的引物對(duì)，歸為第一組引物組合液，將判斷參數(shù)R的值大于1的引物對(duì)，歸為第二組引物組合液；C.將待測(cè)樣品DNA抽提純化；D.分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對(duì)純化后的樣品進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)片段，然后清除引物，采用第一組引物組合液進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度低于采用第二組引物組合液進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增時(shí)的退火溫度；E.對(duì)所述目標(biāo)片段進(jìn)行接頭連接得到帶接頭片段，然后進(jìn)行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對(duì)純化后的帶接頭片段進(jìn)行文庫(kù)PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行純化，得到測(cè)序文庫(kù)。上述結(jié)直腸癌相關(guān)基因包括APC、BMPR1A、CDH1、CHEK2、EPCAM、MLH1、MSH2、MSH2、MUTYH、PMS2、C-met、PTEN、SMAD4、STK11、TP53、AXIN2、MLH3、BUB1、CYP1A2、MMP2中的一種或多種。上述引物對(duì)所覆蓋的變異區(qū)域包括chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr5：112767236-112767252、chr5：112792503-112792252、chr5：112827956-112827986、chr5：112838873-112838928、chr5：112840654-112840677、chr17:65536321-65536383、chr17:65537388-65537406、chr17:65557986-65558000、chr17:65549523-65549581、chr10:86890071-86890091、chr10:86921583-86921623、chr2:110638014-110639101、chr2:110641182-110641198、chr2:110653457-110653493、chr2:110661715-110661778、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、hr7:116775003-116775102、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr14:75018901-75018935、chr14:75032111-75032150、chr14:75042427-75042446、chr14:75047713-75047731、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr18:51054783-51054797、chr18:51058154-51058204、chr18:51067085-51067078、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、ch10:97938720-ch10:94938771、ch10:94942196-ch10:94942266、ch10:94949247-ch10:94949282、ch16:55484117-55484159、ch16:55485699-55485770、ch16:55488596-55488662、ch16:55489754-55489820中的一個(gè)或多個(gè)。上述步驟F中的混合液是第一組引物組合液和第二組引物組合液按照體積比為1﹕1混合而成。上述引物對(duì)的5’端均引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。上述步驟D中初始PCR擴(kuò)增時(shí)，在反應(yīng)體系中加入二甲基亞砜，加入二甲基亞砜的體積占反應(yīng)體系體積的3％～7％。上述步驟F中文庫(kù)PCR擴(kuò)增時(shí)，在反應(yīng)體系中加入甘油，加入甘油的體積占反應(yīng)體系體積的5％～8％。上述步驟E中帶接頭片段的純化是采用磁珠進(jìn)行純化，所述步驟F中文庫(kù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化是采用磁珠進(jìn)行純化。上述步驟D中第一組引物混合液在初始PCR擴(kuò)增時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件是：99℃，2min，1個(gè)循環(huán)；99℃，15s，55℃，20s，72℃，30s15個(gè)循環(huán)；上述步驟D中第二組引物組合液在初始PCR擴(kuò)增時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件是：99℃，2min，1個(gè)循環(huán)；99℃，15s，65℃，20s，72℃，30s，15個(gè)循環(huán)；上述步驟F中第一組引物組合液和第一組引物組合液的混合液在文庫(kù)擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)條件是：98℃，2min，1個(gè)循環(huán)；99℃，15s，62℃，1min，5個(gè)循環(huán)。本發(fā)明具有積極的效果：(1)本發(fā)明提供一種基于二代測(cè)序平臺(tái)技術(shù)的結(jié)直腸癌易感基因文庫(kù)構(gòu)建方法，能夠?qū)崿F(xiàn)樣本濃度低起始量(低于10ng)、高通量、短周期、低成本的建庫(kù)。采用本發(fā)明的文庫(kù)構(gòu)建方法所得到的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，可以一次檢測(cè)20個(gè)基因的上百個(gè)突變和多態(tài)位點(diǎn)，相對(duì)于一代測(cè)序突變的成本節(jié)約4000元/樣本。本發(fā)明主要是對(duì)腫瘤易感人群，尤其是攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)的人群，結(jié)合測(cè)序技術(shù)，通過(guò)基因檢測(cè)可以確定自身腫瘤易感基因的突變狀態(tài)和多態(tài)性情況，對(duì)腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)并進(jìn)行干預(yù)，真正意義上做到“早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療”。對(duì)結(jié)直腸癌高危人群的診斷和預(yù)防策略提供指南，如進(jìn)行定期體檢或有效普查以獲得早診早治，大大降低結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率。(2)本發(fā)明中所用的引物組合物是針對(duì)結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)位點(diǎn)的特定序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，通過(guò)5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，使得各引物之間相互干擾性小。通過(guò)分管擴(kuò)增捕獲所選取變異區(qū)域，相互之間幾乎不干擾。根據(jù)判斷參數(shù)R將引物組合物分管進(jìn)行擴(kuò)增，在其他條件相同的條件下，文庫(kù)構(gòu)建的成功率由原來(lái)的71％提高到92％。本發(fā)明可以用于微量DNA文庫(kù)構(gòu)建，降低對(duì)檢測(cè)樣本的要求，樣本的DNA濃度可以低至1ng～10ng，與其他建庫(kù)相比，文庫(kù)起始量降低了40ng。(3)本發(fā)明計(jì)算的基因突變和多態(tài)與金標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比，二代測(cè)序的敏感度和特異度分別是99.1％和98.9％；(4)本發(fā)明對(duì)樣本的DNA濃度要求很低，所以可以適用于非侵入式采集外圍血、口腔粘膜、唾液等，具有方便采樣、可早期檢測(cè)與復(fù)發(fā)評(píng)估、易定期追蹤、高靈敏度、高精準(zhǔn)分辨率及專一性的優(yōu)勢(shì)。(5)本發(fā)明對(duì)初始擴(kuò)增和文庫(kù)擴(kuò)增過(guò)程中使用的試劑進(jìn)行優(yōu)化，建立最適合建庫(kù)的反應(yīng)條件，與現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)步驟相比，本發(fā)明在文庫(kù)初始擴(kuò)增和文庫(kù)擴(kuò)增，引入一定少量的有機(jī)試劑，初始擴(kuò)增時(shí)采用二甲基亞砜、文庫(kù)擴(kuò)增時(shí)采用甘油，通過(guò)在反應(yīng)步驟中加入有機(jī)試劑，文庫(kù)構(gòu)建的成功率由原來(lái)的92％提高到96％。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以根據(jù)上述本
發(fā)明內(nèi)容對(duì)本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。下述實(shí)施例中，若非特意表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學(xué)出版社2002年出版的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》一書(shū)中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。主要試劑：所有試劑購(gòu)買(mǎi)自正規(guī)廠家：MultisourceGenomicDNAMiniprepKit(Axygen)、結(jié)直腸癌易感基因檢測(cè)引物第一組引物組合液和第二組引物組合液(上海百力格生物技術(shù)有限公司)、5*IonAmpliSeqTMHiFiMix(Lifetechnologies)、FuPaReagentTM(Lifetechnologies)、AmPureXPReagent磁珠(Lifetechnologies)、IonPGMBeads(Lifetechnologies)、PGMTemplateOT2Solutions(Lifetechnologies)、PlatinumPCRSuperMixHighFidelity(Lifetechnologies)、LibraryAmplificationPrimerMix(Lifetechnologies)等。上機(jī)模板準(zhǔn)備和上機(jī)過(guò)程中用到的試劑和耗材與IonTorrent二代測(cè)序平臺(tái)相配套，包括PGMTemplateOT2kit和Ion314chip等部分。本方法實(shí)驗(yàn)前需要新鮮配制的試劑：75％乙醇(100％乙醇與無(wú)核酸酶水按3:1比例配制)。主要儀器：IonTorrentPGM測(cè)序儀、3.0熒光定量?jī)x、高速離心機(jī)、水浴鍋、漩渦震蕩儀、冰箱、滅菌鍋、磁力架、移液槍、PCR儀、震蕩儀等。本實(shí)施例的結(jié)直腸癌易感基因變異文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟：A.根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)這些變異區(qū)域的引物對(duì)；B.根據(jù)引物和產(chǎn)物的GC含量、Tm值，將引物對(duì)分成兩組，即第一組引物組合液和第二組引物組合液；C.將待測(cè)樣品DNA抽提純化；D.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對(duì)純化后的樣品分別進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增，得到目標(biāo)片段，然后清除引物；E.對(duì)所述目標(biāo)片段進(jìn)行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進(jìn)行純化；F.采用第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液對(duì)純化后的帶接頭片段進(jìn)行文庫(kù)PCR擴(kuò)增，然后采用磁珠進(jìn)行純化，得到測(cè)序文庫(kù)。整個(gè)過(guò)程中，也可以在任何步驟按照要求通過(guò)切膠回收或磁珠片段選擇的方法對(duì)DNA片段分子大小進(jìn)行選擇，最終獲得所需大小DNA片段的文庫(kù)分子，并且在接頭連接中引入特征性序列標(biāo)簽，用于測(cè)序中不同文庫(kù)的區(qū)分。與陰性樣品，質(zhì)控品一起進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序，儀器獲得的結(jié)果經(jīng)數(shù)據(jù)處理和生物信息學(xué)分析，得出樣本中含有的SNP位點(diǎn)信息。所述陰性樣本為正常人基因組DNA，所述的質(zhì)控品為加入1％的controlparticles,是一種商品化試劑，包含在上機(jī)測(cè)序的試劑盒PGMSequencingOT2kit中，作為上機(jī)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的內(nèi)參，對(duì)測(cè)序情況進(jìn)行評(píng)估和質(zhì)控，如果測(cè)序結(jié)果中不包含1％的controlparticles結(jié)果，說(shuō)明上機(jī)實(shí)驗(yàn)失敗，結(jié)果不可靠。一、引物設(shè)計(jì)。根據(jù)結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計(jì)能夠檢測(cè)這些變異區(qū)域的引物對(duì)。本發(fā)明中，結(jié)直腸癌相關(guān)基因包括但不限于下列基因：表1結(jié)直腸癌易感基因信息表序號(hào)基因名稱DNALocusmRNALocus1APCNG_008481.4NM_0000382BMPR1ANG_009362.1NM_0043293CDH1NG_008021.1NM_0013171844CHEK2NG_008150.1NM_0010057355EPCAMNG_012352.2NM_0023546MLH1NG_007109.2NM_0002497MSH2NG_007110.2NM_0002518MSH6NG_007111.1NM_0001799MUTYHNG_008189.1NM_00104817110PMS2NG_008466.1NM_00053511C-metNG_008996.1NM_00024512PTENNG_007466.2NM_00031413SMAD4NG_013013.2NM_00535914STK11NG_007460.2NM_00045515TP53NG_017013.2NM_00054616AXIN2NG_012142.1NM_00465517MLH3NG_008649.1NM_00104010818BUB1NG_012048.1NM_00127861619CYP1A2NG_008385.1NM_00077120MMP2NG_008989.1NM_001127891本實(shí)施例根據(jù)上述各結(jié)直腸癌相關(guān)基因的變異區(qū)域，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)這些結(jié)直腸癌易感基因的變異區(qū)域是否存在變異的引物對(duì)。變異區(qū)域包括各基因的外顯子區(qū)域，或者與外顯子相連的上下游30bp的內(nèi)含子區(qū)域，或者與結(jié)直腸癌相關(guān)的其他突變和多態(tài)區(qū)域。引物對(duì)能夠覆蓋表1中所有基因的需要檢測(cè)的變異區(qū)域。所覆蓋的區(qū)域如下：chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr5：112767236-112767252、chr5：112792503-112792252、chr5：112827956-112827986、chr5：112838873-112838928、chr5：112840654-112840677、chr17:65536321-65536383、chr17:65537388-65537406、chr17:65557986-65558000、chr17:65549523-65549581、chr10:86890071-86890091、chr10:86921583-86921623、chr2:110638014-110639101、chr2:110641182-110641198、chr2:110653457-110653493、chr2:110661715-110661778、chr16：68808708-68808772、chr16：6881687-68818751、chr16：68808708-68808772、chr16：68819374-68819424、chr16：68808708-68808772、chr22：28694055-28694109、chr22：28696891-28696981、chr22：28695721-28695804、ch2:47373517-47373532、ch2:47373921-47373956、ch2:47378954-47378980、chr7:116731688-116731707、chr7:116740046-116740083、chr7:116771552-116771574、chr7:116782003-116782070、chr7:116795915-116795945、hr7:116775003-116775102、chr3:37020368-37020459、chr3:37028815-37028859、chr3:37048982-37049005、chr14:75018901-75018935、chr14:75032111-75032150、chr14:75042427-75042446、chr14:75047713-75047731、chr2:47403286-47403289、chr2:47412447-47412470、chr2:47445572-47445651、chr2:47482870-47482922、chr2:47795926-47795977、chr2:47798612-47798658、chr2:47800355-47800407、chr2:47806534-47806558、chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489、chr2:189791856-189791868、chr2:189854456-189854497、chr2:189877284-189877298、chr2:5982845-5982871、chr2:5991989-5992032、chr2:6005894-6005938、chr10:87933035-87933086、chr10:87933124-87933183、chr10:87960993-87961048、chr18:51054783-51054797、chr18:51058154-51058204、chr18:51067085-51067078、chr19:1207007-1207038、chr19:1219351-1219462、chr19:1223130-1223160、chr17:7669616-7669662、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673788、chr17:7673736-7673831、chr17:7674183-7674253、chr17:7675053-7675108、chr17:7676214-7676245、ch10:97938720-ch10:94938771、ch10:94942196-ch10:94942266、ch10:94949247-ch10:94949282、ch16:55484117-55484159、ch16:55485699-55485770、ch16:55488596-55488662、ch16:55489754-55489820。本實(shí)施例中的引物對(duì)的設(shè)計(jì)和制備采用現(xiàn)有的常規(guī)方法。本實(shí)施例中的引物對(duì)包括特異性上游引物和特異性下游引物，上游引物和下游引物是根據(jù)所覆蓋的變異區(qū)域在參考基因組的起始和終止位置設(shè)計(jì)的。引物均由母液稀釋而成，母液由百力格生物技術(shù)有限公司合成的干粉稀釋而成，引物的最終濃度為100nM。引物純度應(yīng)達(dá)到PAGE或者HPLC級(jí)，不含雜帶。設(shè)計(jì)時(shí)所用核苷酸序列均來(lái)自NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的基因序列，引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物長(zhǎng)度主要集中在100bp-500bp之間。引物的核苷酸序列可為任意的已知序列，其序列自身不形成發(fā)卡二級(jí)結(jié)構(gòu)，且G、C含量占?jí)A基數(shù)量總和的30％～70％，引物序列選擇長(zhǎng)度18bp～25bp的核苷酸序列。使用專門(mén)的多重引物設(shè)計(jì)軟件包(如DNAsoftwares的VisualOMP,MultiPLX，ABI的PrimerExpress等)來(lái)設(shè)計(jì)引物，為了減少在核酸擴(kuò)增過(guò)程中假象例如引物二聚體的形成，引物對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)測(cè)在擴(kuò)增過(guò)程中顯示最小的與引物中其他引物的相互作用、各個(gè)引物對(duì)的Tm等參數(shù)盡量接近、不要存在嚴(yán)重的二級(jí)結(jié)構(gòu)比如發(fā)夾、dimers等。通過(guò)使用不同的軟件，綜合評(píng)價(jià)，將引物盡可能設(shè)計(jì)為靶特異性或者擴(kuò)增子特異性的，并且引物通常被分組為子集以使引物間相互作用、引物二聚體形成和超級(jí)擴(kuò)增子減少至最低程度。PCR的延伸是從引物3’端開(kāi)始的，并決定著PCR產(chǎn)物的特異性，而5’端則限定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度。5’端修飾后不但不影響正常的PCR反應(yīng)，而且修飾后的引物能夠更穩(wěn)定地與模板結(jié)合，對(duì)于PCR產(chǎn)物的分析與進(jìn)一步操作有很大的方便，在引物上進(jìn)行基團(tuán)修飾，引物所攜帶的修飾基團(tuán)隔離開(kāi)其他引物，使得同一反應(yīng)體系中，完成更多引物的同時(shí)擴(kuò)增。引物5’端修飾包括磷酸化修飾、氨基修飾和引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基，優(yōu)選地為5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。本實(shí)施例中設(shè)計(jì)的引物對(duì)是經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)篩選驗(yàn)證得到的最佳組合引物對(duì)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效、快速、微量建庫(kù)，保持了與現(xiàn)有建庫(kù)方法的文庫(kù)測(cè)序流程的兼容性，靈活方便，可以用于IonProton測(cè)序平臺(tái)，適于構(gòu)建IonProton的文庫(kù)，構(gòu)建文庫(kù)可以直接上機(jī)測(cè)序。本實(shí)施例中的引物對(duì)可以直接應(yīng)用到不同的第二代測(cè)序平臺(tái)，包括但不限于由Illumina，LifeTechnologies(ABI)，Roche，HelicosBiotechnologies，PacificBiosciences這些公司制造的儀器，同樣也適用于其它廠商生產(chǎn)的測(cè)序儀。二、引物對(duì)分組。由于擴(kuò)增的模板是固定的序列模板，設(shè)計(jì)引物時(shí)不可避免會(huì)有GC含量和Tm值不一致的引物對(duì)，為了順利構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，這些差別較大的引物對(duì)在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)條件和樣本的要求會(huì)更加嚴(yán)格，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一定立項(xiàng)。退火溫度是引物和模板結(jié)合時(shí)候的溫度參數(shù)，即當(dāng)50％的引物和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度，它是影響PCR特異性的比較重要因素，為了確定較適合的退火溫度，根據(jù)引物和產(chǎn)物的GC含量、退火溫度等相關(guān)參數(shù)計(jì)算的判斷參數(shù)R，從而更加方便準(zhǔn)確地將設(shè)計(jì)合成、稀釋后引物分成兩組。判斷參數(shù)R的計(jì)算公式如下：R＝0.1×[W1+Tm1/(Tm1+Tm2)]+0.9×[W2+Tm2/(Tm1+Tm2)]。其中，W1是擴(kuò)增產(chǎn)物的GC含量，Tm1是擴(kuò)增產(chǎn)物的退火溫度，W2是上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值，Tm2是上游引物退火溫度和下游引物退火溫度的平均值。W1、W2、Tm1、Tm2是設(shè)計(jì)引物核苷酸序列時(shí)，通過(guò)多重引物設(shè)計(jì)軟件包，自動(dòng)生成的參數(shù)。通過(guò)軟件包生成的參數(shù)代入，計(jì)算公式得到所有引物對(duì)的判斷參數(shù)R(R一般保留5位有效數(shù)字)，其中判斷參數(shù)R的值小于或等于1的引物對(duì)，歸為第一組引物混合液，判斷參數(shù)R的值大于1的引物對(duì)，歸為第二組引物混合液。以基因MUTYH為例，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到該基因的DNA序列(NG_008189.1)，找到DNA序列中檢測(cè)覆蓋區(qū)域：chr1：45329342-45329461、chr1：45331536-45331683、chr1：45332017-45332092、chr1：45332219-45332276、chr1：45332651-45332685、chr1：45332794-45332839、chr1：45333412-45333489；根據(jù)軟件PrimerExpress設(shè)計(jì)覆蓋目的區(qū)域的引物對(duì)，引物對(duì)盡可能設(shè)計(jì)為靶特異性并且與其他引物不相互干擾，設(shè)計(jì)后的引物核苷酸序列如表2所示。表2MUTYH引物序列表表2中的引物由百力格生物技術(shù)有限公司合成，合成引物的5’端引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基。根據(jù)判斷參數(shù)R的取值，序號(hào)為1至7的引物對(duì)均歸為第二組引物組合液。其他結(jié)直腸癌相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)和分組參照MUTYH基因，最終將設(shè)計(jì)檢測(cè)結(jié)直腸癌相關(guān)基因變異區(qū)域的所有引物對(duì)分組，引入脫氧次黃嘌呤核苷酸堿基的引物對(duì)分別合成稀釋后，按照分組的結(jié)果配置成第一組引物對(duì)組合液和第二組引物組合液。第一組引物對(duì)組合液和第二組引物組合液在初始擴(kuò)增分別進(jìn)行初始擴(kuò)增反應(yīng)，能夠增加每個(gè)反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的總體產(chǎn)物率，然后在引物清除步驟再將擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合在一起進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。三、待測(cè)樣品DNA抽提純化。本實(shí)施例中檢測(cè)5例攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和多態(tài)位點(diǎn)的樣本和5例不攜帶結(jié)直腸癌易感基因突變和突變位點(diǎn)的樣本，這10例樣本的相關(guān)位點(diǎn)已經(jīng)經(jīng)過(guò)ARMS驗(yàn)證。本發(fā)明中的檢測(cè)樣本為能提取核酸的任意形式的樣品，較佳地為口腔粘膜，包括但不限于：全血、血清、血漿和組織樣品；組織樣品包括但不限于：石蠟包埋組織、新鮮組織和冰凍切片。3.1樣本DNA抽提采用北京索萊寶口腔、咽拭子DNA提取試劑盒(50T，貨號(hào)：D3300)提取口腔粘膜的樣本DNA，，具體的操作參見(jiàn)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。抽提結(jié)束后用Thermo-Fisher核酸蛋白定量?jī)x(NanoDrop2000)測(cè)定樣本濃度。3.2DNA純化1)取5ngDNA，加入Nuclease-freeWater至40μL；2)加入1.5倍體積(60μL)Ampurebeads，室溫放置5min，再放置于磁力架上約5min，至澄清；3)棄上清，用75％的酒精(200μL，現(xiàn)配現(xiàn)用)洗滌2次，晾干(不要過(guò)干)；4)用25μLNuclease-freeWater溶解，Qubit檢測(cè)濃度。3.3組織樣本DNA濃度測(cè)定采用3.0對(duì)抽提后的DNA濃度測(cè)定：1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄1ul工作液，加入1ul的DNA樣本，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點(diǎn)擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點(diǎn)擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:1ul，此時(shí)顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個(gè)樣本：取出Qubit3.0熒光光度計(jì)中樣本。四、獲得目標(biāo)片段。分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液對(duì)純化后的樣品進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增得到目標(biāo)片段，然后清除引物。4.1初始PCR擴(kuò)增由于初始PCR擴(kuò)增是多重PCR反應(yīng)，每一個(gè)引物對(duì)在擴(kuò)增反應(yīng)中與另外的引物競(jìng)爭(zhēng)有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對(duì)改進(jìn)的方法和組合物需要，以允許選擇性擴(kuò)增一群核酸分子內(nèi)的多個(gè)靶核酸分子，同時(shí)避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的程度降至最低，達(dá)到更高效、低濃度檢測(cè)。本發(fā)明在反應(yīng)體系中加入有機(jī)試劑，有機(jī)試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優(yōu)選地，在初始擴(kuò)增加入的有機(jī)試劑為DMSO(二甲基亞砜)。采用本實(shí)施例的第一組引物組合液和第二組引物組合液，若樣本的濃度大于10ng，可以將第一組引物組合液和第二組引物組合液混合在一起對(duì)樣本進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增。若樣本的濃度小于10ng，必須分別采用第一組引物組合液和第二組引物組合液進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增，以保證文庫(kù)的質(zhì)量，下面以樣本的濃度小于10ng為例。按照表3中的初始PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行試劑配比。表3初始PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系成分反應(yīng)體系分為兩管，一管反應(yīng)體系采用第一組引物組合液，另一管反應(yīng)體系采用第二組引物組合液，其他成分相同。在反應(yīng)體系中加入少量的二甲基亞砜(DMSO)，能夠降低熔解溫度，有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過(guò)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)，提高引物特異性，有效促進(jìn)GC含量高達(dá)52％～73％模板的擴(kuò)增，使用低濃度的引物，少量循環(huán)，使得引物間互不干擾。分兩管分別進(jìn)行初始PCR擴(kuò)增反應(yīng)得到目標(biāo)片段(目標(biāo)區(qū)域測(cè)序目的片段)，采用第一組引物組合液的擴(kuò)增反應(yīng)程序如表4所示，采用第二組引物組合液的擴(kuò)增反應(yīng)程序如表5所示。表4采用第一組引物組合液的擴(kuò)增反應(yīng)程序表5采用第二組引物組合液的擴(kuò)增反應(yīng)程序PCR反應(yīng)條件：特異引物與靶序列退火延伸，選擇較高的復(fù)性溫度以減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,確保PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間略微延長(zhǎng),以使引物與模板之間完全結(jié)合，但是延伸時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),否則會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。4.2引物清除在兩管擴(kuò)增反應(yīng)分別獲得目標(biāo)片段后，不同的擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域產(chǎn)物再混合在同一個(gè)反應(yīng)體系中，進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建步驟，降低了樣品檢測(cè)的要求，提高測(cè)序反應(yīng)的效率。將兩管初始PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物等體積混合成一管，取20ul的PCR產(chǎn)物混合物，加入2ulFuPaReagent，此時(shí)總體積為22μL，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒，根據(jù)表6的程序清除引物。表6引物清除反應(yīng)程序PCR產(chǎn)物可立即使用或保存于-20℃冰箱。五、獲得接頭片段。對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行接頭連接得到帶接頭片段，然后采用磁珠進(jìn)行純化。5.1接頭反應(yīng)拿出SwitchSolution，室溫混勻，將清除引物后的目標(biāo)片段置于樣品管中，漩渦充分混勻，瞬間離心2秒,取2ul加入如表7所示的接頭反應(yīng)體系中。表7接頭反應(yīng)體系成分表將上述反應(yīng)體系放入PCR儀內(nèi)，進(jìn)行引物清除，反應(yīng)程序如表8所示。表8接頭反應(yīng)程序表Barcode為合成的單鏈，其中所述隨機(jī)序列有6～12個(gè)堿基隨機(jī)組成且位于靠近單鏈游離DNA3’端的一側(cè)，所述Adaptor序列為任意的已知序列且位于遠(yuǎn)離單鏈游離DNA3’端的一側(cè)，兩種試劑均由LifeTechnologies提供。通過(guò)連接反應(yīng)，獲得各連接唯一標(biāo)簽序列的核酸樣本，樣品可立即使用或保存于-20℃冰箱。5.2純化，采用AmpureXPReagent磁珠：1)向樣品管中加入45μL(1.5倍樣品體積)AmpureXPReagent，混勻，室溫孵育5min；2)將樣品管放在磁力架上，靜置2min，至管內(nèi)溶液完全澄清；3)棄上清，保持離心管在磁力架上，溫和添加150μL70％酒精(現(xiàn)配現(xiàn)用)洗滌beads(輕輕旋轉(zhuǎn)樣品管，充分洗滌)；4)重復(fù)上述步驟，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過(guò)干)。5.3測(cè)定樣本庫(kù)的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點(diǎn)擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點(diǎn)擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時(shí)顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個(gè)樣品：取出Qubit3.0熒光光度計(jì)中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSsmple”；8)重復(fù)樣本讀數(shù)，直到所有樣品讀完。六、文庫(kù)擴(kuò)增和純化6.1文庫(kù)擴(kuò)增由于文庫(kù)構(gòu)建是多重PCR反應(yīng)，每一個(gè)引物對(duì)在擴(kuò)增反應(yīng)中與另外的引物競(jìng)爭(zhēng)有限量的dNTPs、聚合酶和其他試劑，因此存在對(duì)改進(jìn)的方法和組合物需要，以允許選擇性擴(kuò)增一群核酸分子內(nèi)的多個(gè)靶核酸分子，同時(shí)避免非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的形成，或者將非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體的程度降至最低，達(dá)到更高效、低濃度檢測(cè)。本發(fā)明在反應(yīng)體系中加入有機(jī)試劑，有機(jī)試劑包括甘油、橄欖油、DMSO(二甲基亞砜)，優(yōu)選地，在文庫(kù)擴(kuò)增加入的有機(jī)試劑為甘油。向純化后風(fēng)干的樣品中加入50μLPlatinumPCRSuperMixHighFidelity(黑色蓋)、3.5ul甘油和2ul的第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液,重懸磁珠混勻，磁力架上放置3min，取上清至PCR管中，漩渦混勻進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)程序如表9所示。表9文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)程序表甘油能夠提高文庫(kù)產(chǎn)量，有利于擴(kuò)增后上機(jī)測(cè)序，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物可立即使用或保存于-20℃冰箱。6.2文庫(kù)純化文庫(kù)進(jìn)行磁珠純化，采用AMPureXPReagent磁珠：1)將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)，加入25ul(0.5倍樣品體積)AMPureXPReagent充分吹打混勻，室溫孵育5min；2)將樣本放置磁力架上，等待5min至管內(nèi)溶液完全澄清；4)小心吸取上清液并轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管內(nèi)；5)向上述步驟的離心管中加入60ul(1.2倍原始樣品體積)的AMPureXPReagent磁珠，吹打混勻，室溫孵育5min；6)將樣本管放在磁力架上靜止3min或至溶液澄清，棄上清；7)保持離心管在磁力架上，溫和添加150ul新鮮配制的75％酒精溶液洗滌beads(輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)樣品管，充分洗滌)，旋轉(zhuǎn)離心管，小心去除酒精；8)重復(fù)上述步驟清洗一次，充分去除酒精，晾干(磁力架上晾干，不要過(guò)干)，室溫風(fēng)干磁珠5min，不要過(guò)度干燥；9)將樣品管從磁力架上取下，加入50μLLowTE溶液到樣本管內(nèi)，漩渦混勻；10)將樣本管放置在磁力架上，靜止2min，將洗脫的上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管內(nèi)，用Qubit檢測(cè)樣品濃度；6.3用3.0測(cè)定樣本庫(kù)的濃度1)向樣本管加入1ulQubitdsDNAHSReagent和199ulQubitdsDNAHSbuffer,漩渦混勻4s；2)向已添加工作液的樣品管內(nèi)吸棄3ul工作液，加入3ul的DNA樣品，漩渦混勻4s，每管的最終體積是200ul；3)所有管在室溫避光孵育2分鐘；4)在3.0主屏上點(diǎn)擊“DNA”鍵，然后選擇dsDNAHighSensitivity分析模式；5)把樣本管放入3.0中，蓋上蓋子，點(diǎn)擊read；6)選擇CalculateInitial初始濃度，然后選擇VolumeofSampleUsed:3ul，此時(shí)顯示的結(jié)果為樣本初始濃度，單位ng/ul；7)讀取下一個(gè)樣品：取出Qubit3.0熒光光度計(jì)中樣品，放入新的樣品，按“ReadNextSample”；8)重復(fù)樣本讀數(shù)，直到所有樣品讀完；純化后的文庫(kù)可直接通過(guò)IonTorrent平臺(tái)進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序結(jié)束以后，對(duì)獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)比對(duì)設(shè)計(jì)的引物和位點(diǎn)信息，篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)基因上的突變和多態(tài)位點(diǎn)。本發(fā)明的檢測(cè)結(jié)果與臨床ARMS法檢測(cè)結(jié)果一致，測(cè)序反應(yīng)樣本的數(shù)量分布均勻。本發(fā)明對(duì)結(jié)直腸癌易感基因變異具有檢測(cè)通量高、特異性強(qiáng)、不易污染、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果具有較好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，對(duì)結(jié)直腸癌易感人群提供預(yù)防指南。。本發(fā)明實(shí)施方式中，所述的基因變異存在于結(jié)直腸癌但不僅限于如表1列出的結(jié)直腸癌相關(guān)基因，也存在常見(jiàn)胃癌、肝癌、乳腺癌、食管癌等相關(guān)基因。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本發(fā)明所限定的范圍。發(fā)明人經(jīng)深入研究和篩選得到一組可以用于IonProton的文庫(kù)，構(gòu)建的文庫(kù)可以直接可以上機(jī)測(cè)序。為了降低對(duì)組織樣本濃度和質(zhì)量的要求，提高測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的成功率，本發(fā)明進(jìn)行了以下嘗試1)采用1ng、3ng、5ng、7ng、9ng的口腔粘膜抽提DNA樣本，根據(jù)常用的退火溫度55℃進(jìn)行初始濃度擴(kuò)增，對(duì)文庫(kù)擴(kuò)增使用60℃退火溫度，測(cè)得文庫(kù)的濃度均低于0.5ng/ul。對(duì)初始擴(kuò)增和文庫(kù)擴(kuò)增的退火溫度進(jìn)行50℃～65℃的梯度實(shí)驗(yàn)，文庫(kù)的成功率仍然很低；2)根據(jù)軟件設(shè)計(jì)引物參數(shù)對(duì)引物對(duì)進(jìn)行分組，分組以50％為界，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值小于等于50％為第一組引物組合物，上游引物GC含量和下游引物GC含量的平均值大于50％為第二組引物組合物，第一組引物組合物采用的50℃退火溫度進(jìn)行初始濃度擴(kuò)增，文庫(kù)擴(kuò)增使用60℃退火溫度，第二組引物組合物采用的60℃退火溫度進(jìn)行初始濃度擴(kuò)增，文庫(kù)擴(kuò)增使用60℃退火溫度，相對(duì)于初始擴(kuò)增不分管擴(kuò)增，文庫(kù)的成功率雖然有所提高，但是低于50％；3)退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素，良好的退火溫度，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜，退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成，還有模板序列組成和長(zhǎng)度。本發(fā)明綜合考慮了引物和產(chǎn)物的GC含量和退火溫度參數(shù)對(duì)PCR反應(yīng)的影響，設(shè)計(jì)了分管判斷參數(shù)R，根據(jù)判斷參數(shù)R對(duì)引物對(duì)分組，在初始擴(kuò)增和文庫(kù)擴(kuò)增的退火溫度進(jìn)行50℃～65℃的梯度試驗(yàn)，選擇文庫(kù)成功率較高的退火溫度，最終優(yōu)選第一組引物組合液初始擴(kuò)增的退火溫度為55℃，第二組引物組合液初始擴(kuò)增的退火溫度為65℃，第一組引物組合液和第二組引物組合液的混合液在文庫(kù)擴(kuò)增的退火溫度為62℃，文庫(kù)構(gòu)建成功率大幅度提升，特別適用于文庫(kù)起始量低至1ng～10ng的情況。上述實(shí)施例僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3