本發(fā)明涉及一種實驗室用方法，具體而言，是一種細(xì)胞囊泡快速標(biāo)記裝置及方法，該裝置簡單，方法高效，可進(jìn)行實時觀察記錄和實驗。

背景技術(shù)：

細(xì)胞囊泡形態(tài)和動態(tài)變化的研究首先需要對囊泡進(jìn)行熒光標(biāo)記。目前，常用的標(biāo)記辦法是，用一定濃度的熒光染料進(jìn)行細(xì)胞外孵育，待標(biāo)記上后將胞外的染料進(jìn)行洗脫，然后到顯微鏡下進(jìn)行動態(tài)觀察并記錄，從標(biāo)記、到洗脫、再到轉(zhuǎn)移到顯微鏡下觀察記錄，這個過程通常需要10-30分鐘的時間。然而，很多類型的囊泡動態(tài)變化過程非常短暫，在洗脫和轉(zhuǎn)移的過程中就已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化，而這個時間的變化過程是無法被觀察和記錄的。因此，本發(fā)明在現(xiàn)有標(biāo)記方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，利用一種氣壓作用于微型電極釋放微量標(biāo)記染料的裝置，并利用染料在液體中快速擴(kuò)散的現(xiàn)象，節(jié)省了洗脫和轉(zhuǎn)移的時間，獲得了一種能快速有效標(biāo)記、并能實時觀察記錄的囊泡標(biāo)記方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新型的快速有效標(biāo)記、并能實時觀察記錄的細(xì)胞囊泡標(biāo)記裝置及方法。

本發(fā)明的細(xì)胞囊泡快速標(biāo)記裝置，包括熒光顯微鏡、顯微鏡專用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)、玻璃微電極、壓力控制器、電刺激器和氣瓶，氣瓶(壓縮空氣或氮氣)與壓力控制器連接，壓力控制器輸出端通過氣管連接玻璃微電極尾端，電刺激器與壓力控制器相連用于控制壓力控制器的氣壓輸出頻率和時長，玻璃微電極內(nèi)灌有囊泡標(biāo)記染料，用于對置于顯微鏡專用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上的細(xì)胞囊泡進(jìn)行標(biāo)記，熒光顯微鏡進(jìn)行實時觀測。

作為優(yōu)選，所述的玻璃微電極尖端可以為2μm，外徑1mm，內(nèi)徑0.5mm。

采用本發(fā)明裝置進(jìn)行細(xì)胞囊泡快速標(biāo)記的方法，包括如下步驟：

在玻璃微電極內(nèi)灌入細(xì)胞囊泡相應(yīng)的囊泡標(biāo)記染料，消除氣泡，染料灌入量為玻璃微電極2/3長度；

將氣瓶(壓縮空氣或氮氣)連接到壓力控制器上，調(diào)節(jié)輸出氣壓(通常調(diào)至3psi)，將玻璃微電極尾端通過氣管與壓力控制器輸出端連接；

連接電刺激器和壓力控制器，通過設(shè)置電刺激器的參數(shù)來控制壓力控制器的氣壓輸出頻率和時長；

在顯微鏡專用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上對細(xì)胞囊泡進(jìn)行標(biāo)記，熒光顯微鏡進(jìn)行實時標(biāo)記觀測。

采用本發(fā)明的方法完成標(biāo)記后，停止給氣，染料濃度會因擴(kuò)散作用迅速降低，無需洗脫可以直接進(jìn)行囊泡動態(tài)變化的后續(xù)觀察。

本發(fā)明有如下特點：1)標(biāo)記精度高，可針對指定的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記；2)標(biāo)記過程可以精確控制；3)標(biāo)記后無需洗脫即可進(jìn)行觀察和記錄；4)整個過程在顯微鏡下實施，標(biāo)記過程可實時記錄；5)可以實現(xiàn)同步藥物刺激。因此，本發(fā)明的裝置及方法可快速有效標(biāo)記、并能實時觀察記錄。

附圖說明

圖1囊泡標(biāo)記裝置示意圖。

圖2玻璃微電極顯微圖，尖端直徑約為2μm，圖解比例尺：5μm。

圖3通過微電極釋放的染料sulforhodamine101(sr101)擴(kuò)散特性。圖3(a)熒光強(qiáng)度檢測示意圖，不同顏色的同心圓分別代表距離電極尖端不同距離的位置(同心圓半徑分別為15μm，50μm，100μm，150μm，200μm，250μm)，圖解比例尺，50μm。圖3(b)sr101熒光強(qiáng)度定量分析，所有數(shù)據(jù)以15μm處的熒光強(qiáng)度值為基準(zhǔn)做歸一化處理。圖3(c)電極尖端300μm范圍內(nèi)熒光染料sr101在不同時間的擴(kuò)散分布圖，x和y坐標(biāo)軸示意以電極尖端為原點的位置。sr101在5min左右即達(dá)到穩(wěn)定分布狀態(tài)，并在30min內(nèi)保持該穩(wěn)定狀態(tài)。

圖4小膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的囊泡可以用胞飲泡的標(biāo)記物dextran染色，圖中分別用alexafluor488dextran(3000mw,1μg/μl；綠色，af3k)和texasreddextran(70,000mw，1μg/μl；紅色，tr70k)對胞飲泡進(jìn)行了標(biāo)記，圖解比例尺：10μm。

圖5胞飲泡在小膠質(zhì)細(xì)胞遷移過程中的動態(tài)變化。圖5(a)-(c)胞飲泡不同類型的動態(tài)變化。圖5(a)箭頭指示從胞飲泡中分裂出來的小囊泡，圖5(b)和圖5(c)中的紅色和綠色箭頭指示先后形成的兩個胞飲泡之間的相互作用，圖5(c)中的白色和黃色箭頭指示囊泡形成后成熟變小的過程，圖解比例尺：10μm。圖5(d)胞飲泡進(jìn)入小膠質(zhì)細(xì)胞后的面積動態(tài)變化統(tǒng)計結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明所涉及的方法作進(jìn)一步說明。

本發(fā)明提出了一種新型的囊泡標(biāo)記方法及裝置，該方法是采用一種用于膜片鉗實驗的玻璃微電極，通過一定頻率和壓力的氣體，將微電極中的染料均勻地釋放到細(xì)胞周圍，形成穩(wěn)定的染料濃度，從而實現(xiàn)對特定的囊泡進(jìn)行標(biāo)記。

如附圖1所示，實現(xiàn)該方法的裝置由激光共聚焦顯微鏡(型號：fv1000，日本olympus公司)、顯微鏡專用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(型號：inu-zilcs-f1，日本tokaihit公司)，玻璃微電極(外徑1mm，內(nèi)徑0.5mm，貨號bf100-50-15，美國sutterinstrument公司)、壓力控制器(型號：picospritzeriii，美國parker公司)、電刺激器(型號：sen-7103，日本nihonkohden公司)和氣瓶組成。玻璃微電極由微電極拉制儀(型號：p-97，美國sutterinstrument公司)制備，尖端直徑約為2μm，如圖2所示。在玻璃微電極內(nèi)灌入相應(yīng)囊泡標(biāo)記染料，約2/3長度即可，注意消除氣泡。首先，將氣瓶(壓縮空氣或氮氣)連接到壓力控制器上，調(diào)節(jié)輸出氣壓(一般為3psi)，將玻璃微電極通過氣管與壓力控制器連接；其次，連接電刺激器和壓力控制器，通過設(shè)置電刺激器的參數(shù)來控制壓力控制器的氣壓輸出頻率和時長，以控制玻璃微電極中囊泡標(biāo)記染料的釋放速度。完成標(biāo)記后，停止給氣，染料濃度會因擴(kuò)散作用迅速降低，無需洗脫可以直接進(jìn)行囊泡動態(tài)變化的后續(xù)觀察。

標(biāo)記過程在顯微鏡專用活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)上實施，保證培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)co2濃度為5％、溫度控制在37℃左右，儀器穩(wěn)定后，設(shè)置激光共聚焦顯微鏡拍攝參數(shù)，每隔一定時間拍攝一張圖片，整個過程都可以實現(xiàn)實時活細(xì)胞熒光觀察和記錄。

此外還可以利用另一個玻璃微電極，對細(xì)胞進(jìn)行特定藥物的刺激。

本發(fā)明的裝置可用于將貼壁在玻片上的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的小室內(nèi)，內(nèi)含l15培養(yǎng)液或ecs，上面蓋一層甲基硅油以維持穩(wěn)定的溫度和滲透壓，通過玻璃微電極釋放染料和刺激分子，形成的穩(wěn)定濃度梯度，誘導(dǎo)細(xì)胞的形成囊泡并被標(biāo)記。無需洗脫，可以快速有效地實現(xiàn)對細(xì)胞囊泡的標(biāo)記，可極大地提高實驗效率，對生物實驗具有重大意義。

下面以小膠質(zhì)細(xì)胞胞飲泡的快速標(biāo)記及記錄方法作為具體實例進(jìn)行說明：

原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及純化

1)準(zhǔn)備工作：準(zhǔn)備好預(yù)鋪pdl的75-cm²flask，并用無菌雙蒸水清洗；用酒精棉球擦拭手術(shù)器械；準(zhǔn)備冰盒，hbss(4℃預(yù)冷)，mem(含10％(vol/vol)fbs)培養(yǎng)液和胰酶(37℃預(yù)熱)。

2)取新生sd大鼠(p0-2)，全身噴灑消毒酒精，用斷頭法獲得大鼠頭部。

3)在超凈臺中，用眼科剪沿顱骨中線分別剪開頭皮和顱骨，用眼科鑷剝開頭骨，小心取出大腦，迅速轉(zhuǎn)移到含預(yù)冷hbss的35-mm培養(yǎng)皿(置于冰盒上)中。

4)在解剖鏡下，用系結(jié)鑷分離左右腦半球，去除腦膜，去除殘余的血竇和血管組織，去除核團(tuán)和海馬，僅留皮層。

5)用鑷子將皮層剪成2-mm³的小塊，將皮層碎片轉(zhuǎn)移到含有0.25％胰酶的1.5-mlep管中(每兩個皮層用0.6ml胰酶)，37℃消化12min。

6)用mem(含10％fbs)終止消化反應(yīng)，在玻璃管中用5-ml移液器用力吹打約25次后，靜置5min，等待組織塊沉淀，收集上清，4℃下500g離心5min。

7)棄上清，將細(xì)胞沉淀用mem(含10％fbs)重懸，接種于前面準(zhǔn)備好的flask中(每個flask種植約2個皮層的細(xì)胞量)，每個flask中的培養(yǎng)液為10-15ml。

8)將細(xì)胞放在37℃培養(yǎng)箱中(95％空氣/5％co2)培養(yǎng)，第二天全換液，之后每隔三天半換液。

9)培養(yǎng)6-8天后小膠質(zhì)細(xì)胞成熟，此時，在相差顯微鏡下觀察，星形膠質(zhì)細(xì)胞鋪滿瓶底，呈平滑絲綢狀，上層可見圓形飽滿、明亮、貼壁性弱的細(xì)胞，部分已經(jīng)懸浮在培養(yǎng)液中，這些細(xì)胞大部分被鑒定為小膠質(zhì)細(xì)胞；輕輕的搖動flask使細(xì)胞脫落，收集上清，4℃下500g離心5min。

10)棄上清，用3-4mlmem(含10％fbs)重懸，種于8×8mm蓋片上，每玻片約50μl懸液，細(xì)胞密度約為4×10⁴cells/cm²。

11)將玻片放在37℃培養(yǎng)箱中(95％空氣/5％co2)靜置15min，使細(xì)胞貼壁，然后用mem(含10％fbs)洗去未貼壁的細(xì)胞，并加入新鮮的mem(含10％fbs)，置于37℃培養(yǎng)箱中待用，放置時間不超過2天。

本文中的小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法參考了nakajima的方法，并略作修改。前期準(zhǔn)備和培養(yǎng)過程大概需要一周的時間，通過這種方法可以獲得高純度的小膠質(zhì)細(xì)胞，通過免疫染色的方法驗證，其純度可高于95％。

囊泡標(biāo)記及動態(tài)分析

1)利用顯微鏡專用的co2活細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，維持穩(wěn)定的細(xì)胞狀態(tài)，約30min可以使體系溫度達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

2)連接壓力給藥系統(tǒng)，設(shè)置壓力輸出參數(shù)(見圖1)。

3)在微電極內(nèi)灌入用于誘導(dǎo)胞飲泡的atpγs(1mm)和標(biāo)記胞飲泡的染料dextran(1μg/μl)，約2/3長度即可，注意消除氣泡。

4)將步驟1中純化得到的小膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有1.5ml培養(yǎng)液的chamber上，上面蓋一層甲基硅油，以維持實驗過程中溫度和滲透壓的穩(wěn)定。

5)用顯微操縱器將微電極移到細(xì)胞層上面，電極尖端位于視野的中間。

6)在60倍水鏡下用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行dic和熒光通道時間序列成像，圖像尺寸1024×1024pixels，時間間隔20sec，成像開始時同時打開壓力給藥系統(tǒng)，作用10min后細(xì)胞基本標(biāo)記上dextran，停止壓力給藥系統(tǒng)，染料因擴(kuò)散作用迅速稀釋，無需洗脫，此過程連續(xù)成像直到實驗結(jié)束，總時間30-50min(如圖4和圖5)。

7)獲取圖像后，用imagej和imaris等軟件對小膠質(zhì)細(xì)胞胞飲泡的動態(tài)變化過程進(jìn)行追蹤和分析(如圖5)。